Artigo de método

Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis

DOI:

10.3791/64027

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22 de julho de 2022

 ,  , 
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve uma interrupção de 96 poços de caenorhabditis colonizada individualmente elegans após paralisia fria e branqueamento superficial para remover bactérias externas. A suspensão resultante é emplacada em placas de ágar para permitir quantificação precisa e média de carga bacteriana em um grande número de vermes individuais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O nematode Caenorhabditis elegans é um sistema modelo para interações hospedeiro-micróbio e hospedeiro-microbioma. Muitos estudos até o momento usam digerir em lote em vez de amostras individuais de vermes para quantificar a carga bacteriana neste organismo. Argumenta-se aqui que a grande variabilidade inter-individual observada na colonização bacteriana do intestino C. elegans é informativa, e que os métodos de digestão em lote descartam informações que são importantes para uma comparação precisa entre as condições. Como descrever a variação inerente a essas amostras requer um grande número de indivíduos, um conveniente protocolo de placa de 96 poços para interrupção e revestimento de colônia de vermes individuais é estabelecido.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A heterogeneidade nas associações hospedeiras-micróbios é observada de forma onipresente, e a variação entre os indivíduos é cada vez mais reconhecida como fator contribuinte nos processos de nível populacional desde a concorrência e a convivência1 até a transmissão da doença 2,3,4. Em C. elegans, a "heterogeneidade oculta" dentro das populações isogênicas tem sido observada repetidamente, com sub-populações de indivíduos apresentando fenótipos distintos na resposta ao choque térmico 5,6, envelhecimento e vida útil 7,8,9,10,11, e muitos outros aspectos da fisiologia e desenvolvimento12 . A maioria das análises que tentam identificar a estrutura sub-populacional fornecem evidências para duas subsédias em populações experimentais de vermes isogênicos e sincronizados 5,7,8, embora outros dados sugiram a possibilidade de distribuições dentro da população de traços em vez de grupos distintos 7,12,13 . De relevância aqui, observa-se uma heterogeneidade substancial nas populações intestinais mesmo dentro de populações isogênicas de vermes colonizados a partir de uma fonte compartilhada de micróbios 13,14,15,16, e essa heterogeneidade pode ser ocultada pelas medições de digestão em lote que são amplamente utilizadas 17,18,19,20 para quantificação bacteriana no verme.

Este trabalho apresenta dados que sugerem uma necessidade de maior dependência de medições de um único verme na associação hospedeiro-micróbio, bem como protocolos para aumentar a precisão e o throughput na interrupção de um único worm. Estes protocolos são projetados para facilitar a interrupção mecânica de um grande número de C. elegans individuais para quantificação de carga bacteriana viável, ao mesmo tempo em que fornecem melhor repetibilidade e menor esforço por amostra do que a interrupção baseada em pilão de vermes individuais. Uma etapa recomendada de purificação intestinal, onde os vermes são autorizados a se alimentar de E. coli morto pelo calor antes da preparação para a interrupção, está incluído para minimizar contribuições de bactérias recém-ingeridas e outras bactérias transitórias (não aderidas). Estes protocolos incluem um método de paralisia fria para limpar a cutícula com um tratamento de alvejante superficial de baixa concentração; o branqueamento da superfície pode ser usado como um passo preparatório na interrupção de um único verme ou como um método para preparar vermes vivos e externamente livres de germes. Este método de branqueamento superficial é suficiente para remover uma ampla gama de micróbios externos, e o tratamento a frio fornece uma alternativa à paralisia convencional à base de levamisola; Enquanto o levamisole será preferido para experimentos sensíveis ao frio, a paralisia fria minimiza as contribuições para fluxos de resíduos perigosos e permite a rápida retomada da atividade normal. Enquanto o protocolo completo descreve um experimento de laboratório onde os vermes são colonizados com bactérias conhecidas, os procedimentos para limpar vermes e interrupção de um único verme podem ser facilmente aplicados a vermes isolados de amostras selvagens ou colonizados em experimentos de microcosmo. Os protocolos descritos aqui produzem bactérias vivas extraídas do intestino de verme, adequadas para chapeamento e quantificação de unidades formadoras de colônias (UFC) em vermes individuais; para análise da comunidade intestinal baseada em sequenciamento, devem ser adicionadas etapas subsequentes de lise celular e extração de ácido nucleico a esses protocolos.

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Protocolo

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Os vermes utilizados nesses experimentos foram obtidos do Centro Genético de Caenorhabditis , que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 é do tipo selvagem. Os mutantes DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) e daf-2(e1370) III (CGC CB1370) são usados para ilustrar diferenças na carga bacteriana intestinal.

HT115(DE3) E. coli carregando o vetor pos-1 RNAi é da biblioteca Ahringer21. A coleção MYb de C. elegans native gut bacteria22 foi obtida do laboratório de Schulenburg. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR é deste laboratório23. Pseudomonas mosselii foi isolado neste laboratório. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP foi obtido do laboratório LaRock na Universidade em Emory.

