Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Resumo

Visualizar a mielinização é um objetivo importante para muitos pesquisadores que estudam o sistema nervoso. CARS é uma técnica compatível com a imunofluorescência que pode fotografar nativamente lipídios dentro do tecido, como o cérebro, iluminando estruturas especializadas, como a mielina.

Resumo

A espectroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) é uma técnica classicamente empregada por químicos e físicos para produzir um sinal coerente de vibrações de assinatura de moléculas. No entanto, essas assinaturas vibracionais também são características de moléculas dentro do tecido anatômico, como o cérebro, tornando-o cada vez mais útil e aplicável para aplicações de Neurociência. Por exemplo, o CARS pode medir lipídios por ligações químicas especificamente excitantes dentro dessas moléculas, permitindo a quantificação de diferentes aspectos do tecido, como a mielina envolvida na neurotransmissão. Além disso, em comparação com outras técnicas tipicamente usadas para quantificar a mielina, o CARS também pode ser configurado para ser compatível com técnicas de imunofluorescência, permitindo a co-marcação com outros marcadores, como canais de sódio ou outros componentes da transmissão sináptica. As alterações da mielinização são um mecanismo inerentemente importante em doenças desmielinizantes, como a esclerose múltipla ou outras condições neurológicas, como a Síndrome do X Frágil ou os transtornos do espectro do autismo, é uma área emergente de pesquisa. Em conclusão, o CARS pode ser utilizado de maneiras inovadoras para responder a questões prementes em Neurociência e fornecer evidências de mecanismos subjacentes relacionados a muitas condições neurológicas diferentes.

Introdução

Os potenciais de ação são a unidade básica de informação no cérebro, e a propagação do potencial de ação através dos axônios constitui um pilar do processamento da informação ^1,2,3. Os neurônios normalmente recebem entradas aferentes de vários outros neurônios e integram essas entradas dentro de uma determinada janela de tempo estreita ^4,5. Portanto, os mecanismos de propagação do potencial de ação nos axônios têm recebido uma quantidade significativa de atenção dos pesquisadores.

Ao se propagar através de um axônio, um potencial de ação é regenerado repetidamente ao longo do axônio para garantir uma propagação confiável⁶. Na maioria dos neurônios de vertebrados mandibulares (gnatohostomas) os axônios são cercados por uma bainha de mielina, que é uma substância rica em lipídios produzida por oligodendrócitos próximos ou células de Schwann, que são tipos de células gliais (revisadas em ^7,8). Esta bainha de mielina isola eletricamente o axônio, reduzindo sua capacitância e permitindo a propagação do potencial de ação de forma eficiente, rápida e com menor consumo de energia. A mielina não cobre o axônio uniformemente, mas revestia o axônio em segmentos que têm lacunas curtas entre eles, chamados de nós de Ranvier (revisado em ^9,10). Tanto a espessura da mielinização, que controla o nível de isolamento elétrico de um axônio, quanto o espaçamento dos nós de Ranvier, que controlam a frequência com que os potenciais de ação são regenerados ao longo de um axônio, influenciam a velocidade de propagação do potencial de ação (revisado em¹¹).

Há um grande corpo de literatura sugerindo que a espessura da mielinização afeta a velocidade de propagação do potencial de ação em axônios^12,13,14. Além disso, alterações na mielinização axônica podem resultar em vários déficits do SNC 15,16,17,18,19,20,21. Portanto, não é surpreendente que o foco de muitos esforços de pesquisa envolva a medição e caracterização da mielinização axônica. As medições da espessura da mielina têm sido mais comumente feitas com microscopia eletrônica, uma técnica que requer uma quantidade significativa de preparação tecidual e é difícil de usar em combinação com a imuno-histoquímica. No entanto, existe também uma técnica mais rápida e simples para medir a mielinização axônica que é baseada na Espectroscopia Raman Anti-Stokes Coerente (CARS). Um laser CARS pode ser sintonizado em várias frequências e, quando sintonizado em frequências adequadas para excitar lipídios, a mielina pode ser fotografada sem a necessidade de rótulos adicionais²². A imagem lipídica pode ser combinada com imuno-histoquímica padrão, de modo que os lipídios possam ser fotografados juntamente com vários canais fluorescentes²³. A mielinização por imagem com CARS é significativamente mais rápida do que a microscopia eletrônica e tem uma resolução que é, embora menor que a EM, suficiente para detectar até mesmo pequenas diferenças na mielinização no mesmo tipo de axônios.

