Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En rørledning til undersøgelse af strukturer og signalveje for sphingosin-1-phosphatreceptorer

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/64054
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1, 1, 1
1Division of Nephrology and Kidney Research Institute, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University
* These authors contributed equally

Summary

S1P udøver sine forskellige fysiologiske virkninger gennem S1P-receptorer (S1PRs) underfamilien. Her beskrives en rørledning for at forklare strukturerne og funktionen af S1PR'er.

Abstract

Lysophospholipider (LPL'er) er bioaktive lipider, der inkluderer sphingosin-1-phosphat (S1P), lysophosphatidinsyre osv. S1P, et metabolisk produkt af sphingolipider i cellemembranen, er en af de bedst karakteriserede LPL'er, der regulerer en række cellulære fysiologiske reaktioner via signalveje medieret af sphingosin-1-phosphatreceptorer (S1PR'er). Dette implicerede, at S1P-S1PRs signalsystem er et bemærkelsesværdigt potentielt terapeutisk mål for lidelser, herunder multipel sklerose (MS), autoimmune lidelser, kræft, betændelse og endda COVID-19. S1PR'er, en lille delmængde af klasse A G-proteinkoblet receptor (GPCR) familien, består af fem undertyper: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 og S1PR5. Manglen på detaljerede strukturelle oplysninger hindrer imidlertid lægemiddelopdagelsen rettet mod S1PR'er. Her anvendte vi kryo-elektronmikroskopimetoden til at løse strukturen af S1P-S1PRs-komplekset og belyste mekanismen for aktivering, selektiv lægemiddelgenkendelse og G-proteinkobling ved hjælp af cellebaserede funktionelle assays. Andre lysophospholipidreceptorer (LPLR'er) og GPCR'er kan også undersøges ved hjælp af denne strategi.

Introduction

Sphingosin-1-phosphat (S1P), et metabolisk produkt af sphingolipider i cellemembranen, er et allestedsnærværende lysophosphatid signalmolekyle, der involverer forskellige biologiske aktiviteter, herunder lymfocythandel, vaskulær udvikling, endotelintegritet og puls 1,2,3. S1P udøver sine forskellige fysiologiske virkninger gennem fem S1P-receptorundertyper (S1PR'er 1-5); S1PR'er findes i en række væv og udviser unikke præferencer for downstream G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært koblet med Gi-proteinet, som efterfølgende hæmmer cAMP-produktionen; S1PR2 og S1PR3 er koblet med Gi, Gq og G12/13, og S1PR4 og S1PR5 transduce signal gennem Gi og G12/136.

S1P-S1PR-signalering er et kritisk terapeutisk mål for flere sygdomme, herunder autoimmune lidelser7, betændelse8, kræft9 og endda COVID-1910. I 2010 blev fingolimod (FTY720) licenseret som et førsteklasses lægemiddel rettet mod S1PR'er til behandling af tilbagefald multipel sklerose (MS)11. Det er imidlertid i stand til at binde til alle S1PR'er undtagen S1PR2, mens uspecifik binding til S1PR3 resulterer i ødem i hjernebarken, vaskulær og bronchial indsnævring og lungeepitellækage12. Som en alternativ strategi til at øge terapeutisk selektivitet er subtypespecifikke ligander til receptoren blevet produceret. Siponimod (BAF312) blev godkendt i 2019 til behandling med tilbagefald af MS13; det er effektivt rettet mod S1PR1 og S1PR5, mens det ikke har nogen affinitet for S1PR3 og udviser færre bivirkninger i klinisk praksis14. I 2020 godkendte den amerikanske Food and Drug Administration ozanimod til MS-terapi15. Det er blevet rapporteret, at ozanimod har en 25 gange større selektivitet for S1PR1 end for S1PR516. Især i forbindelse med den nuværende COVID-19-pandemi er det blevet opdaget, at agonistlægemidler rettet mod S1PR'er kan bruges til behandling af COVID-19 ved hjælp af immunmodulerende terapiteknikker17. I sammenligning med fingolimod har ozanimod vist overlegenhed med hensyn til at sænke symptomer hos COVID-19-patienter og gennemgår nu kliniske forsøg10. Forståelse af det strukturelle grundlag og funktionen af S1PR'er lægger et væsentligt fundament for at udvikle et lægemiddel, der selektivt er målrettet mod S1PR'er18.

Mange teknikker bruges til at undersøge de strukturelle oplysninger om biomacromolecules, herunder røntgenkrystallografi, nuklear magnetisk resonans (NMR) og elektronmikroskopi (EM). Fra marts 2022 er der mere end 180.000 strukturer deponeret på Protein Databank (PDB), og de fleste af dem er blevet løst ved røntgenkrystallografi. Men med den første næsten-atomare opløsningsstruktur af TPRV1 (3.4 Å-opløsning) rapporteret af Yifan Cheng og David Julius i 201319 er kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) blevet en almindelig teknik til proteinstrukturer, og det samlede antal EM PDB-strukturer var mere end 10.000. De kritiske gennembrudsområder er udviklingen af nye kameraer til billeddannelse kendt som direkte elektrondetekteringskameraer og nye billedbehandlingsalgoritmer. Cryo-EM har revolutioneret strukturbiologi og strukturbaseret lægemiddelopdagelse i det sidste årti20. Da forståelse af, hvordan makromolekylære komplekser opfylder deres komplicerede roller i den levende celle, er et centralt tema i biologiske videnskaber, har cryo-EM potentialet til at afsløre konformationer af dynamiske molekylære komplekser, især for transmembranproteiner21. G-protein koblede receptorer (GPCR'er) er den største superfamilie af transmembranproteiner og målene for mere end 30% af de aktuelt markedsførte lægemidler22. Udviklingen af cryo-EM har bidraget til et udbrud af højopløsningsstrukturer af GPCR-G-proteinkomplekser, hvilket muliggør strukturel bestemmelse for 'uhåndterlige' mål, der stadig ikke er tilgængelige for røntgenkrystallografisk analyse i lægemiddeldesign23. Derfor giver cryo-EM-applikationen en chance for at bestemme den tredimensionelle struktur af GPCR'er under næsten indfødte forhold ved tæt på atomopløsning24. Fremskridt inden for cryo-EM gør det muligt at visualisere mekanistiske underlag for GPCR-stimulering eller -hæmning og yderligere fordele ved at afdække de nye bindingssteder for GPCR-målrettet lægemiddelskabelse25.

Baseret på de enorme fremskridt inden for cryo-EM-teknologi har vi identificeret strukturer af forpinte S1PR1-, S1PR3- og S1PR5-Gi-signalkomplekser for nylig26,27. Hos mennesker findes S1PR'er i forskellige væv og udviser unikke præferencer for downstream G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært kombineret med Gi-proteinet, som efterfølgende hæmmer produktionen af 3′,5′-cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP). S1PR3 og S1PR5 er også i stand til at koble med Gi 6,28. Da Gi-koblet receptoraktivering nedsætter produktionen af cAMP29, blev der introduceret et Gi-hæmning cAMP-assay til måling af cAMP-hæmningseffekter til indfangning af funktionelle ændringer26,27. Ved hjælp af en mutant version af Photinus pyralis luciferase, hvor en cAMP-bindende proteindel er indsat, tilbyder dette cAMP-assay en enkel og pålidelig metode til overvågning af GPCR-aktivitet gennem ændringer i intracellulær cAMP-koncentration30. Det er et følsomt og ikke-radioaktivt funktionelt assay og kan anvendes til at overvåge realtids downstream-signalering af en lang række GPCR'er til lægemiddelopdagelsesformål31.

Her gives et resumé af de kritiske metoder til løsning af aktiverings- og lægemiddelgenkendelsesmetoderne for S1PR'er, primært inklusive kryo-EM-manipulationer og et Gi-hæmnings-cAMP-assay. Denne artikel har til formål at give omfattende eksperimentel vejledning til yderligere udforskninger af GPCR'ernes strukturer og funktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Oprensning af S1PRs-G proteinkompleks

  1. For at rense det humane S1PRs-G-proteinkompleks klones cDNA'erne for S1PR1, der mangler C-terminale rester 338-382, vildtypen S1PR3, S1PR5 afkortet med 345-398 ved C-endestation, og vildtype Gi1 i pFastBac1-vektoren og cDNA'erne for vildtype Gβ1 og Gγ2 i pFastBacdual-vektoren (Materialetabel).
    BEMÆRK: Alle konstruktioner til S1PR'er indeholder også hæmagglutinin (HA) signalsekvens efterfulgt af et Flag epitope tag ved N-terminalen og et 10x hans tag ved C-terminus. En syntetisk DNA-sekvens (Material Table of Materials) til oversættelse af T4-lysozym (T4L) blev også indsat i N-terminalen af S1PR'er for at lette receptorekspression og oprensning.
  2. Fremstilling af baculovirus, der koder for S1PR'er, Gi1 og Gβ1γ2
    1. De rekombinante vektorer tilsættes til 50 μL DH5α kompetente Escherichia coli (E. coli), der opbevares i et 1,5 ml rør ved -80 °C, og der inkuberes på is i 30 minutter.
    2. Varmechok cellerne ved 42 °C i 90 s, overfør dem straks til isen og nedkøl dem i 2 min.
    3. Ryst røret ved 37 °C i 3-5 timer efter supplering med 300 μL lysogen bouillon (LB) medium. Plade 100 μL celler til LB-agarpladen og inkuberes ved 37 °C ved at holde den i mørke i 48 timer.
    4. Den hvide koloni podes i 5 ml LB-medium indeholdende 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin og 7 μg/ml gentamicin og dyrkning ved 37 °C i 16 timer.
    5. Isoler det rekombinante bacmid med plasmid miniprep kit (Materialetabel) efter producentens anvisninger til fremstilling af P0 baculovirus.
      BEMÆRK: Før brug blev det rensede bacmid analyseret af PCR med pUC / M13 fremad og omvendt primere. For PCR, antal cyklusser = 30 cyklusser, smeltetemperatur = 58 °C og forlængelsestid = 1 minut pr. 1 Kb.
    6. Forbered P0 baculovirus som beskrevet i en tidligere protokol32.
      1. Sf9-cellerne (ESF921-medium) dyrkes i plader med seks brønde, og det kontrolleres, at cellerne er i logfasen (1,0-1,5 x 106 celler/ml).
      2. 8 μL baculovirustransfektionsreagens fortyndes i 100 μL Graces medium, og der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Fortynd 10 μg af det rekombinante bacmid i 100 μL graces medium, og bland forsigtigt. Kombiner det fortyndede bacmid med fortyndet baculovirustransfektionsreagens, bland forsigtigt og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
      3. Blandingen (bacmid og reagens) tilsættes cellerne (trin 1.2.6.1), og de anbringes ved 27 °C i 3 timer.
      4. Fjern Graces medium, og erstat det med 2 ml ESF921-cellekulturmedium. Pladerne med seks brønde anbringes ved 27 °C, og ESF921-cellekulturmediet opsamles efter 5 dage efter transfektion.
