In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

Sheng Chen; Zachary Gao Sun; Michael P. Murrell

doi:10.3791/64026

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Artigo de método

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

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DOI:

10.3791/64026

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25 de agosto de 2022

Sheng Chen¹ , Zachary Gao Sun²^,³ , Michael P. Murrell¹^,²^,³

¹Department of Biomedical Engineering, Yale University, ²Systems Biology Institute, Yale University, ³Department of Physics, Yale University

Neste artigo

Resumo

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

Resumo

O citoesqueleto de actina, o principal maquinário mecânico da célula, media inúmeras atividades celulares físicas essenciais, incluindo deformação celular, divisão, migração e adesão. No entanto, estudar a dinâmica e a estrutura da rede actin in vivo é complicado pela regulação bioquímica e genética dentro das células vivas. Para construir um modelo mínimo desprovido de regulação bioquímica intracelular, o actin é encapsulado dentro de vesículas unilamellar gigantes (GUVs, também chamados lipossomos). Os lipossomos biomiméticos são do tamanho de células e facilitam uma visão quantitativa das propriedades mecânicas e dinâmicas da rede de citoesqueleto, abrindo uma rota viável para a biologia sintética de baixo para cima. Para gerar lipossomos para encapsulamento, utiliza-se o método de emulsão invertida (também chamado de método de transferência de emulsão), que é uma das técnicas mais bem sucedidas para encapsular soluções complexas em lipossomos para preparar vários sistemas de imitação celular. Com este método, uma mistura de proteínas de interesse é adicionada ao tampão interno, que é posteriormente emulsionado em uma solução de óleo mineral contendo fosfolipídio para formar gotículas lipídicas monocamadas. Os lipossomos desejados são gerados a partir de gotículas lipídicas de monocamadas que cruzam uma interface lipídica/óleo-água. Este método permite o encapsulamento de polímeros concentrados de actina nos lipossomos com componentes lipídudos desejados, abrindo caminho para a reconstituição in vitro de uma rede de citoesqueleto biomimicing.

Introdução

O citoesqueleto de actina desempenha um papel fundamental na construção da arquitetura intracelular da célula, coordenando a contratude de nível molecular e a geração^{de força} ^1,2,3. Como resultado, media inúmeras atividades celulares essenciais, incluindo deformação^celular ^4,5, divisão⁶, migração ^7,8 e adesão⁹. A reconstituição in vitro das redes actin ganhou enorme atenção nos últimos anos 10,11,12,13,1....