Protocolo

Todos os experimentos cumpriram todas as leis aplicáveis, diretrizes do National Institutes of Health e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado em Anschutz.

1. Animais

1. Use camundongos C57BL/6J (estoque #000664) (Mus musculus ) obtidos do Laboratório Jackson ou gerbilos mongóis (Meriones unguiculatus) originalmente obtidos do rio Charles.

2. Preparação de tecidos

1. Para perfusão transcárdica, overdose de espécies de roedores de interesse com pentobarbital (120 mg/kg de peso corporal) e transcardialmente perfundi-los com solução salina tamponada com fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na₂HPO 4) seguido de₄% de paraformaldeído (PFA)²⁴.
   1. Especificamente, abra o abdômen e a caixa torácica usando uma tesoura e segure a caixa torácica no lugar com pinça hemostática de Kelly para expor o coração.
   2. Insira uma agulha de 23 GA conectada a uma bomba de perfusão no ventrículo esquerdo e corte rapidamente o átrio direito usando uma tesoura fina.
   3. Administrar PBS através da bomba de perfusão e da agulha no coração por 10 minutos para limpar o cérebro e o corpo de sangue.
   4. Mude a bomba de perfusão para PFA a 4% por 10 minutos e verifique a rigidez dos membros e da cauda para confirmar o sucesso da perfusão.
2. Após a perfusão, decapite os animais e remova o cérebro do crânio. Mantenha os cérebros durante a noite em 4% de PFA antes de transferir para PBS. Incorpore os caules cerebrais em agarose a 4% (em PBS) e corte coronalmente usando um vibratome de 200 μm de espessura.

3. Coloração

1. Corte livre de cortes flutuantes para Nissl, para visualizar corpos celulares (1:100), em meio de anticorpos (meio AB: tampão fosfato 0,1 M (PB: 50 mM KH 2 PO 4,150 mM Na₂HPO₄), NaCl 150 mM, Triton-X 3 mM, albumina sérica bovina a 1% (BSA)) por 30 min à temperatura ambiente em um agitador de laboratório padrão²⁵.
   1. Proteja as seções da luz usando papel alumínio e/ou uma tampa. Comprimentos de onda de 550 nm ou menos são compatíveis com imagens CARS (Figura 1).
      NOTA: Embora não esperemos que o Triton-X ou outros reagentes tenham um impacto na imagem CARS de lipídios, controles adicionais com meios de anticorpos específicos podem ser justificados.
2. PONTO DE PAUSA: Armazene seções flutuantes livres (enquanto protegidas da luz) no PBS até a geração de imagens. Uma vez seccionado, imagens do cérebro seções dentro de 2 semanas.

Figura 1: A imagem CARS pode ser combinada com imagens imunofluorescentes. Os gráficos mostram que a imagem CARS ocorre no espectro de sinal vermelho de 660/640 nm²⁶. Esse comprimento de onda está suficientemente distante da faixa verde, azul ou UV, permitindo a combinação do sinal CARS com a imunofluorescência nessas faixas. Especificamente, o gráfico também indica a excitação e a emissão de Nissl marcada com fluoróforo azul, que foi combinado com CARS durante a coleta de resultados representativos para esta publicação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Imagens

NOTA: A configuração do laser CARS contém um laser de fibra que fornece o relógio de 80 MHz e um laser OPO (Optical Parametric Oscillator) com uma faixa ajustável de 770-990 nm com o feixe Stokes fixado em 1031 nm, que são necessários para coletar o sinal CARS. Há uma abertura para ambos os feixes.