      5. Centrifuger ved 500 x g ved 4 °C i 10 minutter for at fjerne celler og snavs. Overfør supernatanten til 2 ml rør. Dette er P0 baculovirus-bestanden.
    7. Isoler P1-virusbestand
      1. 30 ml sf9-celler overføres til en konisk flaske, dyrkes ved 27 °C med omrystning ved 270 o/min., og det kontrolleres, at cellerne når en logfase (1,0-1,5 x 106 celler/ml).
      2. Der tilsættes 2 ml P0-viruslager til flasken, og der omrystes ved 270 o/min i 4 dage ved 27 °C.
      3. Cellerne overføres til et 50 ml rør, centrifugeres ved 1.800 x g i 10 minutter ved 4 °C for at fjerne celler og snavs, og supernatanten overføres til 50 ml rør. Dette er P1 baculovirus-aktien.
    8. Forstærk baculoviral bestand
      1. Trin 1.2.7 gentages med 50 ml sf9-celler i logfasen (1,0-1,5 x 106 celler/ml) og 1 ml P1-lager.
      2. Det resulterende P2 baculoviruslager opbevares ved 4 °C og beskytter det mod lys.
        BEMÆRK: Forstærk ikke baculoviruset på ubestemt tid, da de skadelige mutanter blev produceret med hver passage.
  3. Ekspression af S1PRs-G proteinkompleks
    1. Kultur sf9 insektceller for at nå 2,5 x 106 celler / ml tæthed, co-inficere med P2 baculovirus, der koder for S1PR'er, Gi1 og Gβ1γ2 i et volumenforhold på 1: 2: 1, og kultur igen ved 27 ° C i 48 timer.
    2. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 700 x g ved 4 °C i 15 min., dem fryses i flydende nitrogen, og de opbevares ved -80 °C til brug.
  4. Protein oprensning
    1. Optø cellepillen opnået i trin 1.3 ved stuetemperatur, og resuspender den derefter i lysisbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2) suppleret med 100 μg / ml benzamidin, 100 μg / ml leupeptin, 100 μg / ml aprotinin, 25 mU / ml apyrase og 10 μM agonist. Cellesuspensionen omrøres ved stuetemperatur i 2 timer for at inducere dannelsen af S1PRs-G-proteinkomplekset.
      BEMÆRK: Apyrase er en ATP-diphosphohydrolase. Det katalyserer fjernelsen af gammaphosphatet fra ATP og betaphosphatet fra ADP.
    2. Opløsningen overføres til rørene, centrifugeres ved 70.000 x g i 10 min, og supernatanten fjernes forsigtigt. Resuspender pelleten i opløsende buffer (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 0,5% (w/v) LMNG, 0,1% (w/v) CHS, 1% (w/v) natriumcholat, 10% (v/v) glycerol).
    3. Overfør suspensionen til en glas Dounce og homogeniser pelleten fuldt ud. Der tilsættes 10 μM agonist, 4 mg scFv16, 100 μg/ml benzamidin, 100 μg/ml leupeptin, 100 μg/ml Aprotinin og 25 mU/ml apyrase til suspensionen, og der omrøres ved 4 °C i 2 timer.
      BEMÆRK: Trinene til homogenisering af pellets er afgørende for produktionen af GPCR-G-proteinkomplekset.
    4. Opløsningen overføres til rørene, og centrifuger ved 100.000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
    5. Forligeksilirere flagharpiksen med vaskebufferen (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 10 μM agonist, 0,0375% (w/v) LMNG, 0,0125% (w/v) GDN, 0,01% (w/v) CHS).
    6. Supernatanten overføres til rørene, og der inkuberes med flagharpiksen ved 4 °C i 2 timer.
    7. Hæld ovennævnte blanding på glassøjlen, og søjlen vaskes med 50 ml vaskebuffer suppleret med 100 μg/ml benzamidin, 100 μg/ml leupeptin og 100 μg/ml aprotinin.
    8. Eluter søjlen med 10 ml elueringsbuffer indeholdende 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 200 μg/ml Flagpeptid, 10 μM agonist, 0,0375% (w/v) LMNG, 0,0125% (w/v) GDN, 0,01% (w/v) CHS, 100 μg/ml benzamidin, 100 μg/ml leupeptin og 100 μg/ml aprotinin.
    9. S1PRs-G-proteinkomplekset opsamles, og der koncentreres til 1 ml ved hjælp af en 100 kDa afskæringskoncentrator ved 1.300 x g ved 4 °C. Der filtreres gennem et 0,22 μM-filter, og der centrifugeres ved 13.000 x g i 10 minutter ved 4 °C for at fjerne aggregaterne.
    10. S1PRs-G-proteinkomplekset hældes på en SEK-gelfiltreringskolonne (size-exclusion chromatography) præekvilibreret med SEC-bufferen indeholdende 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 μM agonist, 100 Μm TCEP, 0,00375 % (w/v) LMNG, 0,00125 % (w/v) GDN og 0,001 % (w/v) CHS ved en strømningshastighed på 0,5 ml/min ved 4 °C.
    11. Topfraktionerne opsamles, og der koncentreres ved hjælp af en 100 kDa afskæringskoncentrator ved 1.300 x g ved 4 °C for kryo-EM.

