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Artigo de método

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

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DOI:

10.3791/64026

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25 de agosto de 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Neste artigo

Resumo

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

Resumo

O citoesqueleto de actina, o principal maquinário mecânico da célula, media inúmeras atividades celulares físicas essenciais, incluindo deformação celular, divisão, migração e adesão. No entanto, estudar a dinâmica e a estrutura da rede actin in vivo é complicado pela regulação bioquímica e genética dentro das células vivas. Para construir um modelo mínimo desprovido de regulação bioquímica intracelular, o actin é encapsulado dentro de vesículas unilamellar gigantes (GUVs, também chamados lipossomos). Os lipossomos biomiméticos são do tamanho de células e facilitam uma visão quantitativa das propriedades mecânicas e dinâmicas da rede de citoesqueleto, abrindo uma rota viável para a biologia sintética de baixo para cima. Para gerar lipossomos para encapsulamento, utiliza-se o método de emulsão invertida (também chamado de método de transferência de emulsão), que é uma das técnicas mais bem sucedidas para encapsular soluções complexas em lipossomos para preparar vários sistemas de imitação celular. Com este método, uma mistura de proteínas de interesse é adicionada ao tampão interno, que é posteriormente emulsionado em uma solução de óleo mineral contendo fosfolipídio para formar gotículas lipídicas monocamadas. Os lipossomos desejados são gerados a partir de gotículas lipídicas de monocamadas que cruzam uma interface lipídica/óleo-água. Este método permite o encapsulamento de polímeros concentrados de actina nos lipossomos com componentes lipídudos desejados, abrindo caminho para a reconstituição in vitro de uma rede de citoesqueleto biomimicing.

Introdução

O citoesqueleto de actina desempenha um papel fundamental na construção da arquitetura intracelular da célula, coordenando a contratude de nível molecular e a geraçãode força 1,2,3. Como resultado, media inúmeras atividades celulares essenciais, incluindo deformaçãocelular 4,5, divisão6, migração 7,8 e adesão9. A reconstituição in vitro das redes actin ganhou enorme atenção nos últimos anos 10,11,12,13,14,15,16,17. O objetivo da reconstituição é construir um modelo mínimo da célula desprovida da complexa regulação bioquímica que existe dentro das células vivas. Isso oferece um ambiente controlável para sondar atividades intracelulares específicas e facilita a identificação e análise de diferentes componentes do citoesqueleto de actina18,19. Além disso, o encapsulamento de redes in vitro actin dentro de vesículas unilamellar gigantes fosfolipídicas (GUVs, lipossomos) fornece um espaço confinado, mas deformável, com um limite semi-permeável. Imita o microambiente fisiológico e mecânico do maquinário de actina dentro da célula 9,20,21,22.

Entre vários métodos para preparar lipossomos, o método de hidratação de filme lipídeído (também conhecido como método de inchaço) é uma das primeiras técnicas23. O filme lipídigo seco hidrata-se com a adição de tampões, formando bolhas membranous que eventualmente se tornam vesículas24. Para produzir vesículas maiores com maior rendimento, um método melhorado avançando a partir do método de hidratação cinematográfica, conhecido como método de eletroformação25, aplica um campo elétrico CA para promover eficientemente o processo de hidratação26. As principais limitações desses métodos baseados em hidratação para encapsulamento de actina são que ele tem baixa eficiência de encapsulamento de proteínas altamente concentradas, e só é compatível com composições lipídicas específicas24. A técnica de emulsão invertida, em comparação, tem menos limitações para componentes lipídicos e concentrações proteicas 20,27,28,29. Neste método, uma mistura de proteínas para encapsulamento é adicionada ao tampão aquoso interno, que é posteriormente emulsionado em uma solução de óleo mineral contendo lipídios, formando gotículas lipídicas-monocamadas. As gotículas lipídicas monocamadas então atravessam outra interface lipídica/óleo-água através da centrifugação para formar vesículas lipídicas bicamadas (lipossomos). Esta técnica provou ser uma das estratégias mais bem sucedidas para encapsulamento de actin 24,30. Separadamente, existem alguns métodos de dispositivo microfluido, incluindo o lançamento pulsado31,32, ejeção transitória da membrana33 e o método cDICE34. As semelhanças entre o método de emulsão invertida e o método microfluido são o solvente lipídico (óleo) que é utilizado e a introdução de interface lipídica/óleo-água para a formação do folheto externo de lipossomos. Em contrapartida, a geração de lipossomos pelo método microfluido requer uma configuração de dispositivos microfluidos e é acompanhada de óleo preso entre os dois folhetos da bicamada, o que requer um passo extra para a remoção do óleo35.

