Este protocolo descreve em detalhes a preparação de complexos nucleossômicos usando dois métodos de preparação de amostras para congelamento de grades de TEM.
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Este protocolo descreve em detalhes a preparação de complexos nucleossômicos usando dois métodos de preparação de amostras para congelamento de grades de TEM.
O reparo do DNA no contexto da cromatina é pouco compreendido. Estudos bioquímicos usando partículas centrais do nucleossomo, a unidade repetitiva fundamental da cromatina, mostram que a maioria das enzimas de reparo de DNA remove danos ao DNA em taxas reduzidas em comparação com o DNA livre. Os detalhes moleculares sobre como as enzimas de reparo por excisão de base (BER) reconhecem e removem danos ao DNA em nucleossomos ainda não foram elucidados. No entanto, dados bioquímicos de BER de substratos nucleossômicos sugerem que o nucleossomo apresenta diferentes barreiras estruturais dependentes da localização da lesão de DNA e da enzima. Isso indica que os mecanismos empregados por essas enzimas para remover danos ao DNA livre no DNA livre podem ser diferentes daqueles empregados em nucleossomos. Dado que a maioria do DNA genômico é reunida em nucleossomos, informações estruturais desses complexos são necessárias. Até o momento, a comunidade científica carece de protocolos detalhados para a realização de estudos estruturais tecnicamente viáveis desses complexos. Aqui, nós fornecemos dois métodos para preparar um complexo de duas enzimas BER geneticamente fundidas (Polimerase β e AP Endonuclease1) ligadas a uma lacuna de nucleotídeo único perto da entrada-saída do nucleossomo para determinação estrutural por crio-microscopia eletrônica (crio-EM). Ambos os métodos de preparação de amostras são compatíveis para vitrificar grades de qualidade via congelamento por imersão. Este protocolo pode ser usado como ponto de partida para preparar outros complexos nucleossômicos com diferentes fatores BER, fatores de transcrição pioneiros e enzimas modificadoras da cromatina.
O DNA eucariótico é organizado e compactado por proteínas histonas, formando a cromatina. A partícula núcleo do nucleossomo (NCP) constitui a unidade repetitiva fundamental da cromatina que regula a acessibilidade às proteínas ligadoras de DNA para reparo, transcrição e replicaçãodo DNA 1. Embora a primeira estrutura cristalina de raios X do PFN tenha sido resolvida pela primeira vez há mais de duas décadas2 e muitas outras estruturas do PFN tenham sido publicadas desde3,4,5,6, os mecanismos de reparo do ....
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1. Montar partículas centrais do nucleossomo através da diálise de sal gardient
NOTA: A preparação de partículas centrais de nucleossomos utilizando proteínas de histonas recombinantes para estudos estruturais tem sido extensivamente descrita em detalhes por outros14,15,16. Seguir a purificação das histonas recombinantes de X. laevis e do conjunto de octâmeros de histonas descrito por outros14,15 e montar o substrato nucleossomal conforme descrito a seguir.
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PCN devidamente montadas (Figura 2) foram utilizadas para confecção de um complexo com uma proteína de fusão recombinante de MBP-Polβ-APE1 (Figura 3). Para determinar a razão entre NCP e MBP-Polβ-APE1 para formar um complexo estável, realizamos ensaios de deslocamento da mobilidade eletroforética (EMSA) (Figura 4), que mostraram uma banda deslocada isoladamente do NCP com excesso molar de 5 vezes de MBP-Polβ-APE1. Durante a otimizaç.......
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Um protocolo específico para purificação do fator de reparo do DNA será dependente da enzima de interesse. Entretanto, existem algumas recomendações gerais, incluindo o uso de métodos recombinantes para expressão e purificação de proteínas18; se a proteína de interesse for muito pequena (<50 kDa), a determinação da estrutura por crio-EM era quase impossível até mais recentemente através do uso de sistemas de fusão19, scaffolds de ligação de nanocorpos20
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Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecemos ao Dr. Mario Borgnia do núcleo de crio-EM do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental e ao Dr. Joshua Strauss da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill por sua orientação e treinamento na preparação da grade crio-EM. Agradecemos também à Dra. Juliana Mello Da Fonseca Rezende pela assistência técnica nas etapas iniciais deste projeto. Agradecemos a contribuição e o apoio fundamentais do falecido Dr. Samuel H. Wilson e seus membros do laboratório, especialmente o Dr. Rajendra Prasad e o Dr. Joonas Jamsen para a purificação do complexo APE1-Polβ geneticamente fundido. A pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do National I....
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldeído | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 filtro | |||
| Amicon Ultra 15 da célula de preparação (MW de corte de 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 (MW de corte de 30 kDa) | Pinça Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid | Ted Pella | 47000-600 | |
| Congelador de Imersão Automático | Leica | Leica EM GP | |
| Termociclador de toque C-1000 | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips e anéis | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Estação de recorte | SubAngostrom | SCT08 | |
| Membrana de diálise (MW cufoff 6-8 kDa) | 15370752 | Fisher Scientific | |
| Techni-Pro | 758TW0010 | ||
| dsDNA | DNA integrado tecnologias | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| Sistema de purificação FPLC | de 29018224 | puras | |
| AKTA Modelo 2110 | de limpeza de descarga de | Bio-rad | |
| Ted Pella | 91000S | ||
| SubAngostrom | PB-E | ||
| Pacote de acessórios de armazenamento de grade | SubAngostrom | GSAX | |
| Etano Líquido | N/A | N/A | |
| Nitrogênio Líquido | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 bomba peristáltica de duas cabeças | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricina, 1,0 mm, Mini Géis de Proteína | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Ponteiras de pipeta (VWR) Baixa retenção | VWR | 76322-528 | |
| Solução de gel de poliacrilamida (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polietilenoglicol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | ||
| Fator de reparo de DNA recombinante purificado | N / A | N / A | |
| R 1,2 / 1,3 300 mesh | Grids Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Octâmero histona recombinante | N / A | N / A | |
| Ferramentas de recorte de mola | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 coluna 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Microscópio Eletrônico de Transmissão | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Conjunto de Pinças para FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Papel de filtro (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xileno cianol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Colunas de Dessalinização, 7K MWCO, 75 µ L | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
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