2. Elektronmikroskopi for at løse S1PRs-strukturen

  1. Dataindsamling
    1. For at forberede cryo-EM-gitrene skal du holde 300-mesh Au R1.2/1.3 gitre i 10 s og glødeudladning i 60 s ved 15 mA ved hjælp af et glødeudladningsrensningssystem.
    2. Prøveforglasning udføres som beskrevet tidligere 33,34. I dyk-frysekonsollen skal du indstille temperaturen til 4 °C og den relative luftfugtighed til 100 % for kammerets arbejdsmiljø. Brug blotkraft til 0, ventetid på 0 s, blottid på 2 eller 3 s og afløbstid på 0 s. Det kræver normalt kun 3 μL af prøven i koncentrationer på 5-10 mg / ml til enkelt vitrifikation.
    3. Klip og indlæs gitre i auto grid-samling, indlæs auto grid-samling i Nanocab, og indlæs Nanocab i mikroskopet med autoloader som beskrevet tidligere35. Skærmeksempelkvalitet med EPU2-software34. Normalt var de data, der blev indsamlet i områderne med passende istykkelse, bedre.
    4. Indsamle cryo-EM-data som beskrevet detaljeret tidligere35. For S1P-receptoren indstilles defokusforskydningen mellem -1,0 μm og -1,8 μm med eksponeringselektrondosis på 50-65 e-/Å2. For S1PR1-Gi-komplekserne skal du indsamle filmstak automatisk ved hjælp af EPU2-software i tælletilstand med K2-detektoren ved en samlet eksponeringstid på 2 s, en optagelseshastighed på fem råbilleder i sekundet og en samlet dosis på 56 e-/Å2 for at producere 35 billeder pr. stak.
      BEMÆRK: Normalt er der brug for mere end 5.000 film for at genopbygge receptorstrukturen.
  2. Behandle dataene ved hjælp af en kombination af RELION36 og cryoSPARC37 for at opnå et ideelt kryo-EM-tæthedskort. Brug RELION-3.1_gpu_ompi4 til at behandle dataene oprindeligt, hvilket involverer lignende operationer som beskrevet tidligere34.
    1. I Linux-systemterminalen skal du indtaste den overordnede mappe i datalagringsmappen.
    2. Indtast relion-kommandoen i terminalen for at åbne den RELION grafiske brugergrænseflade (GUI).
      BEMÆRK: Hvis det er første gang, en RELION GUI er blevet åbnet i denne mappe, vises et promptvindue; klik på Ja.
    3. Klik på Importer i funktionslinjen i højre side af RELION GUI for at importere rådata til RELION.
      1. I indstillingen Film/mikrofoner skal du vælge Ja for Importer rå film/mikrografer?, indtaste datastien i feltet Rå inputfiler (jokertegn anbefales), og vælge Ja for Er disse film med flere rammer?. Indtast pixelstørrelsen på film i pixelstørrelsesfeltet (Angstrom), mikroskopets driftsspænding (i kV) i spændingsfeltet (kV) og mikroskopets sfæriske afvigelse i feltet Sfærisk aberration (mm). Dette er de parametre, der blev registreret på tidspunktet for dataindsamlingen.
      2. I indstillingen Kørsel skal du ændre kønavnet i henhold til den server, hvor programmet kører (andre funktioner skal også ændre denne parameter). Lad de andre parametre stå ved de standardværdier, der er indstillet af RELION. Endelig, når alle parametre er registreret korrekt, skal du klikke på KØR! for at køre programmet.
    4. Brug funktionen Bevægelseskorrektion til justering af alle rammer38.
      1. I I / O-indstillingen skal du klikke på Gennemse og vælge outputtet af Importfunktion med navnet movies.star som input af Input film STAR-fil. Indtast dosis pr. ramme i feltet Dosis pr. ramme (e/A2), som er lig med den samlede dosis divideret med antallet af rammer. Vælg Nej for Gem sum af effektspektre?.
      2. I indstillingen Bevægelse skal du angive 250 for B-faktor, 5,5 for Antal programrettelser X,Y og 2 for Grupperammer (sørg for dosis af gruppe >3). Hvis der ikke blev henvist til data i indsamlingsperioden, er der behov for et forstærkningsreferencebillede, som kan fås ved at erhverve et tomt gitterområde. Vælg Nej til brug RELIONs egen implementering? og indtast mappen, der indeholder den eksekverbare fil i MOTIONCOR239i det eksekverbare felt MOTIONCOR2 .
      3. I indstillingen Kørende skal du vælge det relevante MPI- og trådnummer i henhold til serverens computerkraft; her blev MPI = 8 og tråde = 3 brugt.
    5. Brug CTF-estimeringsfunktionen til at modulere kryo-EM-billedet af forglasset prøve40. I I / O-indstillingen skal du klikke på Gennemse og vælge outputtet af Motion cor navngivet korrigeret mikrografer.star som input af Input film STAR-fil. I indstillingen Gctf skal du vælge Ja til UseGctf i stedet?.
    6. Brug funktionen Tilvalg af undersæt til at fjerne mikrografer med værdien rlnCtfMaxResolutin >4.
      1. I I / O-indstillingen skal du klikke på Gennemse placeret til højre for ELLER vælge fra micrographs.star og vælge outputtet fra CtfFind navngivet micrographs_ctf.star som input. I indstillingen Undersæt skal du vælge Ja for Vælg baseret på metadataværdier? og angive 4 for værdien Maksimum metadata for at fjerne dårlige data.
    7. Manuel plukning: Vælg nogle billeder manuelt til den foreløbige plukning og klassificering.
      1. I I / O-indstillingen skal du klikke på Gennemse og vælge micrographs_selected.star fra den forrige Vælg mappe (trin 2.2.6) som input.
      2. Klik på KØR! (et vindue dukker op). Klik på Filer i øverste venstre hjørne af det nye vindue, og klik på Inverter valg for at annullere valget af alle billeder. Marker valgfeltet længst til venstre i den tilsvarende række for hver post, og klik på vælg for at kontrollere billederne og vælge ~ 500 gode billeder. Klik på File > Gem valg for at gemme de valgte billeder og lukke vinduet.
    8. Automatisk plukning: automatiserede softwarepakker til partikelplukning er nyttige og kraftfulde41.
      1. I I / O-indstillingen skal du klikke på Gennemse til højre for Input mikrografer til autopick og vælge micrographs_selected.star fra den forrige ManualPick-mappe (trin 2.2.7) som input. Den Laplacian-of-Gaussian algoritme bruges i starten, så vælg Ja for OR: brug Laplacian-of-Gaussian.