1. Antes de trazer amostras para o microscópio, ligue e aqueça o laser CARS por pelo menos 1 h, alinhe o laser CARS e Koehler a óptica do condensador e o diafragma do microscópio para imagens CARS para frente.
   NOTA: Esta etapa é fundamental para o bom funcionamento da microscopia CARS.
   1. Para o alinhamento espacial dos dois feixes de laser (bomba e stokes), acesse os dois PSDs internos (detectores sensíveis à posição) através da GUI do laser CARS.
   2. Alcance o alinhamento temporal usando a função de atraso na GUI do laser CARS, que pode ajudar a sobrepor os pulsos dos dois lasers (bomba e stokes) que têm dispersões diferentes devido aos seus diferentes comprimentos de onda. Portanto, tanto a sobreposição temporal quanto a espacial dos feixes de bomba e stokes são feitas com a entrada do usuário através da GUI.
   3. Ajuste o periscópio externo (dois últimos espelhos da configuração) para centralizar os dois lasers espacialmente sobrepostos nos espelhos de cabeça de varredura do microscópio.
   4. Para uma melhor detecção CARS não descarada, certifique-se de que o condensador é Koehler-ed (o que significa que o condensador está centrado e focado no diafragma para obter iluminação uniforme)
2. Para imagens confocais de imunofluorescência e imagens CARS, ajuste o laser CARS, com detectores não descantados (NDDs) CARS para frente e epi, incorporando um microscópio confocal equipado com lasers visíveis para imagem de fluorescência (Figura 2).
3. Coloque seções em um prato de cultura com coverslip (para microscopia invertida), PBS para evitar que o tecido seque e um peso de vidro para manter o tecido perto do coverslip.
4. Tire z-stacks ou imagens únicas com um objetivo de água corrigido no infravermelho de 60X, 1,2 NA, que serve para a coleta do sinal CARS na direção epi e através de um condensador de 0,55 NA na direção para a frente para imagens de áreas cerebrais, como o núcleo medial do corpo trapézio (MNTB).
   1. Tire as imagens CARS em aproximadamente 600 mW de bomba/sonda e 300 mW de Stokes, usando a GUI do laser CARS. Esses valores de potência do laser são medidos internamente pelo sistema. As potências de ambos os lasers no local da amostra são inferiores a 25 mW e seguras para a amostra de tecido.
   2. Sobreponha a bomba e os feixes de Stokes espacial e temporalmente. Ajuste o OPO para 797,2 nm. Isso produz um comprimento de onda CARS de 650 nm. Devido ao nível de energia mais alto, o retorno resultante ao estado fundamental é anti-Stokes (deslocado para o azul) para a excitação.
   3. Capture o sinal CARS em detectores epi ou encaminhados não desdecantados usando filtros passa-banda (640-680 nm) seguidos de detecção sequencial do rótulo de imunofluorescência (neste caso, marcado fluorescentemente Nissl).
      NOTA: O marcador de soma neuronal Nissl não é capturado no filtro passa-banda CARS 640-680 nm, permitindo a combinação de fluorescência e imagem CARS nas imagens apresentadas abaixo.
   4. O CARS e a fluorescência não compartilham PMTs. Use essas configurações para obter o sinal lipídico ideal para visualizar seletivamente a mielinização na área do cérebro.
      CUIDADO: Proteja o usuário do feixe de laser
5. Salve as imagens como arquivos .oib, que podem ser importados para um programa de análise de imagem para quantificação adicional (Figura 3).

Figura 2: Diagrama de instrumentos CARS mostrando lasers CARS (setas vermelhas) e detecção epi e forward não descanned (NDD) incorporados em uma varredura a laser confocal. No NDD para a frente adquirimos CARS para ligações C-H (setas vermelhas escuras) e SHG (segunda generatina harmônica) a 515 nm (seta laranja). Em epi NDD, adquirimos CARS para ligações C-H (setas vermelhas escuras) e autofluorescência 2PE (emissão de dois fótons) (seta azul clara). Sequencialmente, imagens confocais de fluorescência podem ser adquiridas (setas verdes para laser visível, setas azuis para detecção confocal). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O CARS pode iluminar a mielina (magenta) no tecido cerebral (tronco encefálico) enquanto também cria imagens de Nissl (ciano) ou marcadores fluorescentes. Os dois painéis mostram resultados representativos de um cérebro de gerbil mongol (imagem única M. unguiculatus, Figura 3A,C,E) e rato (projeção máxima de pilha z M. musculus, Figura 2B,D,F), indicando que esta técnica pode ser usada em todas as espécies. Figura 3A,B mostrando Nissl em ciano, C,D mostram o sinal CARS em magenta, E,F combinam os sinais Nissl e CARS com cada painel para gerbil ou mouse, respectivamente. Ambos os conjuntos de imagens mostram uma seção do núcleo medial do corpo trapézio (MNTB) no tronco cerebral. Os neurônios do MNTB recebem entradas de axônios fortemente mielinizados, que terminam no cálice de held, um tipo de sinapse gigante²⁷. A barra de escala é de 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Uma das maiores vantagens da microscopia CARS em relação a outras técnicas é a compatibilidade com imagens fluorescentes²³. A Figura 1 mostra os espectros CARS em comparação com o Nissl marcado com marcador imunofluorescente mostrando pouca ou nenhuma sobreposição nos espectros. A Figura 2 ilustra a configuração do laser para o CARS em combinação com a microscopia confocal. A Figura 3 demonstra duas imagens r...

Discussão

Um crescente corpo de literatura enfatiza o papel da mielina na função cerebral 13,16,21,28. Além disso, sabemos que a espessura da mielinização e o padrão de mielinização podem mudar em várias condições neurológicas, como esclerose múltipla (revisada em²⁹), envelhecimento (revisada em^{30), autismo 20,31} e muitas ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anestésico:
1 mL seringa descartável com agulha 27 GA x 0.5"	Exel int	260040
Fatal +	Vortech
Surgery:
Spring Scissors - 8mm Ferramentas	de Ciência Fina	15024-10
Pinças padrão	Fine Science Tools	11027-12
Perfusion:
4% Paraformaldeído	Fisher Chemical	SF994 (CS)
Tesouras Finas - Sharp	Ferramentas de Fine Science	14063-11
Kelly hemostats	Fine Science Tools	13019-14
Millipore H2O
Ponta da agulha, 23 GA x 1"	BD deslizamento de precisão	305193
Solução salina tamponada com fosfato (PBS):
Cloreto de potássio	Sigma	P9333
Bomba monobase de fosfato de potássio	Sigma	P5655
com fluxo variável ou equivalente
Cloreto de sódio	Fisher Chemical	s271-1
Fosfato de sódio dibásico	Sigma	S7907
Dissecação: frasco de
50 mL com 4% PFA
Colher Química Bochem 180mm	Bochem	230331000
Tesoura Fina - Sharp	Fine Science Tools	14063-11
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15011-12
Par de pinças finas (Graefe)	Fine Science Tools	11050-10
Bandeja rasa de vidro ou plástico, aproximadamente 10" x 10"
Pinças padrão Tesoura Cirúrgica	Fine Science Tools	11027-12
- Blunt	Fine Science Ferramentas	14000-20
Fatiamento:
Agar, planta	RPI	9002-18-0
Vibratome	Leica	VT1000s
placa de	poço Alkali Sci.	TPN1048-NT
strong>Coloração:
AB Meio:			1n 1.000 mL de Millipore H2O
Tamponado com fosfato (PB):
Fosfato de potássio Monobase	Sigma	P5655
Fosfato de sódio Dibásico	Sigma	S7907
BSA (Albumina de soro bovino)	Sigma life science	A2153-100g
Cloreto de Sódio	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE  Picoemerald laser	Física de Picoesmeralda & Elektronik
Filtro passa-banda GmbH (420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
(500-530 nm)	passa-banda Chroma Technology HQ515/30m-2P
(640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
Microscópio confocal	Olympus	FV1000
Pipeta de transferência de corte	Fisher	13-711-7M
longpass dicróico 565 nm	Chroma Technology	565dcxr
longpass dicróico 585 nm	Chroma Technology	585dcxr
shortpass dicróico 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
prato de cultura com fundo de vidro	MatTek	P35G-0-10-C
peso do vidro (10 mm x 10 mm haste boro)	Allen Scientific Filtro de
680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS