Um pipeline para investigar as estruturas e caminhos de sinalização de receptores sphingosine 1-fosfato

Sphingosine-1-fosfato (S1P), um produto metabólico de sphingolipids na membrana celular, é uma molécula de sinalização linfosfídica onipresente que envolve várias atividades biológicas, incluindo tráfico de linfócitos, desenvolvimento vascular, integridade endotelial e frequência cardíaca ^1,2,3. O S1P exerce seus diversos efeitos fisiológicos através de cinco subtipos receptores S1P (S1PRs 1-5); Os S1PRs são encontrados em uma variedade de tecidos e exibem preferências únicas para proteínas G a jusante ^4,5. O S1PR1 é principalmente acoplado à proteína Gi, que posteriormente inibe a produção de cAMP; S1PR2 e S1PR3 são acoplados com Gi, Gq e G12/13, e S1PR4 e S1PR5 transdutos através de Gi e G12/13⁶.

A sinalização S1P-S1PR é um alvo terapêutico crítico para múltiplas doenças, incluindo doenças autoimunes⁷, inflamação⁸, câncer⁹ e até COVID-19¹⁰. Em 2010, o fingolimod (FTY720) foi licenciado como um medicamento de primeira classe direcionado aos S1PRs para tratar a esclerose múltipla da recaída (MS)¹¹. No entanto, é capaz de vincular a todos os S1PRs, exceto S1PR2, enquanto a ligação inespecífica ao S1PR3 resulta em edema do córtex cerebral, constrição vascular e brônquica e vazamento epitelial^{pulmonar 12}. Como estratégia alternativa para aumentar a seletividade terapêutica, foram produzidos ligantes específicos do subtipo para o receptor. O Siponimod (BAF312) foi aprovado em 2019 para o tratamento de recaída de MS¹³; ele visa efetivamente S1PR1 e S1PR5, enquanto não tem afinidade com OPR3, apresentando menos efeitos colaterais na prática clínica¹⁴. Em 2020, a Food and Drug Administration dos EUA autorizou o ozanimod para a terapia de^{ESM 15}. Foi relatado que o ozanimod possui uma seletividade 25 vezes maior para S1PR1 do que para S1PR5¹⁶. Notavelmente, no contexto da atual pandemia COVID-19, descobriu-se que drogas agonistas direcionadas às S1PRs podem ser utilizadas para tratar o COVID-19 usando técnicas de terapia imunomodulatória¹⁷. Em comparação com fingolimod, o ozanimod tem mostrado superioridade na redução dos sintomas em pacientes COVID-19 e agora está sendo submetido a testes clínicos¹⁰. Compreender a base estrutural e a função dos S1PRs estabelece uma base significativa para o desenvolvimento de uma droga que tem como alvo seletivamente as S1PRs¹⁸.

Muitas técnicas são usadas para investigar as informações estruturais de biomacromléculas, incluindo cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear (RMN) e microscopia eletrônica (EM). A partir de março de 2022, existem mais de 180.000 estruturas depositadas no Protein Databank (PDB), e a maioria delas foi resolvida pela cristalografia de raios-X. No entanto, com a primeira estrutura de resolução quase atômica da TPRV1 (resolução 3.4 Å) relatada por Yifan Cheng e David Julius em 2013¹⁹, a microscopia crio-elétron (crio-EM) tornou-se uma técnica mainstream para estruturas proteicas, e o número total de estruturas em PDB foi superior a 10.000. As áreas de avanço crítica são o desenvolvimento de novas câmeras para imagens conhecidas como câmeras diretas de detecção de elétrons e novos algoritmos de processamento de imagens. A Crio-EM revolucionou a biologia da estrutura e a descoberta de drogas baseada em estruturas na última década²⁰. Como entender como os complexos macromoleculares cumprem seus complicados papéis na célula viva é um tema central nas ciências biológicas, o crio-EM tem o potencial de revelar conformações de complexos moleculares dinâmicos, particularmente para proteínas transmembranas²¹. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são a maior superfamília de proteínas transmembranas e as metas de mais de 30% dos fármacos atualmente comercializados²². O desenvolvimento da crio-EM contribuiu para uma explosão de estruturas de alta resolução de complexos proteicos GPCR-G, permitindo a determinação estrutural para alvos "intratáveis" que ainda não estão acessíveis à análise cristalográfica de raios-X no design^{de medicamentos 23}. Assim, o aplicativo crio-EM oferece a chance de determinar a estrutura tridimensional dos GPCRs em condições quase nativas perto da resolução atômica²⁴. Os avanços no crio-EM tornam possível visualizar fundamentos mecanicistas da estimulação ou inibição do GPCR, e se beneficiar ainda mais na descoberta dos novos locais de vinculação para a criação de medicamentos direcionados ao GPCR²⁵.

Contando com os tremendos avanços da tecnologia crio-EM, identificamos estruturas de complexos de sinalização Agonizantes S1PR1-, S1PR3 e S1PR5-Gi recentemente^26,27. Em humanos, os S1PRs são encontrados em vários tecidos e exibem preferências únicas para proteínas G a jusante ^4,5. O S1PR1 é principalmente associado à proteína Gi, que posteriormente inibe a produção de monofosfato de adenosina 3′,5′cíclica (cAMP). S1PR3 e S1PR5 também são capazes de acoplamento com Gi ^6,28. Uma vez que a ativação do receptor acoplado gi diminui a produção de cAMP²⁹, um ensaio de cAMP de inibição gi foi introduzido para medir os efeitos de inibição de cAMP para capturar alterações funcionais ^26,27. Usando uma versão mutante de Photinus pyralis luciferase em que uma umidade de proteína de ligação cAMP foi inserida, este ensaio cAMP oferece um método simples e confiável para monitorar a atividade gpcr através de alterações na concentração cAMP intracelular³⁰. É um ensaio funcional sensível e não radioativo e pode ser aplicado para monitorar a sinalização a jusante em tempo real de uma ampla gama de GPCRs para fins de descoberta de drogas³¹.

Aqui, é fornecido um resumo dos métodos críticos na resolução dos modos de ativação e reconhecimento de drogas dos S1PRs, incluindo principalmente manipulações crio-EM e um ensaio cAMP de inibição gi. Este artigo tem como objetivo fornecer orientação experimental abrangente para novas explorações nas estruturas e funções dos GPCRs.

1. Purificação do complexo proteico S1PRs-G

1. Para purificar o complexo proteico S1PRs-G humano, clonem os cDNAs de S1PR1 sem resíduos terminais C 338-382, o tipo selvagem S1PR3, S1PR5 truncado com 345-398 em C-terminus, e o tipo selvagem Gi1 no vetor pFastBac1 e os cDNAs do tipo selvagem Gβ1 e Gγ2 no vetor pFastBacdual (Tabela de Materiais).
   NOTA: Todas as construções para S1PRs também contêm a sequência de sinal haemagglutinin (HA), seguida por uma tag de epítope de bandeira no N-terminus e uma tag de 10x em C-terminus. Além disso, uma sequência de DNA sintético (Tabela de Materiais) para tradução de lysozyme T4 (T4L) foi inserida no n-terminus de S1PRs, a fim de facilitar a expressão e purificação do receptor.
2. Preparação do baculovírus codificando S1PRs, Gi1 e Gβ1γ2
   1. Adicione os vetores recombinantes a 50 μL de Escherichia coli (E. coli) competentes dh5α armazenados em um tubo de 1,5 mL a -80 °C, e incubar no gelo por 30 minutos.
   2. Choque térmico das células a 42 °C por 90 s, transfira-as para o gelo imediatamente, e esfrie-as por 2 minutos.
   3. Agite o tubo a 37 °C por 3-5 h após a suplementação com 300 μL de caldo de lysogeny (LB). Placa 100 μL de células para a placa de ágar LB e incubar a 37 °C mantendo-se no escuro por 48 h.
   4. Inocular a colônia branca em 5 mL de meio LB contendo 50 μg/mL kanamycin, 10 μg/mL tetraciclina, e 7 μg/mL gentamicina, e cultura a 37 °C por 16 h.
   5. Isole o bacmídeo recombinante com o kit de miniprep plasmídeo (Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante, para a produção do baculovírus P0.
      NOTA: Antes do uso, o bacmídeo purificado foi analisado por PCR com primers dianteiros e invertidos pUC/M13. Para o PCR, número de ciclos = 30 ciclos, temperatura de fusão = 58 °C e tempo de extensão = 1 min por 1 Kb.
   6. Prepare o baculovírus P0 como descrito em um protocolo^{anterior 32}.
      1. Cultume as células sf9 (média ESF921) em placas de seis poços e verifique se as células estão na fase de registro (1,0-1,5 x 10⁶ células/mL).
      2. Diluir 8 μL de reagente de transfecção de baculovírus em 100 μL do meio de Grace, e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Diluir 10 μg do bacmídeo recombinante em 100 μL do meio de Grace, e misture suavemente. Misture o bacmídeo diluído com reagente de transfecção de baculovírus diluído, misture delicadamente e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente.
      3. Adicione a mistura (bacmid e reagente) sobre as células (Passo 1.2.6.1), e aplaque-as a 27 °C por 3h.
      4. Remova o meio da Grace e substitua-o por 2 mL de meio de cultura celular ESF921. Emplaque as placas de seis poços a 27 °C e colete o meio de cultura celular ESF921 após 5 dias após a transfecção.
      5. Centrifugar a 500 x g a 4 °C por 10 minutos para remover as células e detritos. Transfira o supernatante para tubos de 2 mL. Este é o estoque de baculovírus P0.
   7. Isolar o estoque de vírus P1
      1. Transfira 30 mL de células sf9 para uma garrafa cônica, cultura a 27 °C com agitação a 270 rpm, e verifique se as células atingem uma fase de tronco (1,0-1,5 x 10⁶ células/mL).
      2. Adicione 2 mL de estoque de vírus P0 à garrafa e agite a 270 rpm por 4 dias a 27 °C.
      3. Transfira as células para um tubo de 50 mL, centrífuga a 1.800 x g por 10 min a 4 °C para remover as células e detritos, e transfira o supernatante para tubos de 50 mL. Este é o estoque de baculovírus P1.
   8. Amplie o estoque baculoviral
      1. Repita o passo 1.2.7 usando 50 mL de células sf9 na fase de registro (1,0-1,5 x 10⁶ células/mL) e 1 mL de estoque P1.
      2. Armazene o estoque de baculovírus P2 resultante a 4 °C, protegendo-o da luz.
         NOTA: Não amplie o baculovírus indefinidamente, pois os mutantes deletérios foram produzidos a cada passagem.
3. Expressão do complexo proteico S1PRs-G
   1. Cultura sf9 células de insetos para atingir 2,5 x 10⁶ células/mL densidade, co-infectar com o P2 baculovírus codificar S1PRs, Gi1 e Gβ1γ2 a uma proporção de volume de 1:2:1, e cultura novamente a 27 °C por 48 h.
   2. Colete as células por centrifugação a 700 x g a 4 °C por 15 min, congele-as em nitrogênio líquido e armazene-as a -80 °C para uso.
4. Purificação de proteínas
   1. Descongele a pelota celular obtida na etapa 1.3 em temperatura ambiente e, em seguida, resuspensá-la em tampão de lise (20 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂) suplementado com 100 μg/mL de benzamidina, 100 μg/mL leupeptin, 100 μg/mL aprotinina, 25 mU/mL apiágua e 10 μM agonista. Mexa a suspensão celular à temperatura ambiente por 2 h para induzir a formação do complexo proteico S1PRs-G.
      NOTA: Apyrase é um ATP diphosphohydrolase. Catalisa a remoção do fosfato gama da ATP e do fosfato beta da ADP.
   2. Transfira a solução para os tubos, centrífuga a 70.000 x g por 10 minutos, e remova o sobrenante cuidadosamente. Resuspend a pelota em tampão solubilizador (20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂, 0,5% (w/v) LMNG, 0,1% (w/v) CHS, 1% (w/v) concunda de sódio, 10% (v/v) glicerol).
   3. Transfira a suspensão para um Dounce de vidro e homogeneize a pelota totalmente. Adicione 10 μM agonista, 4 mg de scFv16, 100 μg/mL de benzamidina, 100 μg/mL leupeptina, 100 μg/mL Aprotinina e 25 mU/mL apyrase à suspensão, e mexa a 4 °C por 2 h.
      NOTA: As etapas de homogeneização das pelotas são cruciais para a produção do complexo proteico GPCR-G.
   4. Transfira a solução para os tubos e centrífuga a 100.000 x g por 30 min a 4 °C.
   5. Pré-equilibre a resina da bandeira com o tampão de lavagem (20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂, 10 μM agonista, 0,0375% (w/v) GNL, 0,0125% (w/v) GDN, 0,01% (w/v) CHS).
   6. Transfira o supernante para os tubos e incubar com a resina de bandeira a 4 °C por 2 h.
   7. Carregue a mistura acima na coluna de vidro e lave a coluna com 50 mL de tampão de lavagem suplementada com 100 μg/mL de benzamidina, 100 μg/mL leupeptina e 100 μg/mL de aprotinina.
   8. Elute a coluna com 10 mL do tampão de elução contendo 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 200 μg/mL Flag peptídeo, 10 μM agonista, 0,0375% (w/v) GNL, 0,0125% (w/v) GDN, 0,01% (w/v) CHS, 100 μg/mL benzamidina, 100 μg/mL leupeptina e 100 μg/mL aproin.
   9. Colete o complexo de proteína S1PRs-G e concentre-se em 1 mL usando um concentrador de corte de 100 kDa a 1.300 x g a 4 °C. Filtre através de um filtro de 0,22 μM e centrífuga a 13.000 x g por 10 min a 4 °C para remover os agregados.
   10. Carregue o complexo de proteína S1PRs-G em uma coluna de filtragem de gel de exclusão de tamanho (SEC) pré-equilibrada com o buffer SEC contendo 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 μM agonista, 100 Μm TCEP, 0,00375% (w/v) LMNG, 0,00125% (w/v) GDN e 0,001% (w/v) CHS a uma vazão de 0,5 mL/min a 4 °C.
   11. Colete as frações de pico e concentre-se usando um concentrador de corte de 100 kDa a 1.300 x g a 4 °C para crio-EM.

2. Microscopia eletrônica para resolver a estrutura dos S1PRs

1. Recolha de dados
   1. Para preparar as grades crio-EM, segure grades Au R1.2/1.3 de 300 malhas para 10 s e descarga de brilho para 60 s a 15 mA usando um sistema de limpeza de descarga de brilho.
   2. Realizar vitrificação amostral conforme descrito anteriormente^33,34. No console de congelamento de mergulho, coloque a temperatura em 4 °C e a umidade relativa para 100% para o ambiente de trabalho da câmara. Use força de mancha para 0, tempo de espera de 0 s, tempo de mancha de 2 ou 3 s e tempo de drenagem de 0 s. Geralmente requer apenas 3 μL da amostra em concentrações de 5-10 mg/mL para vitrificação única.
   3. Clipe e carregue grades no conjunto da grade automática, carregue o conjunto da grade automática em Nanocab e carregue Nanocab no microscópio por carregador automático, como descrito anteriormente³⁵. Qualidade da amostra de tela com software EPU2³⁴. Normalmente, os dados coletados nas áreas de espessura de gelo adequada eram melhores.
   4. Colete dados crio-EM conforme descrito em detalhes anteriormente³⁵. Para o receptor S1P, defina o deslocamento de desfoco entre -1,0 μm e -1,8 μm com a dose eletrônica de exposição de 50-65 e^-/Ų. Para os complexos S1PR1-Gi, colete a pilha de filmes automaticamente usando o software EPU2 no modo de contagem com o detector K2 em um tempo total de exposição de 2 s, uma taxa de gravação de cinco quadros brutos por segundo e uma dose total de 56 e^-/Ų para produzir 35 quadros por pilha.
      NOTA: Normalmente, mais de 5.000 filmes são necessários para reconstruir a estrutura do receptor.
2. Processe os dados usando uma combinação de RELION³⁶ e crioSPARC³⁷ para obter um mapa ideal de densidade crio-EM. Use o RELION-3.1_gpu_ompi4 para processar os dados inicialmente que envolvem operações semelhantes como descrito anteriormente³⁴.
   1. No terminal do sistema Linux, digite o diretório pai do diretório de armazenamento de dados.
   2. Digite o comando relion no terminal para abrir a interface gráfica de usuário (GUI) DO RELION.
      NOTA: Se esta for a primeira vez que uma GUI RELION for aberta neste diretório, uma janela imediata aparecerá; clique em Sim.
   3. Clique em Importar na barra de função no lado direito da GUI RELION para importar os dados brutos para o RELION.
      1. Na opção Filmes/microfones , selecione Sim para Importar filmes/micrografos brutos?, digite o caminho de dados no campo de arquivos de entrada Raw (curingas são recomendados) e selecione Sim para são filmes de vários quadros?. Digite o tamanho dos pixels dos filmes no campo tamanho Pixel (Angstrom), a tensão operacional do microscópio (em kV) no campo de Tensão (kV) e a aberração esférica do microscópio no campo de aberração esférica (mm). Esses são os parâmetros que foram registrados no momento da coleta de dados.
      2. Na opção Executar , modifique o nome da fila de acordo com o servidor onde o programa está em execução (outras funções também precisam modificar esse parâmetro). Deixe os outros parâmetros nos valores padrão definidos pelo RELION. Finalmente, quando todos os parâmetros forem detectados corretamente, clique em RUN! para executar o programa.
   4. Use a função de correção de movimento para o alinhamento de todos os quadros³⁸.
      1. Na opção I/O , clique em Procurar e escolha a saída da função Import chamada movies.star como entrada do arquivo Input movies STAR. Digite dose por quadro no campo Dose por quadro (e/A²) que equivale à dose total dividida pelo número de quadros. Selecione "Não para Salvar" de espectro de energia?.
      2. Na opção Movimento , digite 250 para fator B, 5,5 para número de patches X,Y e 2 para quadros de grupo (garanta a dose do grupo >3). Se os dados não foram referenciados durante o período de coleta, é necessária uma imagem de referência de ganho que pode ser obtida adquirindo uma área de grade em branco. Selecione Não para Usar a própria implementação do RELION e insira o diretório contendo o arquivo executável do MOTIONCOR2³⁹no campo executável MOTIONCOR2 .
      3. Na opção Executar , escolha o MPI apropriado e o número do segmento de acordo com o poder de computação do servidor; aqui, MPI = 8 e roscas = 3 foram utilizados.
   5. Use a função de estimativa CTF para modular a imagem crio-EM da amostra vitrificada⁴⁰. Na opção I/O , clique em Procurar e escolha a saída do cor Motion nomeado micrografo corrigido.star como entrada do arquivo Input movies STAR. Na opção Gctf , selecione Sim para UsarGctf em vez disso?.
   6. Use a função de seleção subconjunto para remover micrografos com um valor de rlnCtfMaxResolutin >4.
      1. Na opção I/O, clique em Procurar localizado à direita de OR select a micrographs.star e escolha a saída do CtfFind nomeado micrographs_ctf.star como entrada. Na opção Subconjunto, selecione Sim para Selecionar com base em valores de metadados?
   7. Escolha manual: escolha algumas imagens manualmente para a escolha e classificação preliminar.
      1. Na opção I/O , clique em Procurar e escolha micrographs_selected.star do diretório select anterior (Passo 2.2.6) como entrada.
      2. Clique em RUN! (uma janela aparece). Clique em Arquivar no canto superior esquerdo da nova janela e clique na seleção Inverte para cancelar a seleção de todas as imagens. Verifique a caixa de seleção mais à esquerda na linha correspondente de cada entrada e clique em escolher para verificar as imagens e selecione ~500 boas imagens. Clique em Arquivo > Salvar seleção para salvar as imagens selecionadas e fechar a janela.
   8. Auto-picking: pacotes automatizados de software de coleta de partículas são úteis e poderosos⁴¹.
      1. Na opção I/O , clique em Procurar à direita de micrografos de entrada para escolher automaticamente micrographs_selected.star do diretório ManualPick anterior (Passo 2.2.7) como entrada. O algoritmo laplaciano-da-gaussiano é usado no início, então selecione Sim para OR: use laplaciano-de-gaussiano.
      2. Na opção Laplacian , defina Min.diâmetro para filtro LoG (A) a 80 e Max.diâmetro para filtro LoG (A) a 130. Na opção Autopicking , defina distância mínima entre partículas (A) a 65 e selecione sim para usar a aceleração da GPU se a GPU puder ser acessada.
   9. Extrair partículas para os próximos passos.
      1. Na opção I/O , clique em Procurar à direita do arquivo STAR de micrografo e escolha o micrographs_selected.star a partir do Passo 2.2.6. Clique em Procurar à direita das coordenadas de entrada e escolha o cords_suffix_autopick.star a partir do Passo 2.2.8.
      2. Na opção Extrair , selecione Sim para partículas de reescala e defina o tamanho redimensionado (pixels) para 128 para acelerar etapas posteriores.
   10. Classificação 2D para classificação preliminar de partículas
       1. Na opção I/O , clique em Procurar à direita do arquivo ESTRELAS de imagens de entrada e escolha as partículas.star do Passo 2.2.9. Na opção Otimização , defina número de classes para 100 e diâmetro da máscara (A) a 140.
       2. Na opção Compute, defina o número de partículas agrupadas para 10, digite o diretório que está em uma unidade local rápida (por exemplo, uma unidade SSD) na partícula Copy para arranhar o campo do diretório e selecione Sim para usar a aceleração da GPU?
   11. Seleção de subconjuntos para selecionar bons resultados 2D como modelos para escolher partículas
       1. Na opção I/O, clique em Procurar à direita de Selecionar classes do model.star e escolha a saída da Etapa 2.2.10 nomeada run_it025_model.star como entrada. Clique em RUN!. Na janela pop-up, verifique classificar imagens e tipo Reverter?
       2. Escolha bons resultados 2D representativos como referência para referência da função de escolha automática .
          NOTA: Os resultados selecionados estão em caixa em vermelho. Os bons e maus resultados de classificação 2D são mostrados mais tarde.
       3. Clique com o botão direito do mouse e selecione Salvar as classes selecionadas.
   12. Use o modelo para a segunda rodada de auto-colheita. Na opção I/O , clique em Procurar à direita de micrografos de entrada para autopick e escolha micrographs_selected.star a partir do Passo 2.2.6. Clique em Procurar à direita de referências 2D, escolha class_averages.star a partir do Passo 2.2.11 e selecione Não para OR: use Laplacian-of-Gaussian.
   13. Realize a extração de partículas novamente usando coord_suffix_autopick.star a partir do Passo 2.2.12 e micrographs_selected.star a partir do Passo 2.2.6.
   14. Execute novamente a classificação 2D usando particles.star a partir da etapa 2.2.13.
   15. Execute novamente a seleção de subconjuntos usando run_it025_optimiser.star a partir do passo 2.2.14.
       NOTA: Todas as imagens 2D com contornos claros e formas corretas precisam ser escolhidas.
   16. Realize a extração de partículas da seguinte forma. Na opção I/O , clique em Procurar à direita do arquivo STAR de micrografo, escolha o micrographs_selected.star do Passo 2.2.6 e selecione Sim para OR re-extrair partículas refinadas?. Clique em Procurar à direita do arquivo STAR de partículas refinadas e escolha as partículas.estrela a partir do Passo 2.2.15.
   17. Modelo inicial 3D e gerando um mapa de referência: Na opção I/O , clique em Procurar à direita do arquivo ESTRELAS de imagens de entrada e escolha as partículas.estrela do Passo 2.2.16. Definir número de classes para 1 e diâmetro da máscara (A) a 140 na opção Otimização .
   18. Classificação 3D e gerar um mapa 3D preliminar: Na opção I/O , clique em Procurar à direita do arquivo STAR de imagens de entrada e escolha as partículas.estrela do Passo 2.2.16. Clique em Procurar à direita do mapa referência e escolha o initial_model.mrc a partir da Etapa 2.2.17. Definir número de classes para 4-6 e diâmetro da máscara (A) a 140 na opção Otimização .
   19. Geração de máscaras: Selecione bons mapas 3D a partir da etapa 2.2.17 como entrada na opção I/O . Defina o limiar inicial de binarização para 0,05 (ajuste com base na saída), Amplie o mapa binário com muitos pixels a 3 e adicione borda macia destes muitos pixels a 8 na opção Máscara .
   20. Use crioSPARC para o próximo processamento.
   21. Crie um novo espaço de trabalho e clique em Job Builder para o primeiro trabalho.
   22. Para importar a pilha de partículas, insira o caminho de partículas (Passo 2.2.16) no campo metaícula de partículas e no caminho do filme (Passo 2.2.16) no campo de caminho de dados de partículas .
       NOTA: Os parâmetros Acelerando a Tensão (kV), a aberração esférica (mm)e o Tamanho do Pixel (Angstrom) são os mesmos de antes. Amplitude O valor (fração) é de 0,1.
   23. Importe volumes 3D entrando no caminho do melhor volume 3D na Etapa 2.2.18 no caminho de dados de volume e selecionando Mapa para Tipo de volume sendo importado.
   24. Importe a máscara entrando no caminho da máscara (Passo 2.2.19) no caminho de dados de volume e selecionando Máscara para Tipo de volume sendo importado.
   25. Refinamento não uniforme: Tome as saídas das etapas 2.2.22, 2.2.23 e 2.2.24 como entrada.
       NOTA: Esta função é muito útil para proteínas de membrana.
       1. Arraste a saída da Etapa 2.2.22 (imported_particles) como a entrada das partículas (partícula) do Refino Não Uniforme, a saída da Etapa 2.2.23 (imported_volume_1) como entrada do volume (volume) do Refinamento Não uniforme e saída da Etapa 2.2.24 (imported_mask_1) como entrada da máscara (máscara) do Refinamento Não uniforme.
          NOTA: Às vezes, melhores resultados podem ser alcançados sem máscara.
       2. Clique em Fila para iniciar o processamento.
   26. Executar passos 2.2.18-2.2.25 para melhores resultados. Através da série acima de processamento, um bom mapa S1PR-Gi 3D pode ser obtido.

3. Ensaio de inibição mediado cAMP mediado por S1PRs-Gi

NOTA: O experimento de inibição mediada por CAMP do S1PRs-Gi foi dividido em várias partes, e os seguintes são procedimentos experimentais detalhados. O princípio experimental e o processo experimental geral são mostrados na forma de um fluxograma na Figura 1.

1. Construção de plasmídeos
   1. Subs clone dos cDNAs do tipo selvagem S1PR1, S1PR3 e S1PR5 no vetor pcDNA3.1+ com uma sequência de sinal HA seguido de uma tag Flag no N-terminus (Tabela de Materiais).
      NOTA: Mutações para todos os receptores foram geradas pelo uso do kit mutagênese (Tabela de Materiais).
2. Preparação do plasmídeo
   1. Adicione os vetores pDNA3.1+ recombinantes ou o sensor plasmid (Tabela de Materiais) a 50 μL de Escherichia coli (E. coli) competente dh5α armazenados em um tubo de 1,5 mL a -80 °C separadamente, e incubar no gelo por 30 minutos. Choque térmico das células a 42 °C por 90 s, transfira-as para o gelo imediatamente, e esfrie-as por 2 minutos.
      NOTA: O plasmídeo sensor fornecido pelo kit de ensaio cAMP de inibição gi (Tabela de Materiais) expressa um gene luciferase modificado fundido com um domínio de ligação cAMP e aumenta a atividade de luminescência quando o cAMP está vinculado.
   2. Agite o tubo a 37 °C por 1h após a suplementação com 300 μL de caldo de lysogeny (LB). Placa 100 μL de células para a placa de ágar LB e incubar a 37 °C mantendo no escuro por 48 h. Inocular a colônia branca em 5 mL de meio LB contendo 100 μg/mL Ampicillin, e cultura a 37 °C por 16 h.
   3. Isolar o DNA usando o kit miniprep plasmídeo (Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante; o plasmídeo estava em uma concentração de mais de 350 ng/μL com o valor de A₂₆₀/A₂₈₀ entre 1,7 e 1,9.
3. Cultura celular
   1. Emplaque as células CHO-K1 em uma placa de Petri de 10 cm, cultue-as em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO₂, e colmeia-as quando a monocamada estiver em 80%-90% de confluência.
   2. Aspire o meio de crescimento das células CHO-K1, adicione 4 mL de 0,05% de trypsin-EDTA pré-aquecido a 37 °C na placa de Petri suavemente, e incubar por 15 s. Em seguida, adicione 4 mL de meio de crescimento composto por F12 médio + 10% FBS.
   3. Desaloja as células da superfície da placa de Petri balançando suavemente e batendo na lateral da placa de Petri. Encha um tubo cônico com suspensão celular. Mexa e pipeta lentamente para remover as aglomerações celulares suavemente.
   4. Centrífugas a 250 x g por 5 min à temperatura ambiente, supernascedores aspiradas e ressuscitadas com 3 mL de PBS. Repita este passo.
   5. Determine o número celular com o hemacítômetro, e as células centrífugas a 250 x g por 5 min a temperatura ambiente.
   6. Tampão PBS aspirado e células CHO-K1 resuspend com 3 mL de meio de crescimento consistindo de F12 médio e 10% FBS.
   7. Adicione 2 mL do meio de crescimento composto por F12 médio e 10% FBS em cada poço da placa de seis poços, e sementes 150 μL de suspensão celular em cada poço para manter as células na densidade de 1,5 x 10⁵ células/mL. Incubar a placa de seis poços em uma incubadora de cultura tecidual de 37 °C com 5% de CO₂ por cerca de 24 h.
4. Transfecção transitória
   1. Diluir 2 μg de DNA (Passo 3.2.3) em 200 μL de tampão de reagente transfecção (Tabela de Materiais). Misture por vórtice para 10 s e girando brevemente antes do uso.
      NOTA: Aqui, os 2 μg de DNA contêm 0,5 μg de vetor receptor (S1PR1, S1PR3 ou S1PR5) e 1,5 μg do sensor plasmid.
   2. Adicione 4 μL do reagente de transfecção (Tabela de Materiais), vórtice para 10 s e gire brevemente antes de usar. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
   3. Lentamente deixe cair 200 μL de mistura de transfecção em cada poço (contendo células CHO-K1) para distribuir uniformemente. Agite suavemente a placa de seis poços para garantir a mistura completa.
   4. Substitua o meio de transfecção após 4-6 h pelo meio de crescimento celular composto por F12 médio + 10% FBS, e devolva a placa de seis poços à incubadora.
   5. Células de colheita 24-48 h pós-transfecção.
      1. Digerir as células CHO-K1 no poço com 500 μL de 0,05% de trypsin-EDTA (pré-aquecido a 37 °C) para 15 s e 1 mL de meio de crescimento composto por F12 médio + 10% FBS. Desaloja as células da superfície do poço balançando e tocando suavemente o lado do poço.
      2. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico e centrífuga a 250 x g por 5 min a temperatura ambiente. Despeje o supernasce e colde as células transfeinadas.
         NOTA: Antes da determinação do sinal de fluorescência, verifique os níveis de expressão da superfície celular dos receptores por ELISA, conforme descrito anteriormente²⁶.
5. Equilíbrio com sal de potássio D-Luciferina (Tabela de Materiais)
   1. Suspenda as células colhidas (24-48 h pós-transfecção) com 3 mL de tampão de ensaio imediatamente (ou seja, Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) contendo 10 mM HEPES pH 7.4), com uma diluição adicional de 3% v/v do sal de potássio D-Luciferin.
   2. Adicione 90 μL de suspensão celular por poço de uma placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal e misture suavemente.
   3. Incubar por 40 minutos em temperatura ambiente.
6. Determinação do sinal de fluorescência
   1. Prepare com antecedência 10 mM soluções de estoque de Siponimod dissolvido em DMSO e faça uma diluição serial usando tampão HBSS contendo 25 μM forskolin antes da estimulação de ligantes.
      NOTA: Exceto para o grupo controle sem ligante, o restante tem uma faixa de gradiente de concentração de ^10-11-10-5 mol/L.
   2. Estimular com 10 μL (por poço) de solução agonista em diferentes concentrações por 30 min.
   3. Conte os sinais de luminescência em um leitor de microplaca usando os parâmetros de software associados (Tabela de Materiais) da seguinte forma. Selecione Luminescência para Método de Detecção, Ponto final para Tipo de Leitura e Fibra de Luminescência para Tipo de Óptica. Defina o ganho óptico para 255.
      NOTA: Cada medida foi repetida em pelo menos três experimentos independentes, cada um em triplicado.
   4. Obtenha os valores do sinal de fluorescência, importe os dados em um programa de planilha e processe os dados usando a função de resposta dose de regressão não linear (ajuste de curva).

Figura 1: Ilustração esquemática do experimento. Um guia detalhado para a configuração e execução experimental. Resumindo, o receptor e a luciferase modificada foram transitoriamente co-expressos em células CHO-K1, transfernando o receptor e o sensor plasmid nas células com reagente de transfecção. As células foram suspensas em solução HBSS com sal D-Luciferin-potássio, o substrato de luciferase e semeadas em uma placa de 96 poços após 24 horas. Para permitir a permeação nas células, a D-luciferina deve ser pré-equilibrada com as células. A enzima oxidativa luciferase transforma a luciferina em oxiluciferina e emite luz. A luciferase modificada, por outro lado, gera luz através de uma reação química somente quando ligada ao cAMP, e a intensidade da luz tem uma associação positiva com os níveis de cAMP nas células. Os níveis de cAMP foram regulados com GPCR ativado por agonista. Receptores acoplados gi reduziram os níveis de cAMP, exigindo a adição de forskolin para ativar o cyclase adenylyl no experimento gi-inhibition cAMP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Antes de congelar a amostra do complexo S1PRs-Gi, a amostra purificada precisa ser separada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e analisada com cromatografia de filtração de gel. A Figura 2 mostra o complexo S1PR3-Gi como exemplo. A fração máxima do complexo proteico GPCR-G homogêneo foi geralmente localizada a ~10,5 mL da cromatografia de exclusão de tamanho (Figura 2A). A análise de página SDS do complexo S1PR3-Gi (Figura 2B) revela quatro bandas correspondentes às bandas teóricas de S1PR3, Gαi, Gβ e scFv16, e assim sugere que o complexo foi purificado com sucesso. A banda receptora foi frequentemente encontrada difundida devido a diferentes graus de modificação (glicosylation ou palmitoylation), e a banda de Gγ não foi encontrada.

Figura 2: Análise dos resultados da purificação de proteínas (A) Cromatograma de filtragem de gel mostrando a fração máxima correspondente à proteína. (B) Padrão de eletroforese de gel de página SDS. Este número foi adaptado da referência27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As frações complexas do complexo S1PR3-Gi foram coletadas e concentradas para microscopia eletrônica. Os procedimentos para resultados representativos de vitrificação de grade e triagem amostral foram discutidos anteriormente34. Um fluxograma (Figura 3) é apresentado para obter uma estrutura de alta resolução do complexo proteico S1PRs-G utilizando duas plataformas de processamento diferentes: RELION-3 e crioSPARC v3.

Figura 3: Fluxo de trabalho de processamento de dados dos complexos S1PR3-Gi-scFv16 vinculados a pFTY720. O fluxograma de fluxo de processamento de dados Cryo-EM do complexo pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16 é mostrado. A coleta automática de micrografo crio-EM representativa, as médias de classificação 2D, as reconstruções 3D e o refinamento não uniforme do complexo pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16 são mostrados na figura. Este valor foi modificado a partir da referência27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os filmes foram importados para o RELION-3 em primeiro lugar, e posteriormente a correção de movimento e a estimativa de CTF foram realizadas para gerar micrografias médias. Ao colher partículas e classificação 2D iterativa, partículas melhores foram adquiridas para posterior processamento. É fundamental selecionar partículas com classes 2D bem definidas que representam claramente as informações estruturais secundárias do complexo S1PR3-Gi (Figura 4A), pois partículas de má qualidade podem obstruir estágios subsequentes de processamento (Figura 4B), resultando em uma reconstrução de menor resolução. Utilizando classificação 3D, as partículas foram ainda classificadas para excluir partículas de ruído, distinguir diferentes conformações possíveis e produzir múltiplas reconstruções 3D. Eventualmente, um mapa EM complexo S1PR3-Gi (Figura 5A) foi produzido com boa resolução via Fourier Shell Correlation (FSC) (Figura 5B), através de Refinamento Não Uniforme.

Figura 4: Selecionando classes 2D. (A,B) Resultados da classificação 2D. (A) Selecione as médias da classe 2D contendo classes bem definidas para processamento posterior, e (B) rejeitem partículas parciais ou partículas com baixa resolução e ruído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Estrutura de alta resolução dos complexos S1PR3-Gi-scFv16 com destino a pFTY720. (A) A estrutura de alta resolução do complexo PFTY720 bound S1PR3 exibe densidade crio-EM bem definida representando elementos da estrutura proteica S1PR3 e Gi. (B) Curva de correlação de conchas Fourier padrão-ouro (FSC) para o complexo S1PR3-Gi com destino a pFTY720. Este número foi adaptado da referência27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ao resolver as estruturas do complexo proteico S1PRs-G com crio-EM, elucidamos o mecanismo de ativação, reconhecimento seletivo de medicamentos e acoplamento de proteína G usando ensaios funcionais na célula. O ensaio de inibição de Gi cAMP mede as alterações no nível de concentração de cAMP nas células (Figura 1), e foi frequentemente utilizado para validar a potência de ativação dos receptores acoplado com Gs ou Gi.

A razão de concentração do receptor para o plasmídeo sensor no sistema de experimentos é crucial para a viabilidade experimental. Assim, para realizar a análise funcional de forma eficaz e precisa, deve-se escolher uma razão de concentração plasmida com um valor máximo E. Neste experimento, foram investigadas três razões de concentração (1:1, 1:3 e 1:9) de receptor para sensor plasmid. Os resultados mostraram que um valor máximo E foi obtido quando a razão de concentração do receptor para o plasmídeo sensor foi de 1:3 (Figura 6).

Figura 6: O efeito de diferentes razões de concentração de S1PR3 para sensor plasmídeo no período da janela foi explorado na linha celular CHO-K1. Os dados são apresentados como meios ± SEM de três experimentos independentes realizados em triplicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além da razão de concentração do receptor para o plasmídeo sensor, as linhas celulares empregadas neste experimento também foram importantes. Não houve diferença substancial entre as linhas celulares HEK293 e CHO-K1 para a maioria dos receptores. As linhas celulares CHO-K1, por outro lado, tinham uma curva geral mais realista do que as células HEK293 para S1PR3 (Figura 7). Portanto, as células CHO-K1 foram escolhidas para a verificação do experimento funcional de S1PR3.

Figura 7: O efeito de diferentes razões de concentração de S1PR3 para sensor plasmídeo no período da janela foi explorado na linha celular HEK293. Os dados são apresentados como meios ± SEM de três experimentos independentes realizados em triplicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm conflitos de interesse.