      2. I indstillingen Laplacian skal du angive Min.diameter for LoG-filter (A) til 80 og Max.diameter for LoG-filter (A) til 130. I indstillingen Autopicking skal du indstille Minimum afstand mellem partikler (A) til 65 og vælge Ja til brug GPU-acceleration , hvis GPU kan tilgås.
    9. Uddrag partikler til de næste trin.
      1. I indstillingen I / O skal du klikke på Gennemse til højre for mikrograf STAR-filen og vælge micrographs_selected.star fra trin 2.2.6. Klik på Gennemse til højre for Inputkoordinater, og vælg cords_suffix_autopick.star fra trin 2.2.8.
      2. I indstillingen Udtræk skal du vælge Ja for skalering af partikler og indstille den skalerede størrelse (pixels) til 128 for at fremskynde senere trin.
    10. 2D-klassificering til foreløbig klassificering af partikler
      1. I I / O-indstillingen skal du klikke på Gennemse til højre for Input billeder STAR-fil og vælg particles.star fra trin 2.2.9. I indstillingen Optimering skal du angive Antal klasser til 100 og Maskediameter (A) til 140.
      2. I indstillingen Beregn skal du indstille Antal grupperede partikler til 10, indtaste den mappe, der er på et hurtigt lokalt drev (f.eks. et SSD-drev) i feltet Kopier partikel til ridser i biblioteksfeltet , og vælg Ja til brug GPU-acceleration? for hurtigere behandlingshastighed.
    11. Valg af delmængde til valg af gode 2D-resultater som skabeloner til valg af partikler
      1. I I / O-indstillingen skal du klikke på Gennemse til højre for Vælg klasser fra model.star og vælge output fra Trin 2.2.10 med navnet run_it025_model.star som input. Klik på KØR!. I pop op-vinduet skal du markere Sorter billeder på og Omvendt sortering? og klikke på Skærm!.
      2. Vælg gode repræsentative 2D-resultater som reference for reference til funktionen Automatisk plukning .
        BEMÆRK: De valgte resultater er markeret med rødt. De gode og dårlige 2D-klassificeringsresultater vises senere.
      3. Højreklik og vælg Gem valgte klasser.
    12. Brug skabelonen til den anden runde af automatisk plukning. I indstillingen I / O skal du klikke på Gennemse til højre for Input mikrografer til autopick og vælge micrographs_selected.star fra trin 2.2.6. Klik på Gennemse til højre for 2D-referencer, vælg class_averages.star fra trin 2.2.11, og vælg Nej til ELLER: brug Laplacian-of-Gaussian.
    13. Partikelekstraktion udføres igen ved hjælp af coord_suffix_autopick.star fra trin 2.2.12 og micrographs_selected.stjerne fra trin 2.2.6.
    14. Udfør 2D-klassificering igen ved hjælp af particles.star fra trin 2.2.13.
    15. Udfør undersætmarkering igen ved hjælp af run_it025_optimiser.star fra trin 2.2.14.
      BEMÆRK: Alle 2D-billeder med klare konturer og korrekte former skal vælges.
    16. Udfør partikelekstraktion som følger. I I / O-indstillingen skal du klikke på Gennemse til højre for mikrograf STAR-filen, vælge micrographs_selected.star fra trin 2.2.6 og vælge Ja for ELLER udtrække raffinerede partikler igen?. Klik på Gennemse til højre for Raffinerede partikler STAR-fil og vælg particles.star fra trin 2.2.15.
    17. 3D indledende model og generering af et referencekort: I I / O-indstillingen skal du klikke på Gennemse til højre for Inputbilleder STAR-fil og vælge particles.star fra trin 2.2.16. Angiv Antal klasser til 1 og Maskediameter (A) til 140 i indstillingen Optimering .
    18. 3D-klassificering og generering af et foreløbigt 3D-kort: I I/ O-indstillingen skal du klikke på Gennemse til højre for Inputbilleder STAR-fil og vælge particles.star fra trin 2.2.16. Klik på Gennemse til højre for referencekortet , og vælg initial_model.mrc fra trin 2.2.17. Angiv Antal klasser til 4-6 og Maskediameter (A) til 140 i indstillingen Optimering .
    19. Maskegenerering: Vælg gode 3D-kort fra trin 2.2.17 som input i I/O-indstillingen . Indstil den indledende binariseringstærskel til 0,05 (juster baseret på outputtet), Udvid binær tilknytning af så mange pixels til 3, og Tilføj soft-edge af så mange pixels til 8 i masken .
    20. Brug cryoSPARC til næste behandling.
    21. Opret et nyt arbejdsområde, og klik på Job Builder for det første job.
    22. Hvis du vil importere partikelstakken, skal du indtaste partikelstien (trin 2.2.16) i feltet Partikelmetavej og filmens sti (trin 2.2.16) i feltet Partikeldatasti .
      BEMÆRK: Parametrene Accelererende spænding (kV), sfærisk aberration (mm) og pixelstørrelse (Angstrom) er de samme som før. Amplitude Kontrast (fraktion) værdi er 0,1.
    23. Importer 3D-diskenheder ved at angive stien til den bedste 3D-diskenhed i trin 2.2.18 i stien til dataenheden og vælge Afknyt for Type af diskenhed, der importeres.
    24. Importer maske ved at indtaste maskestien (Trin 2.2.19) i datastien Volumen og vælge Maske for Type af volumen, der importeres.
    25. Ikke-ensartet raffinement: Tag output fra trin 2.2.22, 2.2.23 og 2.2.24 som input.
      BEMÆRK: Denne funktion er meget nyttig til membranproteiner.
      1. Træk outputtet fra trin 2.2.22 (imported_particles) som input fra partiklerne (partikel) fra Ikke-uniform Refinement, outputtet fra trin 2.2.23 (imported_volume_1) som input fra Ikke-ensartet raffinements volumen (volumen) og output fra trin 2.2.24 (imported_mask_1) som input fra Ikke-ensartet raffinerings maske (maske).
        BEMÆRK: Nogle gange kan der opnås bedre resultater uden maske.
      2. Klik på Kø for at starte behandlingen.
    26. Kør trin 2.2.18-2.2.25 for bedre resultater. Gennem ovenstående behandlingsserie kan der opnås et S1PR-Gi 3D-kort med god opløsning.