Todos os buffers e mídia de worm são preparados de acordo com a literatura publicada anteriormente24 com pequenas modificações (ver Arquivo Suplementar 1).

1. Preparação de C. elegans estéreis sincronizados

NOTA: Nesta seção, procedimentos passo a passo são descritos para gerar uma população sincronizada de vermes adultos reprodutivamente estéreis. Alimentando-se de placas pos-1 RNAi é usado aqui para evitar a produção de descendentes porque essa interferência é letal embrionária; Larvas L1 levantadas até a idade adulta em pos-1 RNAi desenvolvem-se em hermafroditas que colocam ovos, mas esses ovos são inviáveis25. O protocolo de alimentação RNAi é como no capítulo "Genética reversa" do Wormbook26.

  1. Antes de sincronizar os worms, certifique-se de que novas placas NGM + pos-1 RNAi estejam disponíveis. As placas podem ser preparadas frescas da cultura líquida induzida concentrada (+Amp +IPTG) ou inoculadas como gramados em NGM + 100 μg/mL ampicillin + 1 mM IPTG e permitidas a crescer a 25 °C no escuro durante 1 dia27.
    NOTA: A carbenicilina (25 μg/mL) é frequentemente usada em vez de ampicillina em placas RNAi. A ampicillina é menos cara, mas menos estável; se utilizar ampicilina, as placas devem ser semeadas imediatamente uma vez secas e usadas o mais rápido possível (pode ser armazenada por <1 semana a 4 °C)27. A alta concentração de antibióticos recomendada aqui ajudará a garantir a seleção adequada.
  2. Comece com várias (tipicamente duas a quatro) placas de NGM com grandes populações de hermafroditas gravid. Isolar ovos usando síncronia alvejante-NaOH24.
    1. Lave os vermes das placas de ágar usando 2 mL de ddH2O estéril por placa. Distribua o líquido uniformemente em tubos de microcentrifuus de 1,5 mL (um tubo por placa ou hermafroditas).
    2. Gire para baixo por ~5 s em uma minicentrifuge benchtop (2.000 x g) para puxar os adultos para o fundo dos tubos. Pipeta fora do supernante e descartar.
    3. Lave com 1 mL de ddH2O estéril; girar para baixo como antes e descartar o supernatante.
    4. Repita a etapa anterior para reduzir os detritos bacterianos restantes.
    5. Resuspenque o conteúdo de cada tubo em 1 mL de ddH2O. Adicione a cada tubo 130 μL de alvejante comercial (8,25% hipoclorito de sódio) e 130 μL de hidróxido de sódio de 5 N (NaOH, concentração final 0,5 N).
    6. Tubos de vórtice vigorosamente por pelo menos 10-15 s a cada 2 minutos até que corpos adultos tenham se rompido. Não permita que o tratamento alvejante-NaOH deseca mais de 5 minutos para evitar matar ovos.
    7. Gire em uma minicentrifuge para 30-60 s a 2.000 x g para pelotar os ovos. Pipeta fora do supernante e descartar. Pode ou não haver uma pelota visível, isso é normal.
    8. Adicione 1 mL de tampão de m9 e gire para 30-60 s a 2000 x g. Descarte o supernatante.
    9. Repita o passo de lavagem (1,2,8) 5x para remover completamente a mistura alvejante-NaOH, removendo o máximo possível do sobrenante sem perturbar a pelota de ovo.
    10. Transfira ovos para 10 mL de tampão de maminho M9 em um tubo cônico de 50 mL ou tubo de cultura de 30 mL com tampa. Se usar tubos cônicos, deixe a tampa ligeiramente desparafusada e use um pouco de fita para mantê-la segura. Incubar com agitação durante a noite (16 h) a 25 °C e 200 RPM para permitir que as larvas eclodam.
  3. Transfira larvas L1 sincronizadas para placas RNAi para crescer até a idade adulta.
    1. Adicione 2 mL de tampão M9 estéril + 0,01% Triton X-100 (a partir de agora M9TX-01) a cada tubo L1 e transfira todo o volume (12 mL) para um tubo cônico de 15 mL.
    2. Coloque tubos de 15 mL com vermes L1 a 4 °C por 10 minutos para retardar o movimento larval.
    3. Gire para baixo tubos cônicos de 15 mL em uma grande centrífuga de mesa (1.500 x g a 4 °C por 3 min; aceleração e desaceleração não devem ser superiores a 80% do máximo).
    4. Cuidadosamente pipeta fora do supernante sem perturbar a pelota L1. Descarte o supernatante.
    5. Adicione 12 mL de M9TX frio-01 a cada tubo. Repita a centrifugação. Pipeta cuidadosamente fora e descartar o supernatante. Cada tubo deve ter ~200 μL restantes.
    6. Enxágüe uma ponta de pipeta de 200 μL no M9TX-01 para evitar que os vermes grudem no plástico, em seguida, use esta ponta para resuspencar a pelota de verme. Transfira vermes resuspendados para placas pos-1 preparadas por gotas de líquido no gramado bacteriano.
    7. Incubar as placas a 25 °C até o primeiro dia de vida adulta.
      NOTA: Se cultivar vermes em placas pos-1 RNAi, os vermes devem alimentar ad libitum nas bactérias RNAi até que tenham totalmente transicionada para a idade adulta para garantir alta penetração do fenótipo embrionário-letal. Verifique as placas às 24 e 48 horas. Se as placas parecerem famintas ou quase famintas, os vermes precisarão ser movidos para placas novas para terminar de crescer em adultos de tamanho real. Para evitar o esgotamento das placas antes que os vermes sejam cultivados, procure adicionar 250-500 larvas L1 a cada placa RNAi de 10 cm.
  4. Colher adultos e limpar o E. coli intestinal para criar vermes livres de germes.
    1. Enxágüe vermes adultos de placas usando 5 mL de M9TX-01 por placa. Transfira o buffer + worms para um tubo cônico de 15 mL e permita que os adultos se acomodem na parte inferior do tubo.
    2. Enxágüe adultos em alterações de 10 mL de tampão M9TX-01 fresco até que nenhuma turbidez bacteriana visível permaneça (tipicamente 1-2x). Os tubos podem ser centrifugados a 700 x g por 30 s para pelotas de vermes, ou adultos podem ser autorizados a se estabelecer pela gravidade.
    3. Realize uma lavagem adicional com 10 mL de M9TX-01 para reduzir as bactérias externas.
    4. Transfira vermes para tubos cônicos de 50 mL ou tubos de cultura de 30 mL contendo 5 mL S Médio + 2x E. coli OP50 (~5 x 109 células mortas/mL) + 200 μg/mL de gentamicina + 50 μg/mL de clororamfenicol. Se usar tubos cônicos, deixe a tampa ligeiramente desparafusada e use um pouco de fita para mantê-la segura. Use pipetas de vidro ou enxágue pipetas plásticas em M9TX-01 para evitar que os vermes grudem.
    5. Incubar adultos a 25 °C com agitação a 200 RPM por 24-48 h para produzir adultos livres de germes.
      NOTA: Se os vermes permanecerem em antibióticos por >24 h, mais OP50 morto pelo calor pode ter que ser adicionado para garantir que os vermes tenham uma fonte de alimento adequada. Verifique os tubos às 24h e complemente com OP50 morto pelo calor se a turbidez for visivelmente reduzida.
  5. Adultos de lavagem de sacarose de acordo com os protocolos wormbook24 para obter estoques limpos, reprodutivamente estéreis e sincronizados somente para adultos para colonização bacteriana.
    1. Certifique-se de que os volumes frios de 60% de sacarose, tampão de minhoca M9 e M9TX-01 estejam prontos para o uso. Para simplificar, estes podem ser deixados a 4 °C na noite anterior.
    2. Para que cada amostra seja lavada, crie um tubo cônico de 15 mL rotulado contendo 8 mL de M9TX-01 e reserve no gelo. Estes serão necessários na etapa 1.5.10.
    3. Adicione 5 mL de M9TX-01 a cada tubo de 50 mL contendo larvas L1. Transfira todo o volume (agora 10 mL) para um tubo cônico vazio de 15 mL e permita que os adultos se acomodem na parte inferior do tubo.
    4. Pipeta cuidadosamente fora do supernaspe e descarte.
    5. Adicione 10 mL M9TX-01 a cada tubo e mova tubos para um balde de gelo por 5-10 min.
      NOTA: A partir deste ponto, vermes e todos os buffers devem ser mantidos no gelo.
    6. Use a configuração "temperatura rápida" para esfriar uma centrífuga de mesa grande a 4 °C.
    7. Adicione 10 mL de M9TX frio-01 a cada tubo para enxaguar os detritos restantes. Deixe os vermes se estabelecerem no gelo; remover o supernante e descartar.
    8. Flutuação de sacarose: Adicione 5 mL de tampão M9 frio e 5 mL de solução de sacarose fria de 60% para cada tubo, misturando bem. Em seguida, flutue cuidadosamente 1 mL de tampão M9 frio em cima da mistura de tampão de sacarose em cada tubo. Não misture depois que o carro alegórico tiver sido adicionado.
      ATENÇÃO: Mova-se rapidamente para os próximos passos-vermes podem dessecar se expostos a altas concentrações de sacarose por muito tempo!
    9. Centrifugar a 1500 x g para 3 min a 4 °C. Vermes adultos vivos estarão na interface do M9 e da sacarose, aproximadamente 1 mL do topo do tubo.
    10. Use uma pipeta sorológica de vidro de 5 mL para transferir a camada de verme para tubos cônicos preparados de 15 mL com M9TX-01 frio (a partir do passo 1.5.2). Tenha muito cuidado para obter a camada de vermes vivos sem pipetting muito da sacarose.
    11. Se necessário, adicione M9TX-01 para obter volumes iguais de 10-12 mL/tubo. Centrifugar a 1500 x g a 4 °C por 1 min, depois pipeta fora do supernante. Vermes podem ser devolvidos à temperatura ambiente neste momento.
    12. Repita a etapa de lavagem 1.5.11 duas vezes, reduzindo a velocidade para 700 x g a 4 °C e o tempo para 30 s.

2. Alimentar vermes em bactérias vivas na cultura líquida

NOTA: Este protocolo é usado para colonizar vermes com bactérias cultivadas em laboratório em condições bem misturadas na cultura líquida (Figura Suplementar 1). Os vermes podem ser colonizados com isolados individuais da cultura pura (por exemplo, patógenos como enterococcus faecium28,29) ou misturas de isolados (por exemplo, comunidades mínimas de microbioma14).

  1. Comece com vermes adultos sincronizados com sacarose do protocolo passo 1.5 em um tubo cônico de 15 mL. Lave os vermes uma vez em 12 mL de tampão S e descarte o supernatante.
  2. Resuspenda os vermes lavados no volume do meio S necessário para o experimento. Considere o volume de condições experimentais, o número de condições sobre as quais os vermes serão divididos, e as concentrações finais de vermes e bactérias.
    NOTA: A alimentação em vermes varia de acordo com a disponibilidade bacteriana30 e os vermes podem ser estressados pelo lotação31. Para colonização na cultura líquida, recomenda-se <1000 worms/mL e >107 CFU/mL; 1011 UFC/mL é considerada densidade alimentar "ad libitum" em E. coli32.
  3. Desça culturas bacterianas. Despeje o supernante; aspiração ou pipetação pode ser usado para remover o supernatante para bactérias que formam pelotas soltas.
    NOTA: Para culturas >5 mL, transfira para tubos de 15 mL e gire a ~2800 x g em uma grande centrífuga de mesa por 8-10 min. Culturas <5 mL podem ser transferidas para tubos de 1,5 mL e centrifugadas a 9000 x g por 1-2 min em uma pequena centrífuga de mesa. Bactérias altamente motile (por exemplo, muitas espécies de Pseudomonas) podem precisar ser refrigeradas a 4 °C por 10-15 min para facilitar a formação de uma pelota estável, e pode ser melhor centrifugar a 4 °C.
  4. Resuspend culturas bacterianas em um volume de tampão S e centrífuga novamente para pelota. Remova e descarte o supernatante como antes.
  5. Resuspend culturas bacterianas em S médio na densidade desejada para o experimento, além de quaisquer antibióticos para seleção. Os antibióticos a serem utilizados, se houver, dependerão do perfil de resistência das bactérias utilizadas para colonização.
  6. Usando uma ponta de pipeta revestida em M9TX-01, os vermes pipetas suavemente para cima e para baixo até que os vermes sejam completamente resuspengidos em meio S, em seguida, transfira para tubos ou poços de placa para colonização bacteriana.
  7. Adicione suspensão bacteriana a cada cultura de vermes para atingir a concentração bacteriana desejada e o volume final.
  8. Se usar uma placa multi-poço para colonização, cubra a placa com uma membrana de vedação estéril permeável a gás de 96 poços.
  9. Incubar com agitação a 200 RPM para evitar que as bactérias se instalem durante a incubação.

3. Interrupção mecânica de vermes individuais em um formato de 96 poços

NOTA: Esta seção descreve um protocolo de formato de placa de 96 poços para interrupção mecânica de C. elegans colonizados bacterialmente individuais. Os primeiros passos do protocolo (3.1-3.8) descrevem um método para purgar bactérias não aderidas do intestino do verme e limpar o exterior dos vermes usando paralisia fria e branqueamento da superfície. Essas etapas produzirão vermes adultos limpos e vivos que podem ser mecanicamente interrompidos para quantificação de conteúdos bacterianos (3,8 extremidade) ou usados para experimentos adicionais (Figura Suplementar 1). Este protocolo pode ser adaptado para quantificar bactérias em vermes colonizados na cultura líquida (Seção 2), em placas de ágar, ou a partir de solo natural ou microcosmo.

  1. Coloque uma alíquota de M9TX-01 no gelo para esfriar (4-5x o número de amostras em mL).
  2. Prepare uma alíquota de M9TX-01 + alvejante (6% hipoclorito de sódio, 1:1000 ou 1:2000 v/v, 1 mL por amostra + 1 mL extra) e coloque no gelo para esfriar. Esta alíquota será usada na etapa 3.8.
  3. Prepare placas de 96 poços para diluição serial de amostras de vermes rompidas.
    1. Obter placas estéreis de 300 μL com tampas; este protocolo usa uma placa de diluição por 12 vermes digeridos.
    2. Use um pipettor multicanal de 96 poços para encher as linhas B-D de cada placa de 96 poços (capacidade de 300 μL) com 180 μL de 1x pbs tampão. Deixe a primeira fila vazia. As linhas B-D se tornarão diluições seriais de 10x dos digestores de vermes [0,1x, 0,01x, 0,01x].
    3. Reserve as placas. As placas de diluição serão utilizadas na etapa 3.13.
  4. Resuspend cada amostra de verme em 1 mL de M9TX-01 em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
  5. Tubos de giro brevemente (2-3 s) em uma minicentrifuagem de baixa velocidade (2.000 x g) a 25 °C para os adultos de pelotas. Pipeta fora do supernante e descartar, tendo certeza de não perturbar a pelota de verme.
  6. Usando as configurações de centrifugação na etapa 3.5, enxágue vermes duas vezes com 1 mL de M9TX-01, depois uma vez com 1 mL de tampão de m9, para reduzir as bactérias externas.
  7. Purigue bactérias não aderidas do intestino do verme.
    1. Resuspend cada amostra de vermes em 1 mL de S médio + 2x op50 morto pelo calor em um tubo de cultura.
    2. Incubar a 25 °C por 20-30 min para permitir a passagem de qualquer bactéria não aderida do intestino.
      NOTA: Isso também limpará qualquer proteína fluorescente extracelular do lúmen e permitirá uma visualização mais clara das bactérias rotuladas aderidas ao epitélio intestinal, particularmente quando fluoroforos ácido-rápidos (por exemplo, mCherry, dsRed) são usados.
  8. Vermes de alvejante de superfície para limpar bactérias externas.
    1. Enxágüe vermes expurgados duas vezes com 1 mL de M9TX-01 frio e descarte o supernasciente.
    2. Deixe os tubos esfriarem por 10 minutos no gelo (preferido) ou a 4 °C. Isso vai paralisar os vermes e evitar a ingestão de alvejante.
      NOTA: Outros protocolos utilizam um agente de paralisia química, como o levamisole; esta é uma abordagem estabelecida33 que requer a adição de um fluxo de resíduos perigosos.
    3. Adicione 1 mL de tampão de maminho M9 gelado + alvejante não perfumado (hidróxido de sódio de 8,25%, 1:1000 ou 1:2000 v/v) a cada tubo. Deixe os tubos sentarem no gelo (preferido) ou a 4 °C por pelo menos 10 minutos para matar bactérias externas.
      NOTA: Não exceda a concentração de alvejante de 1:1000. Mesmo em vermes paralisados, a mortalidade pode resultar.
    4. Pipeta fora tampão de alvejante e descarte; tubos de retorno ao gelo para garantir que os vermes não retomem o bombeamento até que o alvejante seja limpo.
    5. Adicione 1 mL de M9TX frio-01 a cada tubo. Gire por ~5 s em um minicentrifuge (2.000 x g a 25 °C); tubos de retorno para o gelo. Remova o supernatante e descarte.
    6. Repita este passo de lavagem com mais 1 mL de M9TX-01 frio, descartando o máximo possível do supernante.
      NOTA: Se usar worms para outros experimentos, pule a etapa de permeabilização (Protocolo 3.9) e, em vez disso, transfira adultos recém-branqueados para tampão gelado em uma placa de Petri de 6 cm e separe vermes em condições experimentais como no Protocolo 3.10. Manter os vermes frios para evitar que a motilidade seja retomada, mas trabalhe rapidamente - manter os vermes por >30 minutos no gelo pode potencialmente resultar em <100% de retomada da atividade normal34.
  9. Permeabilização química da cutícula de minhoca com sulfato de dodecyl de sódio e dithiothrietol (0,25% SDS + 300 mM DTT) (com base em35)
    ATENÇÃO: O DTT é um agente redutor e irritante. Use EPI e trabalhe em um capô de fumaça ao manusear estoques ou soluções secas. Um fluxo de resíduos perigosos é necessário.
    1. Na capa de fumaça, prepare a solução SDS/DTT suficiente para permitir 100 μL para cada amostra. Para 1 mL, a 965 μL de tampão de m9 ou M9TX-01 em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL, adicione 5 μL de 5% (w/v) SDS e 30 μL de 1M DTT.
      NOTA: A solução DTT de 1 M (aquos) deve ser preparada fresca ou armazenada em alíquotas a -20 °C para garantir a potência. As alíquotas devem ser utilizadas em dois ou três experimentos para evitar o excesso de congelamento.
    2. Mova tubos de microcentrifuuagem contendo vermes branqueados na superfície para um rack de tubo de temperatura ambiente. Cada tubo deve conter vermes em ~20 μL de buffer.
    3. Adicione 100 μL de solução SDS/DTT a cada amostra de worm. Descarte qualquer solução SDS/DTT restante no fluxo de resíduos perigosos apropriado.
    4. Permita que o tratamento prossiga por até 8 minutos no banco para quebrar parcialmente a cutícula resistente dos vermes adultos. Vermes morrerão e se estabelecerão no fundo do tubo durante este tempo.
    5. Após o tempo de permeabilização acabar, pipeta cuidadosamente fora do supernatante SDS/DTT e descarte-o em um fluxo de resíduos perigosos SDS/DTT apropriado.
    6. Adicione 1 mL de M9TX-01 a cada tubo. Gire brevemente em uma centrífuga de mesa para pelotar os vermes ou permitir que os vermes se instalem pela gravidade até o fundo dos tubos, em seguida, desenhe o supernatante e descarte em um fluxo de resíduos perigosos SDS/DTT.
    7. Resuspend worms em tampão de worm M9 de 1 mL + 0,1% Triton X-100 até estar pronto para usar.
  10. Separe vermes em uma placa profunda de 96 poços com grão de carboneto de silício para interrupção mecânica. Prepare a placa de interrupção de 96 poços como abaixo.
    1. Obtenha uma placa de 2 mL de profundidade de 96 poços e uma tampa de placa de silício de 96 poços correspondente.
      NOTA: É importante usar placas compatíveis com os adaptadores de 96 poços para o disruptor tecidual. Pequenas diferenças nas dimensões externas fazem a diferença entre uma placa que pode ser removida dos adaptadores e uma que não pode.
    2. Usando uma espátula de colher estéril, adicione uma pequena quantidade de carboneto de silício estéril de 36 grãos a cada poço da placa que receberá um verme. Use grão suficiente para cobrir mal a parte inferior do poço (cerca de 0,2 g por poço). O material excessivo dificultará a ponta da pipeta na parte inferior do poço ao recuperar o conteúdo.
    3. Adicione 180 μL de tampão de m9 a cada poço.
    4. Rotule as colunas ou linhas para indicar para onde cada amostra irá e cubra a placa livremente com a tampa da placa de silício de 96 poços.
  11. Transfira vermes individuais para a placa de 96 poços para interrupção.
    1. Mova vermes permeabilizados cuidadosamente para uma pequena (35 ou 60 mm) placa de Petri contendo M9TX-01 suficiente para encher o prato a uma profundidade de ~1 cm.
      NOTA: Se um grande número de vermes estiver presente, pode não ser viável transferir toda a amostra, pois o líquido ficará lotado e será difícil canalizar vermes individuais.
    2. Usando um microscópio dissecando ou outro dispositivo de baixa ampliação, pipeta fora worms individuais em volumes de 20 μL, e transferir esses worms para poços individuais da placa de 96 poços.
      NOTA: É melhor colher apenas vermes recém-mortos. Evite vermes com uma forma linear rígida, pois esses vermes podem estar mortos há algum tempo. Tente pegar vermes que são curvados ou em forma de S, com fisiologia bruta normal e um intestino intacto.
    3. Depois de transferir cada volume, certifique-se de que o worm selecionado foi realmente ejetado para o poço. Para isso, pipeta até 20 μL de M9TX-01 a partir de uma área clara da placa de Petri e liberar o volume total de volta para a placa; isso normalmente ejetará o verme se ele estiver preso à pipeta. Se o verme estiver preso, remova 20 μL do poço e tente a transferência novamente.
    4. Uma vez que todos os vermes tenham sido transferidos, cubra a placa de 96 poços com uma folha de filme de vedação flexível comercialmente disponível (2 x 2 quadrados), certificando-se de que o lado apoiado em papel do filme de vedação está voltado para os poços de amostra. Tenha cuidado para não esticar o filme de vedação muito fino, ou será muito difícil de remover mais tarde.
    5. Coloque levemente o tapete de vedação de silício em cima do filme de vedação flexível; não pressione a tampa para baixo nos poços neste momento.
    6. Mova a placa para 4 °C para esfriar por 30-60 min. Isso evitará o excesso de aquecimento durante a interrupção, o que pode danificar as amostras.
      NOTA: Este é um ponto de ruptura no protocolo. Na maioria dos casos, a placa pode ser deixada a 4°C por até 4 horas antes de moer. Não deixe os vermes da noite para o dia, pois isso mudará a contagem bacteriana.
  12. Carregue 96 placas de poço em um disruptor de tecido para quebrar tecidos de vermes e liberar bactérias intestinais.
    NOTA: (Opcional) Se usar um número ímpar de placas de 96 poços para digestão, é necessário preparar um contrapeso antes de prosseguir. Use uma placa vazia de 96 poços e encha os poços com água até que ele pese o mesmo que a primeira placa.
    1. Pressione o tapete de vedação de silício firmemente para baixo nos poços para criar uma vedação, certificando-se de que a tampa está plana por toda a superfície da placa.
      NOTA: Se o filme de vedação flexível for muito grosso após o alongamento, será difícil fixar a tampa de silicone de tal forma que ela esteja deitada plana em todos os poços. Isso resultará em um selo insuficiente e contaminação bem-a-poço durante o tremor.
    2. Placas seguras no disruptor tecidual usando os adaptadores de placa de 96 poços. Agite as placas por 1 min a 30 Hz, depois gire as placas 180° e agite novamente por 1 min. Isso ajudará a garantir até mesmo a interrupção em todos os poços da placa.
    3. Toque firmemente nas placas do banco duas ou três vezes para desalojar qualquer grão do filme de vedação flexível.
    4. Usando uma centrífuga grande com dois adaptadores de placa de 96 poços, gire as placas a 2400 x g por 2 minutos para recolher todo o material até o fundo dos poços.
    5. Remova a tampa de silicone e retire cuidadosamente o filme de vedação flexível.
      NOTA: Se a película de vedação flexível grudar em qualquer um dos poços, use uma ponta de pipeta de 200 μL para removê-la. Isso é comum quando o filme de vedação flexível foi esticado muito fino.
  13. Amostras de digestão de vermes diluídos em 300 μL em placas de 96 poços.
    1. Usando um pipettor multi-poço definido para 200 μL, pipeta para cima e para baixo várias vezes lentamente e cuidadosamente para re-misturar o conteúdo dos poços, em seguida, retirar o máximo do líquido possível. Transfira este líquido para as fileiras superiores das placas de 96 poços preparadas na etapa 3.3.
    2. Usando um pipettor de 96 poços definido para 20 μL, remova este volume de líquido da linha superior e dispense na linha B. Pipeta para cima e para baixo 8-10x para misturar. Descarte dicas.
    3. Repita o passo 3.13.2, partindo das amostras de 0,1x da linha B para criar amostras de diluição de 0,01x na linha C.
    4. Repita o passo 3.13.2 novamente, indo da linha C para a linha D.
    5. Placa em ágar sólido para quantificação bacteriana. Para vermes monocolonizados, geralmente é suficiente para emplacar gotas de 10-20 μL de cada diluição [1x-0,001x] em placas de ágar. Para colonização de várias espécies, emplaque cada diluição separadamente, canalização de 100 μL em uma placa de ágar de 10 cm; espalhar imediatamente usando contas de revestimento de vidro.

4. Limpeza do grão de carboneto de silício para reutilização

NOTA: Este procedimento é usado para limpar e esterilizar o material de moagem, grão de carboneto de silício, para reutilização após experimentos. Este protocolo deve ser seguido em sua totalidade antes do primeiro uso, uma vez que o grão de carboneto de silício é um produto industrial e não vem pré-esterilizado. O grão de si-carboneto (3,2 g/cc) é um material denso e áspero que funciona eficientemente para interromper amostras resistentes. No entanto, as partículas podem se desgastar sobre o uso repetido e devem ser substituídas quando o desgaste se torna aparente. Felizmente, o material é barato, e os tamanhos normalmente vendidos (~1 lb) são suficientes para muitos experimentos.

  1. Depois de remover amostras para chapeamento, adicione 10% de solução de alvejante a todos os poços da placa de 96 poços e deixe descansar por pelo menos 10 minutos.
  2. Remova a maior parte do grão invertendo rapidamente a placa de 96 poços sobre uma pequena bandeja de lado alto ou recipiente de ponta de pipeta P1000 vazio grande o suficiente para capturar todo o conteúdo. O grão afundará imediatamente no fundo da bandeja. Despeje a solução de alvejante em uma pia.
  3. Reencha a placa de 96 poços com água da torneira e inverta na mesma bandeja para enxaguar o grão restante. Despeje a água na pia.
  4. Repita mais uma a três vezes com água da torneira até que a placa esteja completamente limpa de grão.
  5. Enxágüe grão 2x na água da torneira, enchendo a bandeja cada vez.
    NOTA: A placa de 96 poços profundos pode ser lavada em uma máquina de lavar louça de laboratório, coberta com papel alumínio, e autoclavada com outros plásticos reutilizáveis. O grão não precisa ser lavado imediatamente e pode ser deixado de lado neste momento. O grão usado é geralmente acumulado a partir de vários experimentos antes de lavar e autoclavar.
  6. Lave o grão em uma solução de detergente de laboratório por 30 minutos, agitando ocasionalmente girando ou misturando com uma espátula de metal.
  7. Enxágüe todos os traços de detergente em várias (8-10) trocas de água da torneira e enxágue 2x com água destilada.
  8. Espalhe o grão em uma bandeja aberta, como uma bandeja de autocláve de polipropileno raso, e seque a 40-70 °C por várias horas.
    NOTA: Se o grão estiver desajeitado quando seco, não foi limpo ou enxaguado o suficiente. Repita o protocolo de limpeza a partir da etapa 4.6, adicionando enxágües adicionais na etapa 4.7.
  9. Distribua grãos limpos e secos em garrafas de vidro autoclaváveis de rosca a uma profundidade máxima de 5-6 cm. Autoclave no ciclo pré-vácuo por 30 minutos para esterilizar.

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Resultados

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Esterilização alvejante de vermes vivos
Vermes branqueados na superfície são efetivamente livres de bactérias externas até que a motilidade retorne e a excreção retome. Nas condições aqui utilizadas, observa-se a rápida extinção de bactérias no tampão (Figura 1A-C, Figura Suplementar 2, Vídeo 1) sem perturbar as bactérias associadas ao intestino em vermes paralisados a frio (Figura 1D-F

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Discussão

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Aqui os dados são apresentados sobre as vantagens da quantificação de um único verme da carga bacteriana em C. elegans, juntamente com um protocolo de interrupção de 96 poços para permitir a rápida e consistente aquisição de grandes conjuntos de dados deste tipo. Em comparação com os métodos existentes33, esses protocolos permitem uma medição de maior rendimento das comunidades microbianas intestinais no verme.

Essa abordagem tem o revestimento como um passo li...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de reconhecer H. Schulenberg e C. LaRock por seu generoso compartilhamento de cepas bacterianas usadas nesses experimentos. Este trabalho foi apoiado por financiamento da Universidade Emory e da NSF (PHY2014173).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de polipropileno de fundo plano de 96 poços, 300 uLEvergreen Labware290-8350-03F
Tapete de vedação de placas de 96 poços, silício, poços quadrados (AxyMat)AxygenAM-2ML-SQ
Placas de 96 poços, 2 mL, poços quadradosAxygenP-2ML-SQ-C-S Ágar
Evergreen Labware290-8020-03L
Fisher Scientific443570050
Conjunto de adaptadores de moinho de esferas para placas de 96 poçosQIAGEN119900Placas adaptadoras para uso com duas placas de 96 poços no TissueLyser II
Homogeneizador de tecido de moinho de esferas (TissueLyser II)QIAGEN85300Homogeneizador mecânico para interrupção de amostras de médio a alto rendimento
BioSorterUnion BiometricaPor cotaçãoClassificador de objetos grandes equipado com um foco de 250 mícrons para C. elegans
Alvejante, comercial, hipoclorito de sódio a 8,25%Membrana
vedação permeável a gás de 96 poçosmultipoços Diversified BiotechBEM-1Membranas de poliuretano permeáveis a gás de placa multipoço. O filme de vedação fino é permeável a O2, CO2 e vapores de água e é transparente aos raios UV até 300 nm. Estéril, 100/caixa.
Cloreto de cálcio dihidratadoFisher ScientificAC423525000
ColesterolVWRAAA11470-30
Ácido cítrico monohidratadoFisher ScientificAC124910010
Sulfato de cobre (II) pentahidratadoFisher ScientificAC197722500
Corning 6765 LSE Mini MicrocentrífugaCorning  COR-6765
EDTA dissódicoFisher Scientific409971000
DL 1,4 Ditiotreitol, 99+%, para biologia mol, DNAse, RNAse e Protease livres, ACROS OrganicsFisher Scientific327190010
Eppendorf 1,5 mL tubos de microcentrífuga, microcentrífugaEppendorf
Eppendorf 5424REppendorf5406000640Microcentrífuga refrigerada de bancada de 24 lugares
Centrífuga Eppendorf 5810R com rotor S-4-104Eppendorf226270403L com adaptadores para tubos e placas de 15-50 mL
Balde de placas Eppendorf (x2), para rotor S-4-104Eppendorf22638930
Etanol 100%Fisher ScientificBP2818500
Contas de vidro, 2,7 mmProdutos para ciências da vidaLS-79127
Contas de vidro, lavadas com ácido, 425-600 µ mSigmaG877-500G
Contas de revestimento de vidroVWR76005-124
Ácido clorídricoVWRBDH7204-1
Sulfato de ferro (II) heptahidratadoFisher Scientific423731000
Kimble Kontes motor de pilão de pelletsDWK Life Sciences749540-0000
Kimble Kontes pilões de pellets de polipropileno e microtubos, 0,5 mLDWK Life Sciences749520-0590
Microscópio invertido motorizado Leica DMi8 com platina motorizadaLeica11889113
Leica LAS X Software premiumLeica11640687
Sulfato de magnésio heptahidratadoFisher ScientificAC124900010
cloreto de manganês(II) tetrahidratadoVWR470301-706
Película de vedação flexível para laboratório PARAFILM MAmcorPM996
PeptoneFisher ScientificBP1420-500
Placas de Petri, redondas, 10 cmVWR25384-094
Placas de Petri, redondas, 6 cmVWR25384-092
Placas de Petri, quadradas, 10 x 10 cmVWR10799-140
Tamponamento fosfofoso solução salina (1X PBS)Gold BioP-271-200
Bandeja de autoclave de polipropileno, rasaFisher Scientific13-361-10
Hidróxido de potássioFisher ScientificAC134062500
Fosfato de potássio dibásicoFisher ScientificBP363-1
Fosfato de potássio monobásicoFisher ScientificBP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443R Foundationn/a
de laboratório tipo colher, metalVWR470149-438
Carboneto de silício 36 grãosMJR Tumblersn/aGrão preto extra grosso de carboneto de silício. Disponível em tamanhos de 0,5-5 lb deste fornecedor.
Dodecil sulfato de sódioFisher ScientificBP166-100
Hidróxido de sódioVWRBDH7247-1
Fosfato de sódio dibásico anidroFisher ScientificBP332-500
Cloreto de sódioFisher ScientificBP358-1
SacaroseFisher ScientificAC419760010
Tri-potássio citrato monohidratadoFisher ScientificAC611755000
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Sulfato de zinco heptahidratadoFisher ScientificAC205982500
Tampas de placas de polipropileno de 96 poços de Membranas de poliuretano permeáveis a gás de placa natural Centrífuga de bancada Espátula

Referências

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