Neste manuscrito, utilizamos a técnica de emulsão invertida para preparar lipossomos encapsulando uma rede polimerizada de F-actin como usado anteriormente22. A mistura de proteínas para encapsulamento foi primeiramente colocada em um tampão com condições não polimerizantes para manter a actina em sua forma globular (G). Todo o processo foi realizado a 4 °C para evitar a polimerização da actina precoce, que mais tarde foi acionada permitindo que a amostra aquecesse à temperatura ambiente. Uma vez à temperatura ambiente, o actin polimeriza em sua forma de fistoso (F). Uma variedade de proteínas de ligação de actina pode ser adicionada à solução tampão aquosa interna para estudar funcionalidades e propriedades proteicas, fornecendo assim insights sobre sua interação com a rede actina e superfície da membrana. Este método também pode ser aplicado ao encapsulamento de várias proteínas de interesse36 e objetos grandes (micropartículas, microswimmers autopropulsores, etc.) perto do tamanho dos lipossomos finais28,37.

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Protocolo

1. Preparação de tampões e soluções proteicas

  1. Prepare o aquoso Tampão de Não Polimerização Interna (INP) em um volume total de 5 mL misturando 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM de sacarose e 0,2 mM ATP.
  2. Prepare o Mix de Proteínas (PM) adicionando proteínas ao tampão INP a 4 °C com as seguintes concentrações: 11,2 μM de G-actina não fluorescente, 2,8 μM de actina fluorescente e 0,24 μM Arp2/3 (Tabela de Materiais). Para formar uma camada F-actin, adicione gelsolina de 100 nM, cofilina de 4 μM e 2,2 μM VCA-His ao PM. Como experimento de controle, substitua a PM por 100 μg/mL de corante fluorescente (Tabela de Materiais).
  3. Prepare o aquoso Tampão de Polimerização Interna (IP) (aquos) em um volume total de 5 mL misturando 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP e 80 mM de sacarose.
  4. Prepare o Buffer Final (FB) misturando buffer INP (contendo PM) e tampão IP a uma proporção de volume de 1:1 para produzir a solução aquosa interna em um volume total de 30 μL que será encapsulado dentro do lipossomo.
  5. Prepare o aquoso Buffer Externo (OB) em um volume total de 150 μL misturando HEPES de 10 mM (pH 7.5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, ATP de 2mM, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM de glicose e 0,1 mg/mL β-caseína.
    NOTA: A osmolaridade do OB pode ser ajustada com glicose para garantir que a pressão osmótica da OB seja ligeiramente maior que a do FB (20-60 mOsm). A densidade do FB deve ser ligeiramente maior que a OB.

2. Preparação de lipossomos baseados nas técnicas de emulsão invertidas

  1. Prepare a mistura lipídica-óleo
    1. Adicione 100 μL de 25 mg/mL L-α-fosphasphatidylcholina (PC de ovo não fluorescente, também chamado de EPC, incluindo 1% DHPE) em um frasco de vidro. Evaporar clorofórmio com gás argônio, deixando um filme lipídedo sólido seco (2,5 mg) na parte inferior do frasco.
      1. Para formar uma camada F-actin, adicione 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl) ácido iminodiacético] sal de níquel succinyl} (DOGS-NTA-Ni) a uma razão de 10:1 de EPC para DOGS-NTA-Ni e misture antes da evaporação de cloroform.
    2. Adicione 2 mL de óleo mineral e sonicar a mistura lipídica-óleo à temperatura ambiente em um banho por 1h para suspender os lipídios.
      NOTA: A mistura lipídida-óleo após a sônica pode ser mantida por 1 semana a 4 °C. A ressarção é sugerida antes do uso.
  2. Prepare uma emulsão final de buffer em óleo (FB/óleo) para preparar gotículas lipídicas de monocamadas contendo a proteína de interesse.
    1. A 100 μL de mistura lipídica-óleo tomada em um tubo plástico, adicione 10 μL de FB. Certifique-se de que o FB está em uma gota.
    2. Usando uma seringa de vidro, desenhe a mistura lipídio-óleo-FB e aspire suavemente várias vezes para emulsificá-la; desenhe uma pequena quantidade de mistura lipídica-óleo primeiro, e depois a gota FB colocando a ponta da seringa na periferia da gotícula para quebrá-la em pequenas gotículas. Repita a aspiração para cima e para baixo até formar uma emulsão esbranquiçada e nebulosa.
  3. Coloque 30 μL de OB em um tubo plástico separado. Coloque 30 μL da mistura lipídica-óleo em cima de OB e deixe descansar por ~10 minutos para desenvolver uma monocameira lipídica na interface.
    NOTA: Se os lipídios estiverem carregados ou a proteína for incorporada, a duração desta etapa deve ser estendida38.
  4. Prepare os lipossomos
    1. Adicione cuidadosamente 50 μL da emulsão FB/óleo (etapa 2.2) à fase superior do óleo do tubo a partir da etapa 2.3.
    2. Centrifugar o tubo plástico a 100 x g por 15 minutos a 4 °C. Varie a velocidade de tempo e centrifugação para otimizar para a formação de lipossomos.
      NOTA: Após a centrifugação, a fase superior do óleo deve ser clara, e o OB inferior (contendo lipossomos) deve estar ligeiramente nublado.
    3. Remova cuidadosamente a fase do óleo por pipeta. Aspire volume extra, se necessário. Certifique-se de não colocar a ponta da pipeta na lateral do tubo para evitar criar um menisco de óleo em cima da fase liposesome.
    4. Com uma nova pipeta, coloque lentamente a ponta da pipeta na fase inferior restante e aspire o volume aquoso para coletar lipossomos.
      NOTA: É melhor perder volume do que incorporar o óleo. A inclusão do óleo causará a ruptura de lipossomos, e os componentes internos serão liberados no tampão externo. Corte a ponta de uma pipeta para reduzir a tesoura.

3. Observação da microscopia

  1. Despeje 100 μL de OB no poço de uma câmara de incubação (placa de 4 poços contendo tampas redondas de 12 mm). Deposite suavemente os lipossomos coletados (passo 2.4.4) em OB e, em seguida, coloque outra mancha de cobertura em cima da câmara.
    NOTA: O OB contém a β-caseína para passivar a superfície de vidro e minimizar a aderência entre os lipossomos20.
  2. Observe lipossomos com um microscópio confocal usando um objetivo de imersão de óleo de 63x. Use linhas laser de 488 nm, 647 nm e 561 nm para observar lipídios fluorescentes rotulados, corante fluorescente encapsulado e actina fluorescente encapsulada, respectivamente. Capture os quadros de interesse e salve as imagens no formato TIFF.
  3. Processe e analise imagens em ImageJ/Fiji39. Para novos usuários do ImageJ/Fiji, um tutorial online está disponível (ver Tabela de Materiais).
    1. Abra o arquivo TIFF usando o software ImageJ/Fiji.
    2. Vá para > de imagem Ajuste > brilho/contraste. Ajuste o brilho e o contraste da imagem na escala desejada ajustando as configurações Mínima e Máxima , e os controles deslizantes Brilho e Contraste .
    3. Clique na ferramenta de seleção Retângulo na barra de ferramentas e selecione a região de interesse (ROI). Vá para Image > Crop para cortar o ROI.
    4. Vá analisar > escala de conjunto. Na janela pop-up, digite 1.0 no campo Proporção de Pixel e coloque μm como a unidade de comprimento. No campo Distância no Pixels , digite a largura da imagem em pixels. No campo Distância Conhecida , digite a largura real da imagem em mícrons.
    5. Para medir o tamanho do lipossomo, Usando a ferramenta de seleção oval na barra de ferramentas, desenhe um círculo ao longo da borda do lipossomo. Vá analisar > Medida para medir a área do círculo, a partir da qual o diâmetro do lipossomo pode ser calculado.

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Resultados

A preparação de lipossomos baseados na técnica de emulsão invertida é ilustrada graficamente e esquematicamente na Figura 1.

Primeiro, foram preparados lipossomos vazios (nus) (~5-50 μm de diâmetro) compostos de fosfolipídio (EPC) e lipídio fluorescente (DHPE). Um corante fluorescente vermelho brilhante foi encapsulado dentro de lipossomos nus como um experimento de controle. Se uma monocamada lipídica se formou com sucesso no periférico da gotícula poderia ser de...

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Discussão

Várias etapas-chave determinam o sucesso de um alto rendimento de lipossomos durante o processo de preparação. Para dissolver completamente o filme lipíduo no óleo, a amostra deve ser sônica até que o filme lipídudo na parte inferior do frasco de vidro desapareça completamente. Após a sônica, a mistura lipídica-óleo deve ser armazenada durante a noite à temperatura ambiente em condições escuras para que as moléculas lipídicas se dispersem por mais29. A mistura pode ser armazenada a 4 °C por até um...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Reconhecemos o financiamento ARO MURI W911NF-14-1-0403 a M.P.M., os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 1R01GM126256 a M.P.M., os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) U54 CA209992, NIH RO126256, NIH U54 CA209992, Universidade de Michigan / Genentech, SUBK00016255 e Human Frontiers Science Program (HFSP) concedem o número RGY0073/2018 a M.P.M. Qualquer opinião, achados, conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões do ARO, NIH ou HFSP. S.C. reconhece discussões frutíferas com V. Yadav, C. Muresan e S. Amiri.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sal de níquel 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[n(5-amino-1-carboxipentil)iminodiacético]succinil} (DOGS-NTA-Ni) Avanti Lipídios Polares Inc.231615773Níquel Lipídio
1,4-Diazabiciclo[2.2.2]octanagemSigmaD27802-25GDABCO
Proteína de actina (>99% pura): músculo esquelético de coelhoCitoesqueleto, IncAKL99-Dnão fluorescente G-actina
Proteína de actina (rodamina): músculo esquelético de coelhoCitoesqueleto, IncAR05actina marcada com fluorescência
Adenosina 5′-trifosfato hidrato de sal dissódicoSigmaA2383-10GATP
Alexa Fluor 647 coranteThermoFisherCorante fluorescente
Andor iQ3Andor Technologiessoftware de controle e aquisição para microscópio confocal
Arp2/3 Complexo de Proteínas: Cérebro SuínoCitoesqueleto, IncRP01P-AArp 2/3
Cloreto de cálcio di-hidratadoSigma10035048Câmaras de CaCl2
Chamlide (4 poços para lamínula redonda de 12 mm)Câmara de incubaçãoQuorum Technologies
Proteína Cofilina: recombinante humano CitoesqueletoIncCF01-Ccofilina
Microscópio Confocal (63&vezes; objetiva de imersão em óleo)Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRASigmaG7528glicose
DitiotreitolDOT Scientific DSD11000-10DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens RecombinantCytoskeleton, IncHPG6gelsolin
Hamilton 1750 Seringa à prova de gás, 500 µ L, agulha cimentada, 22 G, ponta cônica de 2Seringa de vidroCole-ParmerUX-07940-53
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ/Fijihttps://imagej.net/tutorials/
L-alfa-fosfatidilcolinaAvanti Polar Lipids Inc.97281442EPC
Cloreto de magnésioSigma7786303MgCl2
Óleo mineral, BioReagente, para biologia molecular, óleo leveSigma8042475óleo mineral
N-WASP fragmento WWA (aa400– 501, VCA-His)VCA-His é purificado usando protocolo de laboratório. O protocolo pode ser fornecido mediante solicitações razoáveis
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina (Oregon Green 488 DHPE)Thermo FisherO12650DHPE
Cloreto de potássioSigma7447407KCl
SacaroseSigma57-50-1sacarose
β-Caseína de leite bovinoSigmaC6905-250MG
fluorescente da , "

Referências

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