3. S1PRs-Gi medieret cAMP-hæmningsassay

BEMÆRK: S1PRs-Gi-medieret cAMP-inhiberingseksperiment blev opdelt i flere dele, og følgende er detaljerede eksperimentelle procedurer. Forsøgsprincippet og den generelle eksperimentelle proces er vist i form af et rutediagram i figur 1.

  1. Plasmider konstruktion
    1. Underklo klon cDA'erne af vildtype S1PR1, S1PR3 og S1PR5 til vektoren pcDNA3.1+ med en HA-signalsekvens efterfulgt af et flagmærke ved N-endestationen (Materialetabel).
      BEMÆRK: Mutationer for alle receptorer blev genereret ved anvendelse af mutagenesesættet (Table of Materials).
  2. Fremstilling af plasmidet
    1. De rekombinante pcDNA3.1+-vektorer eller sensorplasmidet (materialetabel) tilsættes til 50 μL DH5α kompetent Escherichia coli (E. coli) opbevaret i et 1,5 ml rør ved -80 °C separat, og der inkuberes på is i 30 min. Varmechok cellerne ved 42 °C i 90 s, overfør dem straks til isen og nedkøl dem i 2 min.
      BEMÆRK: Sensorplasmidet, der leveres af Gi-inhibition cAMP-assaysættet (Table of Materials), udtrykker et modificeret luciferase-gen smeltet sammen med et cAMP-bindingsdomæne og øger luminescensaktiviteten, når cAMP er bundet.
    2. Røret rystes ved 37 °C i 1 time efter supplering med 300 μL lysogen bouillon (LB) medium. Plade 100 μL celler til LB-agarpladen og inkuberes ved 37 °C ved at holde sig i mørke i 48 timer. Den hvide koloni podes i 5 ml LB-medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin og dyrkes ved 37 °C i 16 timer.
    3. Isoler DNA ved hjælp af plasmid miniprep kit (Table of Materials) efter producentens anvisninger; plasmidet havde en koncentration på over 350 ng/μL med værdien A260/A280 mellem 1,7 og 1,9.
  3. Cellekultur
    1. Læg CHO-K1-cellerne i en 10 cm petriskål, dyrk dem i en 37 °C inkubator med 5% CO2, og høst dem, når monolaget er ved 80% -90% sammenløb.
    2. Aspirer CHO-K1-cellernes vækstmedium, tilsæt 4 ml 0,05% trypsin-EDTA forvarmet ved 37 ° C forsigtigt på petriskålen, og inkuberes i 15 s. Derefter tilsættes 4 ml vækstmedium bestående af F12-medium + 10% FBS.
    3. Løsr cellerne fra petriskålens overflade ved forsigtigt at svaje og banke på siden af petriskålen. Fyld et konisk rør med cellesuspension. Rør og pipetter langsomt for at fjerne celleklumper forsigtigt.
    4. Centrifuge celler ved 250 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, aspirere supernatant og genoplive med 3 ml PBS. Gentag dette trin.
    5. Bestem cellenummer med hemacytometeret, og centrifuger celler ved 250 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    6. Aspirere PBS-buffer og resuspend CHO-K1-celler med 3 ml vækstmedium bestående af F12-medium og 10% FBS.
    7. Der tilsættes 2 ml vækstmedium bestående af F12-medium og 10% FBS i hver brønd i seks-brøndpladen, og frø 150 μL cellesuspension i hver brønd for at holde cellerne ved densiteten på 1,5 x 105 celler / ml. Inkuber pladen med seks brønde i en 37 ° C vævskulturinkubator med 5% CO2 i ca. 24 timer.
  4. Forbigående transfektion
    1. 2 μg DNA (trin 3.2.3) fortyndes til 200 μL transfektionsreagensbuffer (materialetabel). Bland ved hvirvling i 10 s og kort spinding før brug.
      BEMÆRK: Her indeholder 2 μg DNA 0,5 μg receptorvektor (S1PR1, S1PR3 eller S1PR5) og 1,5 μg af sensorplasmidet.
    2. Der tilsættes 4 μL transfektionsreagens (materialetabel), hvirvel i 10 s, og spin kort før brug. Inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
    3. Langsomt falder 200 μL transfektionsblanding i hver brønd (indeholdende CHO-K1-celler) for at fordele jævnt. Ryst forsigtigt pladen med seks brønde for at sikre grundig blanding.
    4. Udskift transfektionsmediet efter 4-6 timer med cellevækstmediet bestående af F12-medium + 10% FBS, og returner seks-brøndpladen til inkubatoren.
    5. Høst celler 24-48 timer efter transfektion.
      1. Cho-K1-cellerne på brønden fordøjes med 500 μL 0,05% trypsin-EDTA (forvarmet ved 37 °C) i 15 s ogtilføj 1 ml vækstmedium bestående af F12-medium + 10% FBS. Løsrive cellerne fra brøndoverfladen ved at rokke og forsigtigt trykke på siden af brønden.
      2. Overfør cellesuspension til et konisk rør, og centrifuger ved 250 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Hæld supernatanten af og høst de transinficerede celler.
        BEMÆRK: Før fluorescenssignalbestemmelsen kontrolleres celleoverfladeekspressionsniveauer for receptorer ved ELISA som beskrevet tidligere26.
  5. Ækvilibrering med D-Luciferin-kaliumsalt (Materialetabel)
    1. Suspendere de høstede celler (24-48 timer efter transfektion) med 3 ml assaybuffer straks (dvs. Hanks balanced saltopløsning (HBSS) indeholdende 10 mM HEPES pH 7,4) med en yderligere 3% v / v fortynding af D-Luciferin-kaliumsaltet.
    2. Der tilsættes 90 μL cellesuspension pr. brønd af en 96-brønds plade ved hjælp af en flerkanalspipette, og bland forsigtigt.
    3. Inkuberes i 40 minutter ved stuetemperatur.
  6. Bestemmelse af fluorescenssignal
    1. Der fremstilles på forhånd 10 mM stamopløsninger af Siponimod opløst i DMSO, og der foretages en seriefortynding med HBSS-buffer indeholdende 25 μM forskolin før ligandstimulering.
      BEMÆRK: Bortset fra kontrolgruppen uden ligand har de resterende et koncentrationsgradientområde på 10-11-10-5 mol / L.
    2. Stimulere med 10 μL (pr. Brønd) agonistopløsning i forskellige koncentrationer i 30 min.
    3. Tæl luminescenssignalerne på en mikropladelæser ved hjælp af de tilknyttede softwareparametre (Table of Materials) som følger. Vælg Luminescens for detektionsmetode, Slutpunkt for læsetype og Luminescensfiber for optiktype. Indstil optikforstærkningen til 255.
      BEMÆRK: Hver måling blev gentaget i mindst tre uafhængige eksperimenter, hver i tre eksemplarer.
    4. Hent værdierne for fluorescenssignalet, importer dataene til et regnearksprogram, og behandl dataene ved hjælp af den ikke-lineære regression (curve fit) dosisresponsfunktion.

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration af eksperimentet. En detaljeret trinvis vejledning til eksperimentel opsætning og udførelse. Kort sagt blev receptoren og modificeret luciferase forbigående co-udtrykt i CHO-K1-celler ved at transfektere receptoren og sensorplasmidet ind i cellerne med transfektionsreagens. Cellerne blev suspenderet i HBSS-opløsning med D-Luciferin-kaliumsalt, luciferasesubstratet, og podet i en 96-brøndplade efter 24 timer. For at tillade gennemtrængning i cellerne skal D-luciferin forekvilibreres med cellerne. Det oxidative enzym luciferase omdanner luciferin til oxyluciferin og udsender lys. Den modificerede luciferase genererer derimod kun lys via en kemisk reaktion, når den er bundet til cAMP, og lysets intensitet har en positiv tilknytning til cAMP-niveauer i celler. Niveauerne af cAMP blev reguleret med GPCR aktiveret af agonist. Gi-koblede receptorer reducerede niveauerne af cAMP, hvilket nødvendiggjorde tilsætning af forskolin for at aktivere adenylylcyklasen i Gi-hæmning cAMP-eksperimentet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før frysning af prøven af S1PRs-Gi-komplekset skal den rensede prøve adskilles ved størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og analyseres med gelfiltreringskromatografi. Figur 2 viser S1PR3-Gi-komplekset som et eksempel. Topfraktionen af det homogene GPCR-G-proteinkompleks var sædvanligvis placeret ved ~ 10,5 ml af størrelsesekskluderingskromatografien (figur 2A). SDS-sideanalyse af S1PR3-Gi-komplekset (figur 2B) afslører fire bånd svarende til de teoretiske bånd af S1PR3, Gαi, Gβ og scFv16 og antyder således, at komplekset blev renset med succes. Receptorbåndet blev ofte fundet diffust på grund af forskellige grader af modifikation (glykosylering eller palmitylering), og båndet af Gγ blev ikke fundet.

Figure 2
Figur 2: Analyse af proteinrensningsresultater (A) Gelfiltreringskromatogram, der viser topfraktionen svarende til proteinet. (B) SDS-side gelelektroforese mønster. Dette tal er tilpasset fra reference27. Klik her for at se en større version af denne figur.

De komplekse fraktioner af S1PR3-Gi-komplekset blev opsamlet og koncentreret til elektronmikroskopi. Procedurerne for og de repræsentative resultater af netforglasning og prøvescreening blev tidligere drøftet34. Et flowchart (figur 3) præsenteres for at opnå en højopløsningsstruktur af S1PRs-G-proteinkomplekset ved hjælp af to forskellige behandlingsplatforme: RELION-3 og cryoSPARC v3.

Figure 3
Figur 3: Arbejdsgangen for databehandling i de pFTY720-bundne S1PR3-Gi-scFv16-komplekser. Cryo-EM databehandlingsflowdiagram for pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16-komplekset er vist. Repræsentativ cryo-EM mikrograf autoplukning, 2D-klassificeringsgennemsnit, 3D-rekonstruktioner og ikke-ensartet raffinement af pFTY720-S1PR3-Gi-scFv16-komplekset er vist i figuren. Dette tal er ændret fra reference27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Film blev først importeret til RELION-3, og efterfølgende blev bevægelseskorrektion og CTF-estimering udført for at generere gennemsnitlige mikrografer. Ved at plukke partikler og iterativ 2D-klassificering blev der opnået bedre partikler til videre behandling. Det er afgørende at vælge partikler med veldefinerede 2D-klasser, der tydeligt repræsenterer den sekundære strukturelle information i S1PR3-Gi-komplekset (figur 4A), da partikler af dårlig kvalitet kan hindre efterfølgende behandlingsfaser (figur 4B), hvilket resulterer i en rekonstruktion med lavere opløsning. Ved hjælp af 3D-klassificering blev partiklerne yderligere klassificeret for at udelukke støjpartikler, skelne mellem forskellige mulige konformationer og give flere 3D-rekonstruktioner. Til sidst blev et S1PR3-Gi komplekst EM-kort (figur 5A) produceret med god opløsning via Fourier Shell Correlation (FSC) (figur 5B) gennem ikke-ensartet raffinement.

Figure 4
Figur 4: Valg af 2D-klasser. (A, B) Resultater fra 2D-klassificering. (A) Vælg 2D-klassegennemsnit indeholdende veldefinerede klasser til videre behandling, og (B) frasorter delpartikler eller partikler med lav opløsning og støj. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Højopløsningsstruktur af de pFTY720-bundne S1PR3-Gi-scFv16-komplekser. (A) Højopløsningsstrukturen i det pFTY720-bundne S1PR3-kompleks viser veldefineret kryo-EM-tæthed, der repræsenterer S1PR3- og Gi-proteinstrukturelementer. (B) Guldstandard Fourier shell korrelation (FSC) kurve for pFTY720-bundet S1PR3-Gi kompleks. Dette tal er tilpasset fra reference27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Ved at løse strukturerne i S1PRs-G-proteinkomplekset med cryo-EM belyste vi mekanismen for aktivering, selektiv lægemiddelgenkendelse og G-proteinkobling ved hjælp af funktionelle assays i cellen. Gi-hæmning cAMP-analysen måler ændringerne i niveauet af cAMP-koncentration i celler (figur 1), og det blev ofte brugt til at validere aktiveringsstyrken af receptorer kombineret med Gs eller Gi.

Koncentrationsforholdet mellem receptor og sensorplasmid i forsøgssystemet er afgørende for eksperimentel levedygtighed. Så for at udføre funktionel analyse effektivt og præcist skal man vælge et plasmidkoncentrationsforhold med en maksimal E-max-værdi. I dette eksperiment blev tre koncentrationsforhold (1: 1, 1: 3 og 1: 9) af receptor til sensorplasmid undersøgt. Resultaterne viste, at en maksimal E-max-værdi blev opnået, når koncentrationsforholdet mellem receptor og sensorplasmid var 1: 3 (figur 6).

Figure 6
Figur 6: Effekten af forskellige koncentrationsforhold mellem S1PR3 og sensorplasmid på vinduesperioden blev undersøgt i CHO-K1-cellelinjen. Data præsenteres som middel ± SEM af tre uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Udover koncentrationsforholdet mellem receptoren og sensorplasmidet var de cellelinjer, der blev anvendt i dette eksperiment, også vigtige. Der var ingen væsentlig forskel mellem HEK293 og CHO-K1 cellelinjer for de fleste receptorer. CHO-K1-cellelinjer havde derimod en mere realistisk samlet kurve end HEK293-celler for S1PR3 (figur 7). Derfor blev CHO-K1-celler valgt til funktionel eksperimentverifikation af S1PR3.

