Teste de SARS-CoV-2 em larga escala utilizando saliva e agrupamento de amostras de transposição

Joseph R. Patterson; Allyson Cole-Strauss; Nathan Kuhn; Carlene Mercier; Joseph Kochmanski; John A. Gerlach; Rhiannon M. LeVeque; Kerri A. Neugebauer; Kayla N. Conner; Jasper Gomez; Mark G. Hennes; Kaje’ne E. Thompson; Destinee L. Rytlewski; Chloe C. Bigwood; Amy Scharmen; Gabriel Simjanovski; Cassidy Riley; Jessica Donaldson; Dilann Yasin; Najwa Kouja; Zaria Contejean; Michaela Burnett; Shakhlo Aminova; Nat Ato Yawson; Simran B. Singh; Osama M. Alian; Carson D. Broeker; Erin K. Zaluzec; Morgan ONeill; Birgit Puschner; Aron Sousa; Laura Bix; Brian Jespersen; Claudia Holzman; Jade Mitchell; Ryan Julien; Yesim Askin; Danielle Barnes; Purna Durshanpalli; Doug Krum; Rett Weber; Morgan Patterson; Becky Anderson; Ryan Hunt; Benjamin O’Brien; Andrew Umstead; John S. Beck; Irving E. Vega; Caryl E. Sortwell; Jack W. Lipton

doi:10.3791/64008

Method Article

Teste de SARS-CoV-2 em larga escala utilizando saliva e agrupamento de amostras de transposição

DOI:

10.3791/64008

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June 23rd, 2022

Joseph R. Patterson¹^,²^,³ , Allyson Cole-Strauss¹^,²^,³ , Nathan Kuhn¹^,² , Carlene Mercier³^,⁴ , Joseph Kochmanski¹^,² , John A. Gerlach⁵ , Rhiannon M. LeVeque³^,⁴ , Kerri A. Neugebauer³^,⁴^,⁶ , Kayla N. Conner³^,⁴ , Jasper Gomez³^,⁴ , Mark G. Hennes³^,⁴ , Kaje’ne E. Thompson³^,⁴ , Destinee L. Rytlewski³^,⁴ , Chloe C. Bigwood³^,⁴ , Amy Scharmen³^,⁴ , Gabriel Simjanovski³^,⁴ , Cassidy Riley³^,⁴ , Jessica Donaldson³^,⁴ , Dilann Yasin³^,⁴ , Najwa Kouja³^,⁵ , Zaria Contejean³^,⁴ , Michaela Burnett³^,⁴ , Shakhlo Aminova³^,⁴ , Nat Ato Yawson³^,⁴^,⁷ , Simran B. Singh³^,⁴ , Osama M. Alian³^,⁴ , Carson D. Broeker³^,⁴^,⁸ , Erin K. Zaluzec³^,⁴^,⁷ , Morgan ONeill³^,⁴^,⁹ , Birgit Puschner¹⁰ , Aron Sousa² , Laura Bix¹¹ , Brian Jespersen² , Claudia Holzman¹² , Jade Mitchell¹³ , Ryan Julien¹³ , Yesim Askin¹⁴ , Danielle Barnes¹⁴ , Purna Durshanpalli¹⁴ , Doug Krum¹⁴ , Rett Weber¹⁴ , Morgan Patterson¹⁴ , Becky Anderson¹⁴ , Ryan Hunt¹⁴ , Benjamin O’Brien¹⁴ , Andrew Umstead¹^,² , John S. Beck¹^,² , Irving E. Vega¹^,² , Caryl E. Sortwell¹^,² , Jack W. Lipton¹^,²

Summary

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O protocolo destina-se a servir como um modelo para universidades e outras organizações que consideram testes em larga escala para SARS-CoV-2 ou desenvolvem planos de preparação para futuros surtos virais.

Abstract

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A identificação e o isolamento de indivíduos contagiosos, juntamente com a quarentena de contatos próximos, são essenciais para retardar a propagação do COVID-19. Os testes em larga escala com capacidade de vigilância ou triagem para portadores assintomáticos de COVID-19 fornecem dados sobre a disseminação viral e a capacidade de acompanhamento para testar rapidamente os indivíduos durante suspeitas de surtos. O programa de detecção precoce de COVID-19 da Michigan State University tem utilizado testes em larga escala em uma capacidade de vigilância ou triagem desde o outono de 2020. Os métodos adaptados aqui aproveitam a confiabilidade, o grande volume de amostra e os benefícios de autocoleta da saliva, combinados com um esquema de agrupamento bidimensional de conservação de reagentes e econômico. O processo foi projetado para ser adaptável à escassez de suprimentos, com muitos componentes dos kits e do ensaio facilmente substituídos. Os processos descritos para coleta e processamento de amostras de SARS-CoV-2 podem ser adaptados para testar futuros patógenos virais expressos de forma confiável na saliva. Ao fornecer este plano para universidades ou outras organizações, planos de preparação para futuros surtos virais podem ser desenvolvidos.

Introduction

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A pandemia de COVID-19, causada pelo vírus SARS-CoV-2, causou a morte de mais de 6,2 milhões de pessoas até o momento, com números aumentando a cada dia¹. O padrão-ouro de teste para SARS-CoV-2 é a PCR quantitativa em tempo real (RT-q), com primers projetados para atingir o genoma viral, como nucleocapsídeo, envelope, pico e genes de RNA polimerase dependentes de RNA². No início da pandemia, faltava capacidade suficiente para testes de SARS-CoV-2. Surgiu da falta de ensaios validados, componentes de teste, pessoal clínico e uma infraestrutura despreparada para se expandir rapidamente par....

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Protocol

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Os estudos realizados para otimizar os métodos do Programa de Detecção Precoce foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Michigan State University. Todas as figuras foram reproduzidas com amostras artificiais e são representativas dos resultados humanos observados. Nenhum dado, informação ou resultado mostrado no manuscrito é de qualquer participante do Programa de Detecção Precoce da Michigan State University.

1. Produção de kits

NOTA: Durante a montagem do kit, use máscaras, luvas, proteção para os olhos e jalecos o tempo todo para evitar a contam....

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Results

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A grande maioria das amostras recebidas pelo laboratório até o momento foi aceita e passou na etapa inicial de controle de qualidade visual. A necessidade de rejeitar uma amostra é limitada a razões que podem influenciar negativamente o processamento da amostra e/ou os resultados gerais da amostra. Especificamente, volume incorreto no tubo, consistência ou cor não natural para a saliva, ausência de grânulos de cerâmica usados para auxiliar na homogeneização da amostra e códigos de barras ausentes são motivos para rejeita.......

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Discussion

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Durante o processamento da amostra, há etapas que requerem atenção cuidadosa. A etapa inicial de controle de qualidade, que analisa o volume da amostra, consistência, cor e presença de grânulos adicionados, é fundamental para o sucesso geral do processo. Tubos com amostras que não contêm a quantidade correta de saliva podem produzir um falso negativo, pois pouca saliva resultaria em material genético insuficiente; por outro lado, muita saliva não estaria na proporção correta com o tampão.......

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Disclosures

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Os autores não têm divulgações financeiras sobre os métodos, suprimentos, equipamentos ou reagentes.

Acknowledgements

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Os autores gostariam de agradecer aos participantes dos estudos aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Michigan State University usados para otimizar os métodos (STUDY00004265, STUDY00004383, STUDY00005109), bem como aqueles que saíram para coletar amostras usadas para testar os métodos (Dra. Katie Miller, Anna Stoll, Brian Daley, Dra. Claudia Finkelstein). Este esforço foi apoiado pela Michigan State University.

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
1 Passo MM, sem ROX	Thermo Fisher	A28523
1,2 mlPlacas de poço profundo	Fisher	AB0564
Reservatórios de reagentes de 100 mL	Corning	4872
Contas de cerâmica de 2,8 mm	OMNI	19-646
25 ml cônico com tampa de rosca	VWR	76338-496
50mL V reservatórios de fundo	Costar	4870
5430-Centrífuga de alta velocidade	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 tubos de tira para QuantStudio	tecnologias de vida	4316567
Beta Mercaptoetanol	Fisher	AC125472500
Etanol 200 Prova, Grau de Biologia Molecular	Fisher	BP28184
Placa de reação rápida e clara de 96 poços Microamp Endura Optical com tecnologias de vida de código de barras		4483485
Placa Microamp Fast Optical de 96 poços	Fisher	4346906
Mini Microcentrífuga	Corning Medical	6770
para tubos de tira	Life Technologies	AB-1820
Optical Film	Thermo Fisher
Filme de vedação de placa PCR 4311971 Fisher		AB-0558
	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Sistema de PCR em tempo real, 96 poços, 0,1 mL	Thermo Fisher	A28136
Confirmação rápida do kit viral de RNA	Zymo	R1035
, 100ml	DOT	229298
Shield	Zymo	R1200-1L
	Fisher	180000
Taqpath RTPCR Kit de COVID19	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrífuga	Thermo Fisher	75009525
Pipeta de transferência	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
Misturador de Vórtice	Fisher	2215414

Tampas ópticas Semi-contornado Reservatório de reagente Sacos pequenos de risco biológico

References

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WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , Available from: https://covid19.who.int/ (2022).
John Hopkins Center for Health Security. Center for Health Security. Comparison of National RT-PCR primers, probes, and protocols for SARS-CoV-2 diagnostics. John Hopkins Center for Health Security. , Centerforhealthsecurity.Org 5(2020).
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