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Neuroscience

वयस्क माउस मस्तिष्क में प्रेरक फ्लोरोसेंटली-लेबल स्टेम सेल की वंशावली अनुरेखण

Published: May 20, 2022 doi: 10.3791/63998
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1Graduate School of Biomedical Science and Engineering, University of Maine, 2Department of Neurosurgery, Ohio State University Wexner Medical Center, 3Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

Summary

एक प्रेरक ट्रांसजेनिक वंश अनुरेखण माउस लाइन का उपयोग करके फ्लोरोफोर के साथ स्टेम कोशिकाओं और उनकी संतानों को स्थायी रूप से चिह्नित करने की क्षमता विवो में सक्रियण, प्रसार, प्रवास और / या भेदभाव के स्थानिक और अस्थायी विश्लेषण की अनुमति देती है। वंश अनुरेखण वंश प्रतिबद्धता, हस्तक्षेप (ओं) की प्रतिक्रिया और मल्टीपोटेंसी के बारे में उपन्यास जानकारी प्रकट कर सकता है।

Abstract

टर्ट प्रमोटर से जुड़े एक उपन्यास रिवर्स टेट्रासाइक्लिन ट्रांसएक्टिवेटर (आरटीटीए) ट्रांसजीन के साथ 'टेट-ऑन' सिस्टम ओटेट-क्रे माउस को पार करके वयस्क ऊतक स्टेम कोशिकाओं के व्यवहार और भाग्य की जांच करने के लिए एक टेलोमेरेज़ रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (टर्ट) वंश-अनुरेखण माउस लाइन विकसित की गई थी, जिसे हमने वयस्क मस्तिष्क स्टेम कोशिकाओं की एक उपन्यास आबादी के निशान का प्रदर्शन किया है। यहां, टेट्रासाइक्लिन व्युत्पन्न डॉक्सीसाइक्लिन का प्रशासन एमटीईआरटी-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे चूहों को अमिट रूप से कोशिकाओं की आबादी को चिह्नित करेगा जो जीन टर्ट के प्रमोटर क्षेत्र के 4.4 केबी टुकड़े को व्यक्त करते हैं। जब रोजा-एमटीएमजी रिपोर्टर को जोड़ा जाता है, तो एमटीर्ट-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी चूहे झिल्ली टीडीटोमैटो (एमटोमैटो) व्यक्त करेंगे जब तक कि डॉक्सीसाइक्लिन उपचार कोशिकाओं में झिल्ली ईजीएफपी (एमजीएफपी) के साथ एमटीमैटो अभिव्यक्ति के प्रतिस्थापन को प्रेरित नहीं करता है जो टर्ट को भी व्यक्त करते हैं। इसलिए, जब इन ट्रिपल-ट्रांसजेनिक वंश अनुरेखण चूहों को डॉक्सीसाइक्लिन ("पल्स" अवधि जिसके दौरान टीईआरटी व्यक्त कोशिकाओं को चिह्नित किया जाता है) प्राप्त होता है, तो ये कोशिकाएं अमिट रूप से चिह्नित एमजीएफपी + कोशिकाएं बन जाएंगी, जिन्हें डॉक्सीसाइक्लिन हटाने ("पीछा" अवधि) के बाद किसी भी वांछनीय समय के लिए ट्रैक किया जा सकता है, भले ही टर्ट अभिव्यक्ति बाद में खो गई हो। मस्तिष्क को तब छिड़काव-तय किया जाता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस और अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए संसाधित किया जाता है ताकि स्टेम सेल सक्रियण, प्रसार, वंश प्रतिबद्धता, विभिन्न मस्तिष्क निचे में प्रवास, और परिपक्व सेल प्रकारों के लिए भेदभाव में परिवर्तन की व्याख्या की जा सके। इस प्रणाली का उपयोग करके, स्टेम कोशिकाओं के मार्करों का उपयोग करके डॉक्सीसाइक्लिन-प्रेरक "पल्स-चेस" वंश अनुरेखण प्रयोगों का संचालन करने के लिए किसी भी आरटीटीए माउस को ओटेट-क्रे और रोजा रिपोर्टर से जोड़ा जा सकता है।

Introduction

वंश अनुरेखण माउस लाइन का मान
विवो में स्टेम कोशिकाओं का विश्लेषण मुश्किल हो सकता है क्योंकि कई परख जो ऐसी कोशिकाओं की जांच करते हैं, केवल जानवर की मृत्यु के समय इन कोशिकाओं को चिह्नित करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो समय में टर्मिनल स्नैपशॉट का प्रतिनिधित्व करता है। समय के साथ पूर्वज, मध्यवर्ती / संक्रमण कोशिका प्रकार, और परिपक्व कोशिकाओं के प्रसार, भेदभाव और प्रवास की प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए, एक अनुदैर्ध्य विश्लेषण दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। यह वंश अनुरेखण अध्ययनों के साथ प्राप्त किया जा सकता है जिससे स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं को अमिट रूप से चिह्नित किया जाता है और बाद में किसी भी समय के लिए पालन किया जा सकता है1.

वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क में, न्यूरोजेनेसिस की प्रक्रिया जिसके द्वारा वयस्क जन्मे न्यूरॉन्स स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं से बनाए जाते हैं, का विश्लेषण पहली बार थाइमिडीन-एच 3 2,3,4 या 5-ब्रोमो -2'-डीऑक्सीयूरिडीन (बीआरडीयू) 5,6,7,8 के साथ लेबल प्रतिधारण के माध्यम से किया गया था . इन अध्ययनों में, प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को थाइमिन एनालॉग के साथ चिह्नित किया गया था, जिसे प्रतिकृति और कोशिका विभाजन / प्रसार के दौरान कोशिकाओं के डीएनए में शामिल किया गया था। चिह्नित सेल, साथ ही साथ उनकी संतान, इसलिए इस एनालॉग को निहित करती थी, जिसे तब पोस्टमार्टम की पहचान की गई थी। हालांकि, जबकि थाइमिडीन-एच3 और बीआरडीयू ने मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं और उनकी संतानों के अंकन की अनुमति दी, जहां स्टेम कोशिकाओं को खराब समझा गया था, इन अध्ययनों को इन उपकरणों के डाउनसाइड्स द्वारा बाधित किया गया था। थाइमिडीन-एच3 कोशिका-चक्र गिरफ्तारी, एपोप्टोसिस और खुराक-निर्भर डीएनए संश्लेषण निषेध9 को प्रेरित करता है, जबकि बीआरडीयू प्रशासन 10 के मार्ग के आधार पर अलग-अलगस्तरों पर कोशिकाओं को चिह्नित करता है और मरम्मत या एपोप्टोसिस के दौरान कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है, साथ ही साथ कोशिका विभाजन11 के दौरान भी। हाल ही में अधिक कुशल लेबलिंग विधियों का उपयोग किया गया है, जैसे कि 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू) के साथ लेबलिंग, लेकिन बीआरडीयू के समान कई मुद्दे अभी भी12 बने हुए हैं। ये दृष्टिकोण भी सीमित हैं कि वे किसी भी प्रोलिफेरेटिव सेल को चिह्नित करते हैं, न केवल स्टेम सेल, और इस प्रकार परिणामों की व्याख्या को भ्रमित किया जा सकता है। न्यूरोजेनिक वंश में, सभी स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं माइटोटिक क्षमता को बनाए रखती हैं, और केवल टर्मिनल / एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया के लिए, लेकिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स नहीं, प्रसार अनिश्चित काल तक 13,14,15 बनाए रखा जाता है।

ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग केवल उन कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया जाता है जो ब्याज के प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, जैसे कि वयस्क स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने की पुष्टि की जाती है जैसा कि हम यहां उपयोग करते हैं, इसलिए स्टेम कोशिकाओं और उनकी संतानों की जांच करते समय अधिक आम हो गए हैं। जबकि माउस ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के माध्यम से उत्पन्न करना मुश्किल है, वंश-अनुरेखण माउस लाइनें मस्तिष्क में विशेष रूप से चिह्नित कोशिकाओं के अनुरेखण की अनुमति देती हैं, और अकेले प्रसार पर भरोसा नहीं करती हैं। टेट-ऑन ट्रांसजेनिक माउस सिस्टम में, टेट्रासाइक्लिन या डॉक्सीसाइक्लिन (एक टेट्रासाइक्लिन व्युत्पन्न) का प्रशासन कोशिकाओं में क्रे-रीकॉम्बिनेज अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है जिन्हें रिवर्स टेट्रासाइक्लिन ट्रांसएक्टिवेटर (आरटीटीए) के साथ इंजीनियर किया गया है, जिसे ब्याज के प्रमोटर द्वारा स्थानांतरित किया गया है। टेट-इंड्यूसिबल क्रे-संचालित पुनर्संयोजन तब ब्याज की कोशिकाओं में एक अमिट फ्लोरोसेंट या ल्यूमिनेसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सक्रिय करेगा, जो रोजा-रिपोर्टर माउस पर निर्भर करता है। ये अमिट रूप से चिह्नित कोशिकाएं विभाजन, भेदभाव या प्रवास के बाद इस रिपोर्टर को व्यक्त करना जारी रखती हैं, जिससे समय के साथ या विभिन्न हस्तक्षेपों के बाद इन कोशिकाओं और उनकी संतानों की ट्रैकिंग की अनुमति मिलतीहै 16. ट्रांसजेनिक वंश-अनुरेखण दृष्टिकोणों के फायदों में शामिल हैं: 1) आरटीटीए द्वारा चिह्नित एक विशेष सेल वंश या पूर्वज / स्टेम सेल के अनुरेखण की विशिष्टता, 2) सेल टर्नओवर या भेदभाव के बावजूद फ्लोरोसेंट या ल्यूमिनेसेंट प्रोटीन की अमिट अभिव्यक्ति, 3) कम विषाक्तता, 4) जानवर के जीवन चक्र में किसी भी बिंदु के दौरान सशर्त सक्रियण, और 5) सामान्य परख के साथ उपयोग में आसानी, इम्यूनोस्टेनिंग/इम्यूनोफ्लोरेसेंस सहित16.

चूहों में अस्थायी रूप से प्रेरक रिपोर्टर टूल के अन्य तरीकों में क्रे-ईआरटी 2 चूहों का उपयोग शामिल है, जिसे आरओएसए-जीएफपी, आरओएसए-एमटीएमजी या अन्य फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ट्रांसजीन के साथ जोड़ा जा सकता है। इन जानवरों में, एक सेल-विशिष्ट नियामक तत्व, जैसे कि ब्याज का प्रमोटर या एन्हांसर क्षेत्र, क्रे रीकॉम्बिनेज के उत्पादन को चलाता है, जिसे केवल टैमोक्सीफेन के प्रशासन के माध्यम से सक्रिय किया जा सकता है। जबकि क्रे-ईआरटी 2 माउस लाइनें विशिष्ट सेल लाइनों में क्रे के प्रेरण की अनुमति देती हैं, वयस्क न्यूरोजेनेसिस17,18 पर टैमोक्सीफेन के प्रभावों का विवरण देने वाले ज्ञान का खजाना है। इसके अतिरिक्त, कई आरओएसए-संचालित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन मौजूद हैं जिनका उपयोग जीएफपी या एमटीएमजी के बजाय किया जा सकता है, जिसमें वाईएफपी या सीएफपी शामिल हैं, जो अन्य फ्लोरोसेंट तरंग दैर्ध्य में वैकल्पिक फ्लोरोसेंट लेबलिंग की अनुमति देगा। इन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन का उपयोग टेट-ऑन या क्रे-ईआरटी 2 सिस्टम के साथ किया जा सकता है।

टेलोमेरेज़ रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (टीईआरटी) होलोएंजाइम टेलोमेरेज़ का दर-सीमित घटक है, जो कोशिका विभाजन19,20 के दौरान छोटा होने के बाद टेलोमेरेस का विस्तार करने के लिए काम करता है। टीईआरटी को आंत21,22, अस्थि मज्जा 21, यकृत 23, वसा 24, एंडोमेट्रियम 25,26 और हड्डी 1 में वयस्क ऊतक स्टेम कोशिकाओं के मार्कर के रूप में पहचाना गयाहै। क्या इन वयस्क स्टेम कोशिकाओं में टीईआरटी अभिव्यक्ति पूरी तरह से टेलोमेरेज़-विस्तार गतिविधि के लिए है या गैर-विहित टीईआरटी भूमिकाएं27 करने के लिए अभी भी अज्ञात है। टीईआरटी-एक्सप्रेसिंग क्विसेंट वयस्क स्टेम सेल (क्यूएएससी) की पहचान की गई है और इन स्टेम कोशिकाओं की मल्टीपोटेंसी और आत्म-नवीकरण क्षमता का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक वंश अनुरेखण चूहों के साथ पूरे शरीर में पता लगाया गया है, साथ ही 1,22,23,28 को सक्रिय करने, प्रसारित करने, अंतर करने और माइग्रेट करने की उनकी क्षमता का अध्ययन किया गया है। टर्ट-आरटीटीए ट्रांसजीन का निर्माण पहले किया गया है1. इस पत्र में, हम टीईआरटी + क्यूएएससी का अध्ययन करने के लिए एक वंश अनुरेखण टीईआरटी माउस लाइन के उपयोग का वर्णन करेंगे जिसे हमने वयस्क माउस मस्तिष्क में एक उपन्यास एएससी आबादी के रूप में पहचाना है।

एक ट्रांसजेनिक वंश ट्रेसिंग माउस लाइन की पीढ़ी
टेट-ऑन सिस्टम का उपयोग करके वंश-अनुरेखण माउस लाइन उत्पन्न करने के लिए, माउस संभोग के माध्यम से एक ही जानवर के भीतर तीन ट्रांसजीन को जोड़ा जाना चाहिए। पहला एक आरटीटीए है, जो ब्याज के जीन के प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया गया है (हमारा टीईआरटी-आरटीटीए है)। एक सेल में जो ब्याज के इस जीन को व्यक्त करता है, इसलिए आरटीटीए व्यक्त किया जाएगा। दूसरा एक ओटेट-क्रे जीन है, जिसमें एक टेट्रासाइक्लिन प्रतिक्रिया तत्व (टीआरई) होता है जो आरटीटीए संलयन प्रतिलेख और टेट्रासाइक्लिन या डॉक्सीसाइक्लिन दोनों की उपस्थिति में क्रे रिकॉम्बिनेज के प्रतिलेखन की अनुमति देगा। टेट्रासाइक्लिन या डॉक्सीसाइक्लिन को पीने के पानी या चाउ29 के माध्यम से एक जानवर को प्रशासित किया जा सकता है। अंत में, एक जीन होना चाहिए जो क्रे पुन: संयोजक दरार द्वारा सक्रिय किया जाएगा। इस पांडुलिपि में, हम जिस लेबलिंग जीन का वर्णन करेंगे वह रोजा 26-एमटीएमजी जीन है, जो क्रे पुनर्संयोजन तक सर्वव्यापी रूप से एमटीमैटो (सभी कोशिकाओं में झिल्ली लाल प्रतिदीप्ति) को ट्रांसक्रिप्ट करेगा। हालांकि, यदि कोई कोशिका आरटीटीए प्रतिलेख व्यक्त करती है और इसमें टेट्रासाइक्लिन या डॉक्सीसाइक्लिन होता है, तो एमटीमैटो और एमजीएफपी साइटों के बीच लॉक्स पी साइटों के एक सेट का क्रे पुनर्संयोजन आर 26 साइट को बदल देगा और कोशिका को झिल्ली टमाटर के बजाय झिल्ली ईजीएफपी (एमजीएफपी, या झिल्ली हरी प्रतिदीप्ति) का उत्पादन करने का कारण बनेगा। इस एमजीएफपी सिग्नल की अमिट प्रकृति विवो लेबलिंग और कोशिकाओं के अनुरेखण की अनुमति देगी क्योंकि वे फैलते हैं, पलायन करते हैं और अंतर करते हैं। ट्रेस के बाद, मानक क्रायोसेक्शन या मोटे ऑप्टिकली साफ़ दिमाग में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से जीएफपी की अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है।

इस पत्र में, हम विशिष्ट माउस लाइन के उपयोग का वर्णन करेंगे, एमटीईआरटी-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी। इस ट्रिपल ट्रांसजेनिक माउस लाइन को बनाने के लिए, हमने पहले ओटेट-क्रे जानवरों (जैक्सन लैब स्ट्रेन # 006234) को रोजा-एमटीएमजी जानवरों (जैक्सन लैब स्ट्रेन # 007676) को ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी डबल ट्रांसजेनिक चूहों को बनाने के लिए मिलाया। इन जानवरों को पूरक तालिका 1 और 2 में इंगित प्राइमर और पीसीआर टेम्पलेट्स के साथ जीनोटाइप किया गया था। एमटीईआरटी-आरटीटीए चूहों (डेविड ब्रेउल्ट1 द्वारा निर्मित) को ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी जानवरों को एमटर्ट-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी चूहों (चित्रा 1 ए) 1,30 बनाने के लिए मिलाया गया था। एमटीईआरटी-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी माउस लाइन की कार्रवाई का तंत्र चित्रा 1 बी में सचित्र है।

डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण और पल्स-चेस डिजाइन
प्रयोगों की योजना बनाते समय, कई कारकों पर विचार करना महत्वपूर्ण है जो वंश अनुरेखण प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित करेंगे, जिसमें डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण में जानवर की उम्र, डॉक्सीसाइक्लिन प्रशासन ("पल्स" अवधि) की लंबाई, ऊतक संग्रह से पहले डॉक्सीसाइक्लिन हटाने के बाद समय की लंबाई ("पीछा" अवधि), और इन प्रक्रियाओं के दौरान किसी भी हस्तक्षेप का समय शामिल है। प्रयोग के समापन पर लेबल कोशिकाओं और उनकी संतान को समझने के लिए ये अध्ययन डिजाइन विचार आवश्यक हैं। प्रक्रिया में पहला कदम जानवर की रुचि की उम्र और डॉक्सीसाइक्लिन प्रशासन की लंबाई की पहचान करना है। लंबी नाड़ी अवधि आरटीटीए से जुड़े प्रमोटर को व्यक्त करने के लिए अधिक कोशिकाओं की क्षमता की अनुमति देगी और ब्याज की अधिक कोशिकाओं को अमिट रूप से चिह्नित किया जाएगा। एक सेल प्रकार जो ब्याज के जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करता है, उसे कोशिकाओं की तुलना में लंबी नाड़ी अवधि की आवश्यकता हो सकती है जो लगातार ब्याज के जीन को व्यक्त करते हैं। हालांकि, यदि अध्ययन का लक्ष्य ब्याज की कोशिका या तीव्र हस्तक्षेप के अल्पकालिक प्रभावों को समझना है, तो नाड़ी अवधि बहुत लंबी नहीं हो सकती है, क्योंकि एक बार एक कोशिका को चिह्नित करने के बाद, शेष पल्स अवधि के दौरान किसी भी संख्या में परिवर्तनों के माध्यम से इसका पता लगाया जाएगा। हमारे कुछ अध्ययनों में, टीईआरटी के लिए प्रत्यक्ष-रिपोर्टर की अधिक बारीकी से नकल करने के लिए बिना किसी पीछा अवधि के 2 दिन की नाड़ी का उपयोग किया गया था। ऐसा इसलिए है क्योंकि रोजा-एमटीएमजी जीन के पुनर्संयोजन के लिए समय की न्यूनतम लंबाई 2 दिन31 है।

पल्स-चेस प्रयोग में अगली आवश्यक अवधि डॉक्सीसाइक्लिन को हटाने और जानवर के छिड़काव के बीच की लंबाई है, जिसे 'पीछा' के रूप में भी जाना जाता है। चूहों में डॉक्सीसाइक्लिन का आधा जीवन प्रशासन मार्ग की परवाह किए बिना लगभग 170 मिनट है, जिससे यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरणअब हटाने के कई घंटों बाद नहीं हो रहा है 32। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वृद्ध चूहों में डॉक्सीसाइक्लिन चयापचय धीमा है, जिससे युवा जानवरों की तुलना में लंबे समय तक प्रभावी 'पल्स' अवधि हो सकतीहै 33.

पीछा अवधि के दौरान, प्रसार, भेदभाव या माइग्रेशन के बाद भी लेबल वाली कोशिकाओं को लेबल किया जाना जारी रहेगा। इन कोशिकाओं की संतान को भी लेबल किया जाएगा। अध्ययन का लक्ष्य नाड़ी-पीछा प्रतिमान की लंबाई को आकार देगा। यदि अध्ययन का लक्ष्य ब्याज की कोशिकाओं के साथ लंबे समय तक ऊतक के उत्थान को समझना है, तो लंबी पीछा अवधि की आवश्यकता हो सकती है। अंत में, किसी भी हस्तक्षेप या उपचार का समय तय किया जाना चाहिए। नाड़ी अवधि के दौरान प्रशासन ब्याज के जीन के साथ-साथ इस समय के दौरान बनाई गई किसी भी संतान को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को प्रभावित करेगा, जबकि पीछा अवधि के दौरान प्रशासन ब्याज की कोशिकाओं की ज्यादातर संतानों को प्रभावित कर सकता है, हालांकि यह इस बात पर निर्भर करेगा कि लेबल वाली कोशिकाएं कितनी जल्दी विभाजित या अंतर करती हैं। पल्स-चेस प्रयोगात्मक डिजाइनों के उदाहरण जो हमने उपयोग किए हैं , चित्रा 2 ए में उल्लिखित हैं।

टपका हुआ अभिव्यक्ति के कारण पृष्ठभूमि जीएफपी सिग्नल की संभावना से अवगत होना भी महत्वपूर्ण है। टपका हुआ अभिव्यक्ति डॉक्सीसाइक्लिन की अनुपस्थिति में आरटीटीए और ओटेट अनुक्रमों के बीच अंतर्निहित बाध्यकारी क्षमता के परिणामस्वरूप होती है, और आरटीटीए की अनुपस्थिति में ओटेट ट्रांसजीन की अवशिष्ट गतिविधि (34 में समीक्षा की गई)। टपका हुआ अभिव्यक्ति टेट सिस्टम की एक कमजोरी का प्रतिनिधित्व करती है, और यद्यपि रिसाव अक्सर सिस्टम के लिए एक स्वीकार्य नकारात्मक पक्ष होता है, ऐसी स्थितियां जहां टपका हुआ अभिव्यक्ति विषाक्तता और मृत्यु दर का कारण बन सकती है, जैसे कि ओटेट-डीटीए जानवरों में डिप्थीरिया विष (डीटीए) इन प्रणालियों के उपयोग को सीमित कर सकता है35.

माइक्रोस्कोपी के लिए पतले वर्गों के मस्तिष्क प्रसंस्करण, सेक्शनिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस
वंश अनुरेखण प्रयोग के बाद चूहों के दिमाग का विश्लेषण करने के लिए, चूहों को पहले रक्त और सीएसएफ को हटाने के लिए ट्रांसकार्डियल छिड़काव के माध्यम से सुगंधित किया जाना चाहिए जो मस्तिष्क में उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस का कारण बन सकता है। दो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले फिक्सेटिव हैं जिनके साथ जानवर को सुगंधित किया जा सकता है: हिस्टोचॉइस टिशू फिक्सेटिव, एक ग्लाइक्सल फिक्सेटिव (जीएफ), या 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए)। ग्लाइक्सल फिक्सेटिव पीएफए की तुलना में कम क्रॉस-लिंकिंग के साथ अपेक्षाकृत कोमल निर्धारण प्रक्रिया की अनुमति देते हैं। यह ऊतक कठोरता को कम करता है, एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता को कम करता है, और इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान कम केंद्रित एंटीबॉडी समाधान की अनुमति देता है। हालांकि, अगर उनमें मेथनॉल होता है तो यह ऑटोफ्लोरेसेंस36 को बढ़ाने का काम कर सकता है। दूसरी ओर, पीएफए अक्सर अधिक मजबूत निर्धारण की अनुमति देगा, और जबकि इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता होगी, एंटीबॉडी हैं जो केवल पीएफए-निश्चित ऊतकों के साथ काम करेंगे, और बाद में वर्णित ऑप्टिकल क्लियरिंग तकनीक के लिए 4% पीएफए के साथ छिड़काव आवश्यक है।

छिड़काव के बाद एक पोस्ट-फिक्सेशन कदम है, जिसमें मस्तिष्क को रात भर छिड़काव के दौरान उपयोग किए जाने वाले एक ही प्रकार के फिक्सेटिव में डुबोया जाता है। यह किसी भी मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए अनुमति देता है जो छिड़काव के दौरान पूरी तरह से तय नहीं हो सकते हैं ताकि ठीक करना जारी रखा जा सके। अगला, ऊतक ("क्रायो-संरक्षण") के भीतर बर्फ के गठन को रोकने के लिए ठंड कदम से पहले जितना संभव हो उतना पानी निकालने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में सुक्रोज में मस्तिष्क को ऊष्मायन किया जाएगा। मस्तिष्क को तब प्रसंस्करण के लिए धनु, कोरोनल या अनुप्रस्थ ऊतक वर्गों की किसी भी संख्या में काटा जा सकता है। परिशुद्धता और प्रजनन क्षमता दोनों के लिए, कैलिब्रेटेड मस्तिष्क ब्लॉक का उपयोग इस तरह से किया जाना चाहिए जो जानवरों के बीच लगातार ब्रेग्मा कटौती सुनिश्चित करता है। सबसे महत्वपूर्ण कारक जो प्रभावित कर सकता है कि मस्तिष्क को कैसे विभाजित किया जाता है, ब्याज का मस्तिष्क क्षेत्र (ओं) है। उदाहरण के लिए, जबकि एक धनु कटौती एक ऊतक अनुभाग में अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों का विश्लेषण करने की अनुमति दे सकती है, यह कटौती वेंट्रिकुलर-सबवेंट्रिकुलर ज़ोन (वी-एसवीजेड) के न्यूरो / ग्लियोजेनिक क्षेत्रों के विश्लेषण की अनुमति नहीं देगी क्योंकि पार्श्व वेंट्रिकल के पार्श्व और औसत दर्जे का पक्ष उस आयाम में समझना असंभव होगा और कोरोनल विमान में बेहतर मनाया जाएगा। यह वयस्क न्यूरोजेनेसिस अध्ययनों में बनाने के लिए एक महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है, क्योंकि पार्श्व वेंट्रिकल के पार्श्व पक्ष में न्यूरोजेनिक वी-एसवीजेड होता है, जबकि पार्श्व वेंट्रिकल की औसत दर्जे की दीवार एक अधिक ग्लियोजेनिक आला37 है।

ऊतकों को कोरोनल, धनु, या अनुप्रस्थ वर्गों में विभाजित करने के बाद, उन्हें इष्टतम शीतलन तापमान (ओसीटी) एम्बेडिंग समाधान का उपयोग करके ब्लॉक में जमे हुए किया जाएगा। यहां, सूखी बर्फ और इथेनॉल के मिश्रण के उपयोग के साथ, इस एम्बेडिंग सामग्री के भीतर दिमाग जमे हुए हैं। यदि पतले अनुभाग विश्लेषण की आवश्यकता होती है, तो ब्लॉक को क्रायोस्टैट पर काट दिया जाएगा, और आवश्यक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के आधार पर सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए ग्लास स्लाइड्स को पतले वर्गों (<20 μm) के रूप में पालन किया जा सकता है। ग्लास स्लाइड जो चार्ज नहीं की जाती हैं, उनका भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन अनचार्ज की गई स्लाइड्स के उपयोग के परिणामस्वरूप स्लाइड38 से ऊतक अनस्टक हो सकते हैं। यदि मध्यम मोटाई मुक्त-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों (>20 μm) की आवश्यकता होती है, तो ऊतकों को मुक्त-फ़्लोटिंग वर्गों के रूप में एकत्र किया जाएगा। यदि मोटे वर्गों (0.5-4 मिमी) की आवश्यकता होती है, तो वाइब्रेटोम के साथ गैर-जमे हुए मस्तिष्क वर्गों को टुकड़ा करने की आवश्यकता होती है। स्लाइड पर वर्गों के बीच भंडारण अंतर को नोट करना महत्वपूर्ण है, जिसके लिए -20 से -80 डिग्री सेल्सियस और फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन पर ठंड की आवश्यकता होती है, जिसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाएगा।

मस्तिष्क समाशोधन और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
यदि माउस मस्तिष्क में वंश-पता लगाए गए कोशिकाओं का एक व्यापक, अभी तक कम विस्तृत विश्लेषण वांछित है, तो मस्तिष्क के ऊतकों के मोटे खंडों का व्यापक विश्लेषण आईडीआईएससीओ मस्तिष्क समाशोधन39 के साथ संभव है, इसके बाद इम्यूनोस्टेनिंग और टाइल्ड जेड-स्टैक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी या लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी। यहां, माउस मस्तिष्क के बड़े वर्गों को ऑप्टिकल रूप से साफ़ किया जाएगा (डिलिपिडेशन39 की एक प्रक्रिया), जो 1 मिमी ऊतक अनुभाग में फ्लोरोसेंट सिग्नल इमेजिंग के लिए बेहतर अनुमति देता है। इस प्रक्रिया के डाउनसाइड्स उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस और सेल आकृति विज्ञान की उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने की कम क्षमता और अधिक पारंपरिक तरीकों (पतली क्रायोसेक्शन या फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन) की तुलना में आवश्यक कामकाजी दूरी में वृद्धि के कारण विस्तृत सह-धुंधला विश्लेषण हैं। इस कारण से, हम व्यक्तिगत कोशिकाओं को चिह्नित करने या विश्लेषण करने का प्रयास करने के बजाय, कई मस्तिष्क क्षेत्रों में बड़े पैमाने पर वंश अनुरेखण परिणामों का विश्लेषण करने के लिए मस्तिष्क समाशोधन की सलाह देते हैं।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. प्रयोगात्मक पलटन चूहों के लिए टेट-ऑन माउस लाइन, प्रजनन रणनीतियों और जीनोटाइपिंग का पता लगाने वाले वंश का निर्माण

नोट: यहां, हम फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन के रूप में रोजा-एमटीएमजी के साथ टेट-ऑन माउस सिस्टम के निर्माण की रूपरेखा तैयार करते हैं जो क्रे पुनर्संयोजन से गुजरता है, हालांकि विभिन्न अन्य क्रे-पुनर्संयोजन-संचालित रिपोर्टर लाइनों का उपयोग टेट-ऑन सिस्टम के साथ भी किया जा सकता है।

  1. एक या एक से अधिक आर 26 (एमटीएमजी) (+/+) महिलाओं के साथ एक ओटेट-क्रे (+/-) पुरुष का एक संभोग पिंजरे स्थापित करें। प्रयोगात्मक माउस संभोग सेटअप के अवलोकन के लिए चित्रा 1 देखें।
  2. परिणामी पिल्ले (एफ 1) ओटीईटी-क्रे (+/-) या ओटीईटी-क्रे (-/-) और आर 26 (एमटीएमजी) (+/-) होंगे। अनुपूरक तालिका 1 में प्राइमरों और पूरक तालिका 2 में प्रोटोकॉल के अनुसार जीनोटाइपिंग करें।
  3. वीनिंग पर, प्रत्येक वीनलिंग से एक कान पंच लेकर जर्मलाइन परीक्षण करें। एफआईटीसी स्पेक्ट्रम में एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत कान पंच की जांच करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि जानवर विकास में जर्मलाइन पुनर्संयोजन से गुजरा था या नहीं। यदि हां, तो जानवर हर कोशिका में जीएफपी व्यक्त करेगा, और कान पंच एमजीएफपी सिग्नल के साथ फ्लोरोसिस करेगा। इन जानवरों का उपयोग संभोग या प्रयोगों के लिए नहीं किया जा सकता है।
    नोट: चूहों से कान क्लिप जो जर्मलाइन नहीं हैं, माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 सी) के तहत केवल अंतर्जात प्रतिदीप्ति दिखाते हैं, जबकि जर्मलाइन जानवर एक उज्ज्वल जीएफपी सिग्नल (चित्रा 1 डी) दिखाते हैं। नियंत्रण कान चूहों से हो सकते हैं जिनमें फ्लोरोसेंट ट्रांसजीन नहीं होते हैं। एक नोट के रूप में, कान के बालों में उच्च अंतर्जात प्रतिदीप्ति होती है और इसका उपयोग निर्धारण कारक (चित्रा 1 सी) के रूप में नहीं किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, अंतर्जात प्रतिदीप्ति में अंतर सफेद बनाम काले कोट रंग के चूहों के बीच मनाया जाता है, और परीक्षण किए जा रहे चूहों के रूप में एक ही कोट रंग के चूहों से नियंत्रण इस विश्लेषण में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  4. एक या एक से अधिक मादा ओटेट-क्रे (-/-) एक्स आर 26 (एमटीएमजी) (+/-) एक्स आर 26 (एमटीएमजी) चूहों के साथ एक नर ओटेट-क्रे (+/-) मेट करें।
  5. परिणामी पीढ़ी (एफ 2) 1/4 आर 26 (एमटीएमजी) (+/+) और 1/2 क्रे (+/-) होगी। इन जानवरों को एक या एक से अधिक एमटीईआरटी-आरटीटीए (+/+) जानवरों के साथ एक ओटेट-क्रे (+/-) एक्स आर 26 (एमटीएमजी) (+/+) संभोग करके एमटीईआरटी-आरटीटीए (+/+) जानवरों के साथ पार करें।
    नोट: हमने एमटीईआरटी-आरटीटीए (+/+) जानवरों का उपयोग किया, लेकिन यह प्रक्रिया किसी भी आरटीटीए माउस लाइन30 के साथ की जा सकती है।
  6. प्रायोगिक जानवरों के लिए, एमटीईआरटी-आरटीटीए (+/+) या (+/-) एक्स ओटेट-क्रे (+/-) एक्स आर 26 (एमटीएमजी) (+/+) या (+/-) उत्पन्न करने के लिए प्रजनन स्थापित करें।

2. क्रे और पल्स-चेस डिजाइन के डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण

  1. जब जानवर अध्ययन शुरू करने के लिए सही उम्र में होते हैं, तो अपने पीने के पानी को डॉक्स पानी से बदल दें: 5% सुक्रोज और 2 मिलीग्राम / क्रे-नकारात्मक जानवरों का उपयोग करें जो परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए एक नियंत्रण समूह के रूप में प्रयोगात्मक जानवरों के रूप में एक ही डॉक्सीसाइक्लिन पल्स-चेस प्राप्त करते हैं।
    1. तैयारी के बाद, 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर डॉक्स पानी स्टोर करें। अधिक जानकारी के लिए तालिका 1 देखें। डॉक्स पानी को बदलने से पहले 5 दिनों तक पीने की बोतलों में जानवरों को प्रशासित किया जा सकता है, क्योंकि फंगल वृद्धि तब हो सकती है जब डॉक्स पानी को लंबे समय तक कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जाता है।
      नोट: एमटीएमजी ट्रांसजीन (प्रारंभिक एमटीएमजी पेपर) का उपयोग करते समय एमजीएफपी सिग्नल को शामिल करने के लिए कम से कम 2 दिनों की डॉक्सीसाइक्लिन पल्स की आवश्यकता होती है।
      नोट: हमने 2 मिलीग्राम / एमएल के अलावा डॉक्सीसाइक्लिन सांद्रता का परीक्षण नहीं किया है। पिछले साहित्य ने पहचान की है कि पीने के पानी के माध्यम से प्रशासित होने पर इस एकाग्रता का सबसे अधिक प्रभाव पड़ता है29. वितरित डॉक्सीसाइक्लिन की मात्रा प्रत्येक जानवर द्वारा किए गए पीने की मात्रा के आधार पर भिन्न हो सकती है। जानवरों के बीच सुसंगत होने के लिए डॉक्सीसाइक्लिन इंजेक्शन या गैवेज भी किया जा सकताहै 40.
  2. नाड़ी की अवधि समाप्त होने के बाद, पिंजरों से डॉक्स पानी निकालें और सामान्य पीने के पानी के साथ बदलें। जानवर अब मृत्यु तक 'पीछा' अवधि में रहेंगे।

3. ट्रांसकार्डियल छिड़काव और मस्तिष्क विच्छेदन

  1. अपने पिंजरे से एक माउस निकालें और बाएं अंगूठे और तर्जनी का उपयोग कर जानवर को रोकने। एमएल केटामाइन और 20 मिलीग्राम / एमएल ज़ाइलाज़िन के समाधान के साथ 200 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 20 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलाज़िन की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.9% बाँझ खारा में 20 मिलीग्राम / एमएल ज़ाइलाज़िन के समाधान के साथ जानवर को इंजेक्ट करें। अधिक जानकारी के लिए तालिका 1 देखें।
    चेतावनी: संज्ञाहरण के लिए प्रोटोकॉल देश के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क पर संवेदनाहारी के प्रभाव होते हैं जिनमें माइक्रोग्लियल आकृति विज्ञान और क्रिया और कॉर्टिकोस्टेरोन के स्तर में परिवर्तन शामिल हैं जिन्हें मस्तिष्क संग्रह और विश्लेषण41,42 के उद्देश्य से छिड़काव करते समय समझा जाना चाहिए।
  2. लगभग 1-2 मिनट के बाद जानवर अपने सही पलटा खो देंगे। इसका परीक्षण करने के लिए, बस जानवर को अपनी पीठ पर रोल करें और यदि वह अपने पैरों पर वापस रोल नहीं कर सकता है, तो उसने सही पलटा खो दिया है।
  3. लगभग 5-10 मिनट के बाद जानवर अपने पेडल पलटा खो देंगे। पेडल रिफ्लेक्स की जांच करने के लिए, जानवर के प्रत्येक पैर को चुटकी लेने के लिए अंगूठे और तर्जनी का उपयोग करें। यदि कोई प्रतिक्रिया नहीं है, तो कूद या मांसपेशियों की ऐंठन के रूप में, जानवर के प्रत्येक पैर को चुटकी लेने के लिए अंगूठे और तर्जनी के नाखूनों का उपयोग करें। यदि कोई प्रतिक्रिया नहीं है, तो जानवर ने पेडल पलटा खो दिया है।
    नोट: यदि जानवर इंजेक्शन के बाद 15 मिनट से अधिक समय तक पेडल रिफ्लेक्स का जवाब देता है, तो प्रारंभिक केटामाइन / आयु, लिंग, जीनोटाइप, फेनोटाइप और उपचार इस दवा कॉकटेल के लिए जानवर की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं।
  4. राइटिंग और पेडल सजगता खो जाने के बाद, एक दस्ताने वाली उंगली के साथ माउस नेत्रगोलक से हल्के ढंग से संपर्क करके ओकुलर रिफ्लेक्स का परीक्षण करें। प्रतिक्रिया की कमी इंगित करती है कि ओकुलर रिफ्लेक्स खो गया है।
  5. एक पिन करने योग्य काम की सतह पर पिन किए गए पंजे के साथ एक लापरवाह स्थिति में माउस को सुरक्षित करें।
  6. एक्सिफॉइड प्रक्रिया से लगभग 1-2 सेमी नीचे थोरैसिक मिडलाइन के साथ सर्जिकल कैंची के साथ त्वचा के माध्यम से एक चीरा बनाएं। एक्सिफॉइड प्रक्रिया तक बेहतर काटें।
  7. संदंश के साथ एक्सिफॉइड प्रक्रिया के उपास्थि को समझें। कैंची डालें और हंसली के स्तर तक माउस के दाईं ओर तिरछे मांसलता और रिबकेज के माध्यम से काट लें।
    1. संदंश के साथ वक्षीय मांसलता उठाओ और डायाफ्राम के माध्यम से टुकड़ा जब तक दिल कल्पना की जा सकती है। फिर माउस के बाईं ओर एक समान विकर्ण कटौती करें, जिससे दिल के साथ किसी भी संपर्क को रोकना सुनिश्चित हो सके। वक्षीय मांसलता को गुहा से दूर रखने के लिए हेमोस्टैट का उपयोग करें।
      नोट: इस बिंदु पर, माउस अब सांस लेने में सक्षम नहीं होगा, इसलिए अगले चरणों से पहले मृत्यु को रोकने के लिए जल्दी से काम करें।
  8. कुंद संदंश के साथ धड़कते दिल को सुरक्षित और महाधमनी मेहराब के आधार के माध्यम से बाएं वेंट्रिकल में एक वितरण सुई डालें।
  9. सम्मिलन स्थल के ठीक ऊपर बाएं वेंट्रिकल में सुई आधार क्लैंप करें।
  10. दाहिने आलिंद में एक चीरा बनाएं, और रक्त प्रवाह के पहले संकेत पर, 8.11 एमएल / मिनट पर 1 एक्स पीबीएस के 20 एमएल के साथ जानवर को छिड़कना शुरू करें।
  11. 1 एक्स पीबीएस के शरीर को सुगंधित करने के बाद, डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के लिए उपयुक्त फिक्सेटिव पर स्विच करें और माउस को 20 एमएल फिक्सेटिव के साथ परफ्यूज करें।
    1. जमे हुए सेक्शनिंग और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, मस्तिष्क समाशोधन के लिए ग्लाइक्सल फिक्सेटिव के साथ जानवर को सुगंधित करें, 1 एक्स पीबीएस (पीएच 7.4) में 4% पीएफए के साथ जानवर को सुगंधित करें।
      नोट: एक सफल छिड़काव के लक्षणों में पशु कठोरता (ग्लाइऑक्सल के साथ मामूली कठोरता, पीएफए के साथ तीव्र कठोरता) और पूरे ऊतकों में दृश्यमान रक्त वाहिकाओं की कमी शामिल है।
  12. माउस को नष्ट करें और ब्रेनस्टेम में कैंची डालकर और प्रत्येक तरफ फ्रंटोमैक्सिलरी सिवनी के माध्यम से स्क्वैमोसल सिवनी के साथ काटकर मस्तिष्क को हटा दें। फिर खोपड़ी की टोपी को हटाने के लिए फोंटोनासल सिवनी में कटौती करें, सावधान रहें कि घ्राण बल्ब को नुकसान न पहुंचे। वहां से, खोपड़ी को उल्टा कर दें, और मस्तिष्क को हटाने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें, जिससे ऑप्टिक तंत्रिका को अलग करना सुनिश्चित हो सके।
  13. सुगंधित मस्तिष्क को एक ऊतक कारतूस में रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जानवर को सुगंधित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फिक्सेटिव में विसर्जित करें।

4. मस्तिष्क उपचार, टुकड़ा करने की क्रिया, और इम्यूनोस्टेनिंग

  1. मस्तिष्क उपचार और टुकड़ा करने की क्रिया
    1. ग्लाइऑक्सल फिक्सेटिव से मस्तिष्क कारतूस निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए या दिमाग डूबने तक 1 एक्स पीबीएस में 15% सुक्रोज में सेते हैं।
    2. 15% सुक्रोज से मस्तिष्क कारतूस निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए या मस्तिष्क डूबने तक 1x पीबीएस में 30% सुक्रोज में सेते हैं।
      नोट: अधिक जानकारी के लिए तालिका 1 देखें।
    3. 1x पीबीएस में 30% सुक्रोज से मस्तिष्क निकालें और कोरोनल मस्तिष्क ब्लॉक या धनु मस्तिष्क ब्लॉक का उपयोग करके मस्तिष्क को विभिन्न 'ब्लॉक' में अलग करें।
    4. सूखी बर्फ और इथेनॉल (ईटीओएच) के मिश्रण पर मस्तिष्क वर्गों को रखकर ओसीटी यौगिक में कोरोनल या धनु मस्तिष्क वर्गों को एम्बेड करें। ओसीटी सफेद हो जाने और ठोस होने के बाद, सूखी बर्फ-ईटीओएच मिश्रण से हटा दें और -20 डिग्री सेल्सियस पर एयर-टाइट बैग के अंदर पैराफिल्म में लिपटे स्टोर करें।
    5. फ्रीजर से जमे हुए ब्लॉक निकालें और -20 डिग्री सेल्सियस पर सेट आंतरिक तापमान के साथ क्रायोस्टैट के अंदर रखें। ब्लॉक को धातु चक में संलग्न करने के लिए ओसीटी का उपयोग करें ताकि ऊतक ठोस रूप से जुड़ा हो। ऊतक चक करने के लिए फ्रीज करने के लिए ~ 5 मिनट की अनुमति दें। एक चार्ज ग्लास स्लाइड पर प्रत्येक ऊतक टुकड़ा रखकर, 7 μm पर ऊतक स्लाइस।
    6. स्लाइड्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेंकना करने की अनुमति दें, और फिर इम्यूनोस्टेनिंग के लिए उपयोग किए जाने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. इम्यूनोस्टेनिंग
    1. कमरे के तापमान (आरटी) के लिए गर्म स्लाइड और 15 मिनट के लिए बर्फ-ठंडे एसीटोन के साथ पोस्ट-फिक्स।
    2. 1x कुल्ला बफर (उदाहरण के लिए, आईएचसी का चयन टीबीएस कुल्ला बफर) में 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें, प्रत्येक चरण के बीच आरटी पर 60 आरपीएम पर मिलाते हुए।
    3. आरटी पर 10 मिनट के लिए 0.3% ट्राइटन एक्स -100 के साथ परमाणु एंटीजन के धुंधला होने के लिए पारगम्यता आरटी पर 10 मिनट के लिए 0.3% ट्वीन -20 के साथ साइटोप्लाज्मिक एंटीजन के धुंधला होने के लिए पारगम्य करें।
    4. 10 मिनट के लिए कम पर 1x DaKO एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान के 50-100 एमएल में माइक्रोवेविंग स्लाइड द्वारा एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें, दो बार। फिर आरटी पर 5 मिनट के लिए कुल्ला बफर के साथ कुल्ला।
    5. आरटी पर 20 मिनट के लिए 70% ईटीओएच में 0.3% टाइपोजेन ब्लैक में स्लाइड सेते हैं और फिर कुल्ला बफर के साथ धोलें।
    6. ऊतकों को सूखने की अनुमति दिए बिना प्रत्येक ऊतक के चारों ओर एक हाइड्रोफोबिक बाधा खींचें। फिर प्रति ऊतक मिलीपोर अवरुद्ध अभिकर्मक की 1 बूंद के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ब्लॉक करें। फिर प्रत्येक ऊतक के लिए एंटीबॉडी पतला में पतला 100 μL प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
    7. अगले दिन, आरटी में 10 मिनट के लिए एलेक्सा फ्लोर माध्यमिक एंटीबॉडी में वर्गों सेते हैं। फिर कुल्ला बफर में स्लाइड धो लें।
    8. अंतर्जात जीएफपी सिग्नल अंकन ट्रेस कोशिकाओं को बढ़ावा देने और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं, इसके लिए एलेक्साफ्लोर 488 के संयुग्मित 1: 500 एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के 100 μL में मस्तिष्क वर्गों को कवर करें।
    9. अगले दिन, कुल्ला बफर 2x के साथ धो लें, और फिर 5 मिनट के लिए चलने वाले डीआई पानी में धो लें।
      नोट: धीरे-धीरे डीआई पानी से धोना सुनिश्चित करें, स्लाइड पर किसी भी बहते पानी से बचने के लिए ध्यान रखें जो स्लाइड से मस्तिष्क वर्गों को हटा सकता है।
    10. एमएल 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) के साथ 5 मिनट के लिए काउंटरस्टेन। फिर 5 मिनट के लिए बहते डीआई पानी में धो लें।
    11. प्रत्येक ऊतक अनुभाग के शीर्ष पर बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें और 22 मिमी x 22 मिमी कवरस्लिप के साथ सील करें। इष्टतम संकेत सुनिश्चित करने के लिए बढ़ते के दिन इमेजिंग की सिफारिश की जाती है।

5. इडिस्को मस्तिष्क समाशोधन (39 से अनुकूलित)

  1. निर्धारण और सेक्शनिंग
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% पीएफए में पोस्ट-फिक्स दिमाग और फिर आरटी पर 1 घंटे के लिए।
    2. आरटी में दो बार, एक घंटे के लिए 1x पीबीएस में दिमाग धो लें। फिर आवश्यक मस्तिष्क ब्लॉक का उपयोग करके 1 मिमी मोटी वर्गों में कटौती करें और 1 एक्स पीबीएस युक्त 5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में रखें।
  2. मेथनॉल पूर्व उपचार (मेथनॉल के साथ)
    नोट: कुछ प्रोटीनों के इम्यूनोस्टेनिंग को प्रभावित करने वाले मेथनॉल की संभावना के कारण, लेखक मेथनॉल मुक्त आईडीआईएससीओ प्रोटोकॉल विकल्प39 के प्रोटोकॉल के लिए रीडर को रेनियर एट अल 2014 को इंगित करना चाहते हैं। इस अनुभाग में निम्न समाधानों के बारे में अधिक जानकारी के लिए तालिका 1 देखें।
    1. आरटी पर दो बार (मिलाते हुए) 1 घंटे के लिए 1 एक्स पीबीएस के साथ धो लें।
    2. आरटी पर 1 घंटे (मिलाते हुए) के लिए 50% मेथनॉल (पीबीएस में) में धो लें।
    3. आरटी पर 1 घंटे (मिलाते हुए) के लिए 80% मेथनॉल में धो लें।
    4. आरटी पर 1 घंटे के लिए 100% मेथनॉल में दो बार (मिलाते हुए) धो लें।
    5. 20% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) / मेथनॉल (1 वॉल्यूम 30% एच 2 ओ 2/1 वॉल्यूम डीएमएसओ / 4 वॉल्यूम मेथनॉल, बर्फ ठंडा) में 5% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) के साथ ब्लीच नमूने रात भर 4 डिग्री सेल्सियस (मिलाते हुए)।
    6. विरंजन के बाद, आरटी पर दो बार (मिलाते हुए) 1 घंटे के लिए मेथनॉल में नमूने धो लें।
    7. आरटी पर 1 घंटे के लिए 20% डीएमएसओ / मेथनॉल में दो बार (मिलाते हुए) धोएं।
    8. आरटी पर 1 घंटे (मिलाते हुए) के लिए 80% मेथनॉल में धो लें।
    9. आरटी पर 1 घंटे (मिलाते हुए) के लिए 50% मेथनॉल में धो लें।
    10. आरटी पर 1 घंटे दो बार (मिलाते हुए) के लिए पीबीएस में धो लें।
    11. 0.2% ट्राइटन एक्स -100 में 1 घंटे के लिए दो बार (मिलाते हुए) आरटी पर धो लें।
  3. समाशोधन मस्तिष्क के इम्यूनोस्टेनिंग
    1. कक्षीय प्रकार के बरतन पर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस/0.2% ट्राइटन एक्स-100/20% डीएमएसओ/0.3 एम ग्लाइसिन में नमूने सेते हैं।
    2. कक्षीय प्रकार के बरतन पर 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस / 0.2% ट्राइटन एक्स -100/10% डीएमएसओ / 6% बकरी सीरम में ब्लॉक करें।
    3. एमएल हेपरिन सोडियम नमक में 1 घंटे के लिए पोर्सिन म्यूकोसा से 37 डिग्री सेल्सियस पर दो बार धोएं, और फिर 1 एक्स पीबीएस / 0.2% ट्वीन -20/10 μg / एमएल हेपरिन / 5% डीएमएसओ / 3% बकरी सीरम में 1:500 एकाग्रता वाले खरगोश एंटी-जीएफपी एलेक्सा फ्लोर 488 में सेते हैं
    4. कक्षीय प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 10 μg / एमएल हेपरिन के साथ 1x पीबीएस / 0.2% ट्वीन -20 में नमूने धोएं, तीन बार, और फिर 2 दिनों के लिए दिन में एक बार।
    5. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 50% वी / वी टेट्राहाइड्रोफ्यूरान (टीएचएफ) / एच2ओ के 10 एमएल में रात भर नमूने सेते हैं।
    6. एच2ओ के 10 एमएल में 1 घंटे के लिए नमूने सेते हैं।
    7. 100% टीएचएफ में 1 घंटे के लिए दो बार नमूने सेते हैं।
    8. एक बाँझ पोंछ के साथ सूखे नमूने और डाइक्लोरोमेथेन में सेते हैं जब तक कि वे शीशी (लगभग 40 मिनट) के नीचे डूब नहीं जाते। >60 मिनट सेते नहीं है।
      नोट: एक धूआं हुड के तहत डाइक्लोरोमेथेन को संभालना सुनिश्चित करें।
    9. स्पष्ट (>2 घंटे) तक 18 एमएल डाइबेंज़िल ईथर (डीबीई) में नमूने सेते हैं।
    10. छवि के लिए तैयार होने तक आरटी पर डीबीई में नमूने स्टोर करें।
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, समाशोधन पूरा होने के बाद जितनी जल्दी हो सके छवि नमूने करना महत्वपूर्ण है।

6. दाग स्लाइड या साफ दिमाग की इमेजिंग

  1. इम्यूनोस्टेन्ड मस्तिष्क वर्गों की छवि के लिए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से स्लाइड का विश्लेषण करें, जहां कई एंटीबॉडी की सह-अभिव्यक्ति की पुष्टि की जा सकती है। हम हाइड एस हाइब्रिड डिटेक्टरों के साथ एक लीका स्टेलिस 5 माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं, लेकिन कोई भी बिंदु स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप काम करेगा। इन उद्देश्यों में एचसी पीएल एपीओ 10x/0.40 सीएस2, एचसी पीएल एपीओ 40x/1.30 ओआईएल सीएस2 और एचसी पीएल एपीओ 63x/1.40 शामिल हैं।
    1. सही लेजर लाइनों और उत्सर्जन फिल्टर कॉन्फ़िगर करें। आवश्यक लेजर और संबंधित लेजर तीव्रता माइक्रोस्कोप और फ्लोरोफोर संयोजनों का उपयोग करने के अधीन हैं।
      नोट: हम डायोड 405 एनएम और सफेद प्रकाश पराबैंगनीकिरण के संयोजन का उपयोग प्रत्येक फ्लोरोफोर, या फ्लोरोफोरस के समूहों के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को ठीक करने के लिए करते हैं, जिसका उपयोग क्रॉसस्टॉक को कम करने और खत्म करने के लिए किया जा रहा है। इसी तरह के परिणाम पारंपरिक लेजर / फिल्टर संयोजनों का उपयोग करके भी प्राप्त किए जा सकते हैं लेकिन चैनल रक्तस्राव पर ध्यान दें। प्रत्येक विशिष्ट लेजर से कौन से चैनल प्रभावित होते हैं, यह देखने के लिए वांछित उत्सर्जन फ़िल्टर संयोजनों में से प्रत्येक के साथ संयोजन के रूप में एक एकल लेजर लाइन को चालू करके रक्तस्राव की पहचान की जा सकती है। उदाहरण के लिए, यदि डायोड 405 एनएम लेजर जीएफपी उत्सर्जन फिल्टर में दृश्यमान प्रतिदीप्ति का उत्पादन कर रहा है, तो होने के माध्यम से रक्तस्राव होता है। सुनिश्चित करें कि कई चैनलों को फ्रेम द्वारा क्रमिक रूप से फ्रेम किया जाए ताकि होने से किसी भी रक्तस्राव को कम किया जा सके।
    2. एक एमटीएमजी रिपोर्टर के साथ सह-दाग वाले टेट-ऑन दिमाग के लिए, डीएपीआई (उदा. 405 एनएम, ईएम. 450 एनएम), जीएफपी (उदा. 488 एनएम, एम. 509 एनएम), टीडीटोमैटो (उदा. 555 एनएम, एम. 582 एनएम), और द्वितीयक एंटीबॉडी पर उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोर से मेल खाने के लिए संबंधित सुदूर-लाल फ्लोरोफोर का चयन करें। हम एलेक्सा फ्लोर 647 (उदा. 651 एनएम, एम. 667 एनएम) की सलाह देते हैं।
    3. जीएफपी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक दोनों के साथ दाग वाले क्रे-नियंत्रण मस्तिष्क के साथ पहले सेटिंग्स स्थापित करें। ये मस्तिष्क स्लाइस फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए नियंत्रित करेंगे और कोई वास्तविक जीएफपी संकेत नहीं दिखाएंगे।
    4. यह सत्यापित करने के लिए कि विश्लेषण में कोई संकेत याद नहीं किया गया है, ऊपर से नीचे, बाएं से दाएं प्रत्येक मस्तिष्क अनुभाग का विश्लेषण करें। यदि विभिन्न आवर्धनों पर एक ही मस्तिष्क अनुभाग की इमेजिंग की जाती है, तो यह अनुशंसा की जाती है कि निचले आवर्धन का उपयोग पहले किया जाता है, क्योंकि उच्च आवर्धन एमटोमैटो सिग्नल को अधिक तेज़ी से ब्लीच करेगा।
  2. साफ़ किए गए दिमाग की छवि के लिए, एक स्वचालित चरण और स्वचालित टाइलिंग फ़ंक्शन के साथ एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। हम लीका स्टेलिस 5 माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं। क्योंकि नमूने इतने मोटे हैं (>500 μm), बड़ी कामकाजी दूरी की आवश्यकता होती है जो आवर्धन को सीमित करती है जिसे प्रभावी ढंग से प्राप्त किया जा सकता है। हम सभी साफ़ मस्तिष्क इमेजिंग के लिए एचसी पीएल एपीओ 10x / 0.40 सीएस 2 उद्देश्य का उपयोग करते हैं।
    1. एक ग्लास बॉटम डिश के खिलाफ एक साफ मस्तिष्क अनुभाग फ्लैट बिछाकर शुरू करें और डिबेंज़िल ईथर में डूब जाएं।
      नोट: डिबेंज़िल ईथर अधिकांश उद्देश्य लेंस और अधिकांश प्लास्टिक के लिए संक्षारक है। इस कारण से, ग्लास बॉटम डिश में किसी भी आंतरिक प्लास्टिक को त्वरित सुखाने वाले सिलिकॉन इलास्टोमर के साथ लेपित करने की आवश्यकता होती है।
    2. सही लेजर लाइनों और उत्सर्जन फिल्टर कॉन्फ़िगर करें। एमटीएमजी रिपोर्टर के साथ सह-दाग वाले टेट-ऑन दिमाग के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी पर उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोर से मेल खाने के लिए डीएपीआई, जीएफपी, टीडीटोमैटो और संबंधित दूर-लाल फ्लोरोफोर का चयन करें। वांछित रिज़ॉल्यूशन सेट करें, हम कम से कम 1024 x 1024 की सलाह देते हैं। पिनहोल को 1 एयू पर सेट करें।
    3. जीएफपी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक दोनों के साथ दाग वाले क्रे-नियंत्रण मस्तिष्क के साथ लेजर तीव्रता और डिटेक्टर लाभ पहले स्थापित करें। ये मस्तिष्क स्लाइस फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए नियंत्रित करेंगे और कोई वास्तविक जीएफपी संकेत नहीं दिखाएंगे।
    4. एक बार लेजर तीव्रता और डिटेक्टर लाभ अनुकूलित किया गया है, इमेजिंग के लिए मस्तिष्क बाहर नक्शा। छवि अधिग्रहण के एक्स और वाई अक्ष को सेट करने के लिए मस्तिष्क अनुभाग की पूरी परिधि का पता लगाकर शुरू करें। अगला, फोकल बिंदु को लगभग ऊतक की केंद्र गहराई पर सेट करके जेड अक्ष की पहचान करें, और ऊतक के "उच्चतम" बिंदु (सबसे सकारात्मक जेड-मान) का पता लगाने के लिए जेड-पोजिशनिंग नियंत्रण का उपयोग करें। आवश्यकतानुसार अधिकतम जेड-अक्ष ऊंचाई बढ़ाने वाले ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों को स्कैन करें।
      1. ऊतक की पूरी मोटाई प्राप्त करने के लिए आवश्यक "सबसे कम" (सबसे नकारात्मक जेड-मान) बिंदु के लिए दोहराएं। स्टेलारिस 5 में फोकल पॉइंट के ± 250 उम की सीमा है। यह जेड-अक्ष में ऑप्टिकल वर्गों को 500 μm मोटी तक सीमित करता है। मस्तिष्क अनुभाग का 3 डी क्षेत्र अब ज्ञात है।
    5. जेड-स्टेप आकार को 6 μm पर सेट करें और छवि प्राप्त करना शुरू करें। अधिग्रहण का समय कई कारकों पर निर्भर है और वांछित मापदंडों के आधार पर घंटों से लेकर दिनों तक हो सकता है। छवि अधिग्रहण समय को कम करने के लिए रिज़ॉल्यूशन को कम करने, लेजर स्कैन की गति बढ़ाने या चरण आकार बढ़ाने का प्रयास करें।
    6. एक बार जब पूरे साफ़ मस्तिष्क अनुभाग की टाइल वाली छवि पर कब्जा कर लिया गया है, तो वांछित के रूप में विश्लेषण करें।

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Representative Results

जबकि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ टेट-ऑन सिस्टम से उत्पन्न फ्लोरोसेंट सिग्नल ब्याज के प्रमोटर और फ्लोरोफोर (ओं) के आधार पर अलग-अलग होगा, हम वर्णन करेंगे कि एमटर्ट-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी जानवरों के साथ निष्कर्षों का विश्लेषण कैसे किया गया था। पल्स-चेस के बाद वयस्क दिमाग के विश्लेषण के परिणामस्वरूप विभिन्न शारीरिक निचे में झिल्ली जीएफपी-व्यक्त कोशिकाएं हुईं। विभिन्न सेल प्रकारों के बीच फ्लोरोसेंट तीव्रता में अंतर पर ध्यान दिया जाना चाहिए। फ्लोरोसेंट तीव्रता के बारे में एक चर कोशिका झिल्ली का आकार है। उदाहरण के लिए, कोरॉइड प्लेक्सस में कोरॉइड उपकला कोशिकाओं (सीपीईसी) में एक मोटी कोशिका झिल्ली और मजबूत फ्लोरोसेंट सिग्नल होता है जो आसानी से आसपास की कोशिकाओं (चित्रा 4 ए, बी) से अलग था। हालांकि, कोरॉइड प्लेक्सस स्ट्रोमा में अन्य छोटे और वर्तमान में अज्ञात सेल प्रकारों में एक कमजोर जीएफपी सिग्नल (चित्रा 4 सी) था। सेरिबैलम में, बर्गमैन ग्लियाल कोशिकाओं ने टोकरी कोशिकाओं की तुलना में एमजीएफपी के उच्च स्तर को व्यक्त किया, और एमजीएफपी अभिव्यक्ति में भिन्नता भी व्यक्तिगत टोकरी कोशिकाओं (चित्रा 4 डी) के बीच मौजूद थी। घ्राण बल्ब की ग्लोमेरुलर परत के भीतर घ्राण संवेदी न्यूरॉन अक्षतंतु ने एमजीएफपी (चित्रा 4 ए, ई) के उच्च स्तर को भी व्यक्त किया। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी एमजीएफपी + कोशिकाओं की पहचान की जाती है, इसलिए एमटीएमजी जानवरों के दिमाग में उज्ज्वल और मंद जीएफपी + कोशिकाओं दोनों की पहचान करना महत्वपूर्ण है। एमटीईआरटी-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी जानवरों में, हमने सेरेब्रल कॉर्टेक्स (चित्रा 4 ए) सहित मस्तिष्क क्षेत्रों में कम पृष्ठभूमि एमजीएफपी अभिव्यक्ति देखी। दिलचस्प बात यह है कि सेरिबैलम और ब्रेनस्टेम ने इस तरह से कम पृष्ठभूमि एमजीएफपी अभिव्यक्ति (चित्रा 4 ए) दिखाई।

वंश ट्रेस के बाद मस्तिष्क के ऊतकों के विश्लेषण के दौरान मस्तिष्क क्षेत्रों और कोशिका प्रकारों दोनों में एमजीएफपी और एमटोमैटो अभिव्यक्ति पैटर्न में अंतर होगा। घ्राण संवेदी न्यूरॉन अक्षतंतु जो घ्राण बल्ब की ग्लोमेरुलर परत को भरते हैं, ने अधिकांश अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों की तुलना में झिल्ली टमाटर के उच्च स्तर को व्यक्त किया, भले ही एक ही न्यूरॉन्स एमजीएफपी + हों, यह दर्शाता है कि कुछ कोशिकाएं एमटीओमैटो सिग्नल को अधिक धीरे-धीरे खो देती हैं (चित्रा 4 डी)। इसके विपरीत, कोरॉइड प्लेक्सस में, एमजीएफपी + कोशिकाओं ने कम एमटोमैटो (चित्रा 4 बी, सी) व्यक्त किया। अधिकांश अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में टमाटर सिग्नल सेल प्रकारों के बीच समान रूप से फैला हुआ है, एंडोथेलियल कोशिकाएं कुछ एकमात्र कोशिकाएं हैं जिनके फ्लोरोसेंट सिग्नल लाल फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि (चित्रा 4 बी) से बाहर खड़े होने के लिए पर्याप्त उज्ज्वल थे। पुनर्संयोजन के दौरान जीनोम से एमजीएफपी अभिव्यक्ति और एमटोमैटो की दरार की सक्रियता के परिणामस्वरूप एमटोमैटो अभिव्यक्ति का नुकसान होता है, लेकिन झिल्ली पर व्यक्त किए जाने वाले एमटोमैटो फ्लोरोफोरस को तब तक बनाए रखा जाता है जब तक कि वे नीचा नहीं हो जाते। इस कारण से, एमजीएफपी + कोशिकाएं अक्सर चर एमटोमैटो सिग्नल व्यक्त करेंगी, जो पुनर्संयोजन की पुनरावृत्ति, कोशिका प्रकार और कोशिका झिल्ली के आकार पर निर्भर करेगी। इसलिए, एमजीएफपी की अभिव्यक्ति के आधार पर कोशिकाओं का विश्लेषण करना और उन्हें विश्लेषण से बाहर नहीं करना महत्वपूर्ण है यदि वे एमजीएफपी और एमटीमैटो दोनों को व्यक्त करते हैं।

टेट-ऑन सिस्टम के साथ संयोजन के रूप में वैकल्पिक पत्रकारों का भी उपयोग किया जा सकता है। क्रे पुनर्संयोजन कोशिकाओं में जीएफपी या आरएफपी की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए कार्य कर सकता है जो आमतौर पर रोजा-जीएफपी या रोजा-आरएफपी जानवरों में किसी भी फ्लोरोसेंट टैग को व्यक्त नहीं करेगा। यहां, जीएफपी या आरएफपी का विश्लेषण ब्याज के प्रमोटर की अभिव्यक्ति का संकेत देगा, और कोई फ्लोरोफोर सिग्नल नहीं हटाया जाएगा जैसे कि एमटीएमजी जानवरों के साथ। सिंगल-फ्लोरोफोर रिपोर्टर अधिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी संयोजनों के साथ इम्यूनोस्टेनिंग की अनुमति देते हैं, क्योंकि एमटीएमजी जानवरों में झिल्ली टमाटर लाल तरंग दैर्ध्य में धुंधला होने से रोकता है।

Figure 1
चित्र 1. टेट-ऑन माउस लाइन की पीढ़ी। (ए) व्यक्तिगत माउस लाइनों से एमटीईआरटी-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी चूहों के निर्माण के लिए प्रजनन योजना की रूपरेखा। (बी) एमटीईआरटी-आरटीटीए में टेट-ऑन सिस्टम की योजनाबद्ध:: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी माउस लाइन। (सी-डी) गैर-जर्मलाइन (सी) और जर्मलाइन (डी) एमटीईआरटी-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी चूहों से एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के एफआईटीसी चैनल के साथ चित्रित कान क्लिप की प्रतिनिधि छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. टेट-ऑन चूहों का पता लगाने वाले वंश के साथ प्रायोगिक डिजाइन। बेसल प्रसार, प्रवासन और भेदभाव (1) से टेट-ऑन चूहों के साथ संभव प्रयोगों के चित्र डॉक्स पल्स के दौरान उपचार के लिए पुनर्जनन या पुन: संतुलन के लिए कोई पीछा नहीं (2), दीर्घकालिक प्रभावों की कल्पना करने के अवसर के साथ नाड़ी के दौरान हस्तक्षेप (3). बाद में पीछा नहीं करने के साथ 2 दिनों की एक छोटी नाड़ी टीईआरटी + कोशिकाओं के निकट-बेसल राज्य में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी, क्योंकि इन कोशिकाओं के पास सक्रिय करने, प्रसार करने, पलायन करने या अंतर करने के लिए बहुत कम समय होगा (4). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3. "एमटीईआरटी-आरटीटीए का मस्तिष्क समाशोधन:: ओटेट-क्रे:: रोजा-एमटीएमजी माउस दिमाग"। (ए) निर्धारण के बाद 1 मिमी मस्तिष्क वर्गों का धनु सेक्शनिंग। (बी) व्यक्तिगत मस्तिष्क वर्गों को आईडीआईएससीओ मस्तिष्क समाशोधन39 के लिए 5 एमएल ट्यूबों में रखा जाता है। (सी) साफ़ किए गए दिमाग को ग्लास बॉटम डिश में रखा जाता है और छवि अधिग्रहण के दौरान अपवर्तक सूचकांक मिलान के लिए डीबीई में डूबा हुआ होता है। (डी) मस्तिष्क के पूरे क्षेत्र को जेड-स्टैक की एक श्रृंखला के रूप में कैप्चर करें जिसे मस्तिष्क की एक व्यापक 3 डी छवि बनाने के लिए एक साथ टाइल किया जाएगा। यह तब 3 डी डेटासेट से 2 डी छवि बनाने के लिए अनुमानित जेड-अधिकतम तीव्रता हो सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. "वयस्क एमटीईआरटी-आरटीटीए की वंशावली ट्रेसिंग:: ओटेट-क्रे :: 3 सप्ताह की नाड़ी और डॉक्सीसाइक्लिन के 11 दिन के पीछा के बाद रोजा-एमटीएमजी माउस दिमाग"। (ए) वयस्क एमटीईआरटी-आरटीटीए के साफ़ मस्तिष्क अनुभाग:: ओटेट-क्रे :: इनसेट (एन = 3 पुरुष चूहों) के साथ दिखाए गए एमजीएफपी सिग्नल के विशिष्ट क्षेत्रों के साथ रोजा-एमटीएमजी माउस। (बी-सी) एमटीईआरटी-आरटीटीए की प्रतिनिधि छवि:: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी कोरॉइड प्लेक्सस एमजीएफपी + सीपीईसी (बी) और छोटे, बेहोश एमजीएफपी + सेल प्रकार (सी; एन = 4 पुरुष, एन = 6 महिलाएं)। (डी) एमटीईआरटी-आरटीटीए की प्रतिनिधि छवि:: ओटेट-क्रे:: सेरिबैलम (मंद) की आणविक परत में रोजा-एमटीएमजी अनुमस्तिष्क बर्गमैन ग्लिया (उज्ज्वल) और टोकरी कोशिकाएं; एन = 4 पुरुष, एन = 6 महिलाएं)। (ई) एमटीईआरटी-आरटीटीए की घ्राण ग्लोमेरुलर परत की प्रतिनिधि छवि:: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी दिमाग। बिंदीदार रेखाएं ग्लोमेरुलर डिब्बों (एन = 4 पुरुष, एन = 6 महिलाएं) को इंगित करती हैं। स्केल बार 100 μm हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विवो में वयस्क माउस मस्तिष्क के भीतर स्टेम कोशिकाओं को चिह्नित करने वाली ट्रिपल ट्रांसजेनिक वंश ट्रेसिंग माउस लाइन के निर्माण, उपयोग और विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। जब इम्यूनोस्टेनिंग या मस्तिष्क समाशोधन के साथ संयुक्त किया जाता है, तो मस्तिष्क में ट्रेस फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की पहचान और लक्षण वर्णन पूरा किया जा सकता है। यह तकनीक लेबल स्टेम कोशिकाओं की प्लास्टिक / पुनर्योजी / रीमॉडेलिंग क्षमता को समझने की क्षमता प्रदान करती है क्योंकि वे सक्रिय, माइग्रेट, अंतर या प्रसार करते हैं। जबकि थाइमिडीन-एच3 और बीआरडीयू के साथ लेबल प्रतिधारण के माध्यम से प्राप्त पिछले आंकड़ों ने निष्कर्ष निकाला कि वी-एसवीजेड, घ्राण बल्ब, और डेंटेट गाइरस के सबग्रेन्युलर ज़ोन वयस्क स्तनधारियों 2,3,4,5,6,7,8,43 में एकमात्र न्यूरोजेनिक मस्तिष्क क्षेत्र थे, अब यह समझा जाता है कि वयस्क न्यूरोजेनेसिस कॉर्टेक्स 44 में भी होता है, हाइपोथैलेमस45,46, और स्ट्रिएटम47,48,49, साथ ही संभावित रूप से अन्य उपन्यास निचे जिनका अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है। वयस्क ग्लियोजेनेसिस, वह प्रक्रिया जिसके द्वारा ग्लियाल अग्रदूत कोशिकाएं नवजात एस्ट्रोसाइट्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स बनाती हैं, पूरे मस्तिष्क में भीहोती हैं, और ग्लिया और न्यूरॉन्स को एक ही मल्टीपोटेंट स्टेम सेल से प्राप्त करने के लिए परिकल्पित किया जाता है। इन कारणों से, वंश अनुरेखण अध्ययन विभिन्न स्टेम सेल प्रकारों की भूमिका को समझने में अभिन्न अंग रहे हैं जो वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क में न्यूरॉन्स और ग्लिया को फिर से भरने और पुनर्जीवित करने में योगदान करते हैं (50 में समीक्षा की गई)।

वयस्क मस्तिष्क प्लास्टिसिटी में अध्ययन के लिए, इष्टतम आयु 12 सप्ताह की है, जब म्यूरिन मस्तिष्क ने विकास51 पूरा कर लिया है। डॉक्सीसाइक्लिन पल्स की लंबाई और बाद में पीछा करते समय, ब्याज की प्रक्रिया की समझ महत्वपूर्ण है, ताकि ब्याज की प्रक्रियाओं को होने की अनुमति देने के लिए पल्स-चेस समय काफी लंबा हो। उदाहरण के लिए, वी-एसवीजेड में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एएनएससी) से घ्राण बल्ब में नवजात न्यूरॉन्स का निर्माण लगभग 4 सप्ताह है, जैसा कि पिछले वंश अनुरेखण अध्ययनों52 द्वारा निर्धारित किया गया है। एक पल्स-चेस अध्ययन जो वी-एसवीजेड में एएनएससी को लेबल करेगा, इसलिए वी-एसवीजेड में एएनएससी को विभाजित करने की अनुमति देने के लिए उस समय सीमा के भीतर होना चाहिए, इन एएनएससी के लिए मध्यवर्ती सेल प्रकारों में अंतर करने के लिए, और इन मध्यवर्ती सेल प्रकारों के लिए घ्राण बल्ब में माइग्रेट करने और वयस्क जन्मे न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए। पीछा करने की लंबाई उस समय की मात्रा निर्धारित करेगी जो लेबल कोशिकाओं और उनकी संतानों को अपने प्रवास और भेदभाव को जारी रखना चाहिए, हालांकि ये प्रक्रियाएं नाड़ी के दौरान भी होंगी। एक साथ लिया गया, इसमें शामिल प्रक्रियाओं को समझना महत्वपूर्ण है, क्योंकि प्रत्येक वंश अनुरेखण प्रयोग की समयरेखा को उचित प्रक्रियाओं के लिए अनुमति देनी चाहिए।

जबकि यह पांडुलिपि टेट-ऑन प्रणाली का विवरण देती है, अन्य वंश अनुरेखण ट्रांसजीन मौजूद हैं जिनका उपयोग किया जा सकता है। क्रेयरटी 2 ट्रांसजीन एक क्रे रिकॉम्बिनेज की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है जो केवल टैमोक्सीफेन या 4-ओएचटी, एक टैमोक्सीफेन व्युत्पन्न की उपस्थिति में सक्रिय है। जब इस क्रे को ब्याज के प्रमोटर द्वारा विनियमित किया जाता है, तो 4-ओएचटी या टैमोक्सीफेन प्रशासन केवल उन कोशिकाओं में क्रे पुनर्संयोजन का उत्पादन करेगा जो उस प्रमोटर को व्यक्त करते हैं। जब रोजा-एलएसएल-जीएफपी या रोजा-एमटीएमजी जैसे रिपोर्टर जीन के साथ जोड़ा जाता है, तो क्रे-लॉक्स पुनर्संयोजन अमिट रूप से उन कोशिकाओं को चिह्नित करेगा जो टैमोक्सीफेन प्रशासन के दौरान क्रे को व्यक्त करते हैं। इस प्रणाली का एक नकारात्मक पक्ष टैमोक्सीफेन का उपयोग है, जिसका प्रसवपूर्व और वयस्क दिमाग दोनों में न्यूरोजेनेसिस पर लंबे समय तक चलने वाला प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है17. इस कारण से, क्रीयरटी 2 लाइनों के साथ वंश अनुरेखण अध्ययनों को शामिल चेतावनियों पर विचार करने की आवश्यकता होगी।

वयस्क मस्तिष्क में वंश अनुरेखण अध्ययन अक्सर स्टेम कोशिकाओं जैसे नेस्टिन के मार्करों या एनजी 253,54 सहित ग्लियाल अग्रदूत कोशिकाओं के मार्करों के साथ किया जाता है। जबकि परिणामी डेटा नवजात परिपक्व सेल प्रकारों में इन कोशिकाओं के कारोबार और भेदभाव को इंगित करता है, वयस्क मस्तिष्क में विभिन्न अन्य सेल प्रकारों द्वारा इन मार्करों की अभिव्यक्ति भ्रमित हो सकती है। उदाहरण के लिए, नेस्टिन, माइटोसिस55 में शामिल एक मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन, परिपक्व न्यूरॉन्स56 और मेनिंजियल सेल प्रकार57 द्वारा भी व्यक्त किया जाता है। अन्य स्टेम सेल मार्करों में ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) 58,59, और ग्लूटामेट एस्पार्टेट ट्रांसपोर्टर 1 (जीएलएएसटी) 60 शामिल हैं, जो पूरे वयस्क मस्तिष्क में एस्ट्रोसाइट्स द्वारा व्यक्तकिए जाते हैं। इस कारण से, अतिरिक्त मार्करों के साथ वंश अनुरेखण अध्ययन की आवश्यकता है। जैसा कि हम मस्तिष्क में वयस्क प्लास्टिसिटी के व्यापक प्रभाव के बारे में अधिक सीखते हैं, कोशिकाओं का लक्षण वर्णन और विश्लेषण जो इन प्रक्रियाओं में भूमिका निभाते हैं और उनकी संतान न्यूरोडीजेनेरेटिव स्वास्थ्य में शामिल न्यूरोजेनिक और ग्लियोजेनिक मार्गों की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण रूप से महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

डायना कार्लोन (बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) और डॉ मैथ्यू लिन्स (जोसलिन डायबिटीज सेंटर; मेन मेडिकल सेंटर रिसर्च इंस्टीट्यूट) एमटीईआरटी-आरटीटीए जानवरों का उपयोग करके मार्गदर्शन के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent Agilent S080983-2
Antigen Retrieval Solution Agilent S2367
anti-GFP antibody Invitrogen A2311 Use at 1:500-1:000
Acetone Fisher Scientific A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J The Jackson Laboratory JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J The Jackson Laboratory JAX:007676
Blocking Solution (IHC) Millipore Sigma 20773
Blunt needle BSTEAN X0012SYHIV
Coronal brain block Braintree BS-2000C
Cover slip Corning 2850-22
Cryostat Leica CM1900
DAPI Sigma-Aldrich D564
Dibenzyl ether Millipore Sigma 33630
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Doxycycline Hyclate Sigma-Aldrich D9891
Glycine Bio-Rad 161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa Sigma-Aldrich H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative Amresco H120 This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich 516813
IHC Select TBS Rinse Buffer Millipore Sigma 20845
Ketamine Westward 0143-95095-10 This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Milipore Block Millipore 20773
Mounting medium Millipore Sigma 5013
Optimal Cutting Temperature Solution Sakura 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Solution (10X) Teknova P0496
Sagittal brain block Braintree RBM-2000S
Saline Braun S8004-5264
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Sudan (Typogen) Black Millipore Sigma 199664
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 186562
Tissue cartridge Simport M512
Triton X-100 Bio-Rad 1610407
Tween-20 Millipore Sigma 655205
Xylazine AnaSed sc-362950Rx

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तंत्रिका विज्ञान अंक 183
वयस्क माउस मस्तिष्क में प्रेरक फ्लोरोसेंटली-लेबल स्टेम सेल की वंशावली अनुरेखण
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Jensen, G. S., Willows, J. W.,… More

Jensen, G. S., Willows, J. W., Breault, D. T., Townsend, K. L. Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain. J. Vis. Exp. (183), e63998, doi:10.3791/63998 (2022).

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