Figure 7
Figur 7: Effekten af forskellige koncentrationsforhold mellem S1PR3 og sensorplasmid på vinduesperioden blev undersøgt i HEK293-cellelinjen. Data præsenteres som middel ± SEM af tre uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en primær rørledning til bestemmelse af strukturerne af S1PR'er ved kryo-EM og måling af aktiveringsstyrken af S1PR'er ved Gi-medieret cAMP-hæmningsassay. Nogle trin er afgørende for eksperimentets succes.

For at rense S1PRs-Gi-komplekset bør virusets kvalitet og sf9-cellernes sundhed lægges større vægt på. Ekspressionen af receptoren reduceres dramatisk i dårlige sf9-celler . Sf9-cellernes sundhed blev vurderet ved at måle deres diameter. Den sunde sf9-celle har en diameter på ca. 15 μm. Udbyttet af S1PRs-Gi-komplekset påvirkes af volumenforholdet mellem receptor-, Gi- og Gβγ-vira, som kan overvindes ved at samle S1PRs-G-proteinkomplekset in vitro42. Derudover er GPCR-G-proteinkomplekser ikke altid stabile, og derfor blev NanoBiT-strategien udviklet og er ofte blevet anvendt til at stabilisere komplekset43.

Kvaliteten af prøven er grundlaget for alt i cryo-EM-eksperimentet. Et aggregerings- eller dissociationsfænomen er ofte blevet observeret i prøvescreening. Nogle tilgange kan være nyttige i GPCR-G-protein kompleks stabilisering. C-endestationsresterne af S1PR'er kan forårsage prøveaggregering i S1PRs-Gi-kompleksprojektet26. Signalvejsassayet skal bruges til at vælge en acceptabel C-terminal ende for S1PR26,27. Koncentrationen af LMNG er den næstvigtigste faktor; overdrevne vaskemiddelkoncentrationer kan stabilisere GPCR-G-proteinkomplekset, men de kan også mindske dets opløsning, mens lave koncentrationer kan gøre det modsatte. Det afgørende aspekt ved stabilisering af komplekset er en optimal vaskemiddelkoncentration, der er så lav som muligt. Desuden kan koncentrationen af prøven lejlighedsvis påvirke mængden af indsamlede data. Når vi forglasser en prøve, laver vi ofte en gradient. I databehandling er valget af algoritmer i partikelvalg og 2D- eller 3D-klassificering vigtigt for at løse S1PRs-G-proteinkomplekserne, især til modellering af ligander og ECL'er; tætheden af ECL'er blev fundet kontinuerlig i S1PR1-strukturen løst i litteraturen beskrevet af Shian Liu et al.42 og fundet diskontinuerlig i S1PR5-strukturer26. Selvom der ikke er nogen universel løsning på dette problem for alle GPCR-komplekser, bør enhver strategi, der forbedrer EM-tæthedskortet, prøves. De afgørende trin for forglasning, dataindsamling og billedbehandling blev beskrevet tidligere34,44.

Et assay er påkrævet for at evaluere aktiverings- eller inhiberingsstyrken af S1PR-ligander, efter at strukturerne af S1PR'er er blevet bestemt af cryo-EM. Talrige tilgange kan bruges. Gi-hæmning cAMP-assay evaluerer receptoraktiveringsstyrke ved regelmæssigt at overvåge ændringer i cAMP-niveauer i celler forårsaget af agonister. a) Cellekultur, b) transfektion, c) molforholdet mellem plasmidreceptor (eller mutationer) og sensorplasmid, og d) valget af celletype er alle afgørende for et vellykket eksperiment. Cellernes sundhed kan påvirke transfektionseffektivitet og receptor- eller sensorekspression, hvilket kan have en betydelig indvirkning på eksperimentets signal-støj-forhold. Celler er generelt sunde efter 20 generationer, selvom det ikke altid er tilfældet. Det er vigtigt altid at holde øje med cellernes tilstand. Trypsinfordøjelsesperioden under cellepassage skal styres tæt, fordi cellens tilstand har en betydelig indvirkning over tid. Transfektionsreagenser påvirker receptorekspression i flere celletyper, og der skal vælges et passende cellemærke. Molforholdet mellem plasmidreceptor og sensorplasmid i Gi-hæmning cAMP-analysen skal optimeres. Vi vælger ofte en række molforhold mellem receptor og sensorplasmid og identificerer den højeste variation af fluorescensintensitet for at sikre datanøjagtighed for Gi-inhibering cAMP-assay med receptormutanter.

Nogle andre assays bruges til at overvåge cellulære cAMP-niveauer i en række prøvetyper, såsom ELISA-assay45 og NanoBiT46. cAMP ELISA-analysen bruges til at måle mængden af cAMP bundet med det specifikke antistof. Det cAMP-specifikke antistof er forankret på en mikrotiterplade, og peroxidase cAMP-sporstoffet konkurrerer med cAMP om binding med antistoffet. Mængden af peroxidase cAMP-sporstoffet bundet til pladen måles ved hjælp af fluorometriske tests, som er omvendt proportionale med mængden af cAMP. I 2007 udviklede Jiang et al. en metode til at overvåge niveauerne af cAMP in vivo kvantitativt og hurtigt ved hjælp af Bret-teknologi (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) (cAMP-sensor ved hjælp af YFP-Epac-RLuc)46. NanoBiT-baseret cAMP-assay anvender cAMP-sensoren LgBiT-Epac-SmBiT, som erstatter YFP og Rluc med henholdsvis LgBiT og SmBiT, og bruges til at måle dissociationen af G-protein heterotrimeren eller koblingen mellem receptoren og G-protein heterotrimeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dataene fra S1PRs-Gi-komplekset blev høstet på West China Cryo-EM Center i Sichuan University og Cryo-EM Center ved Southern University of Science and Technology (SUSTech) og behandlet på Duyu High-Performance Computing Center i Sichuan University. Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation of China (32100965 til L.C., 32100988 til W.Y., 31972916 til ZS) og fuldtids postdoc-forskningsfond ved Sichuan University (2021SCU12003 til L.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
  18. O'Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

Tags

Biokemi udgave 184
En rørledning til undersøgelse af strukturer og signalveje for sphingosin-1-phosphatreceptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia,… More

Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter