Artigo de método

Aquisição e Perfusão-Descelularização de Flaps Vascularizados Suínos em Biorreator de Perfusão Customizado

DOI:

10.3791/64068

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1 de agosto de 2022

 ,  ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Institute of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, University of Toronto, 4Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

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O protocolo descreve a captação cirúrgica e subsequente descelularização de retalhos suínos vascularizados pela perfusão de detergente dodecil sulfato de sódio através da vasculatura do retalho em um biorreator de perfusão personalizado.

Resumo

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Defeitos de tecido mole de grande volume levam a déficits funcionais e podem afetar muito a qualidade de vida do paciente. Embora a reconstrução cirúrgica possa ser realizada usando transferência autóloga de retalho livre ou alotransplante composto vascularizado (VCA), tais métodos também apresentam desvantagens. Questões como morbidade no local do doador e disponibilidade tecidual limitam a transferência autóloga de retalho livre, enquanto a imunossupressão é uma limitação significativa da VCA. Tecidos modificados em cirurgia reconstrutiva utilizando métodos de descelularização/recelularização representam uma possível solução. Os tecidos descelularizados são gerados usando métodos que removem o material celular nativo, preservando a microarquitetura da matriz extracelular subjacente (ECM). Esses andaimes acelulares podem então ser subsequentemente recelularizados com células específicas do receptor.

Este protocolo detalha os métodos de aquisição e descelularização utilizados para alcançar andaimes acelulares em um modelo suíno. Além disso, também fornece uma descrição do projeto e configuração do biorreator de perfusão. Os retalhos incluem o omento suíno, o tensor da fáscia lata e o antebraço radial. A descelularização é realizada via perfusão ex vivo de detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) de baixa concentração, seguido de tratamento enzimático DNase e esterilização por ácido peracético em um biorreator de perfusão personalizado.

A descelularização tecidual bem-sucedida é caracterizada por uma aparência branco-opaca de retalhos macroscopicamente. Os retalhos acelulares mostram a ausência de núcleos na coloração histológica e uma redução significativa no conteúdo de DNA. Este protocolo pode ser usado de forma eficiente para gerar andaimes de tecidos moles descelularizados com MEC preservada e microarquitetura vascular. Tais andaimes podem ser utilizados em estudos subsequentes de recelularização e têm potencial para tradução clínica em cirurgia reconstrutiva.

Introdução

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A lesão traumática e a remoção do tumor podem levar a defeitos grandes e complexos dos tecidos moles. Esses defeitos podem prejudicar a qualidade de vida do paciente, causar perda de função e resultar em incapacidade permanente. Embora técnicas como a transferência autóloga do retalho tecidual tenham sido comumente praticadas, problemas com a disponibilidade do retalho e a morbidade do local doador são as principais limitações 1,2,3. O alotransplante composto vascularizado (VCA) é uma alternativa promissora que transfere tecidos compostos, por exemplo, músculo, pele, vasculatura, como uma única unidade para os receptores. No entanto, a VCA requer imunossupressão em longo prazo, o que leva à toxicidade medicamentosa, infecções oportunistas e neoplasias malignas 4,5,6.

Os andaimes acelulares de engenharia tecidual são uma solução potencial para essas limitações7. Os andaimes de tecido acelular podem ser obtidos usando métodos de descelularização, que removem o material celular dos tecidos nativos, preservando a microarquitetura da matriz extracelular subjacente (ECM). Em contraste com o uso de materiais sintéticos na engenharia de tecidos, o uso de andaimes biologicamente derivados oferece um substrato biomimético de ECM que permite a biocompatibilidade e o potencial de tradução clínica8. Após a descelularização, a subsequente recelularização de andaimes com células específicas do receptor pode gerar tecidos funcionais, vascularizados, com pouca ou nenhuma imunogenicidade 9,10,11. Ao desenvolver um protocolo eficaz para obter tecidos acelulares usando técnicas de descelularização por perfusão, uma ampla gama de tipos de tecidos pode ser projetada. Por sua vez, a construção desta técnica permite a aplicação em tecidos mais complexos. Até o momento, a descelularização perfusional de tecidos moles vascularizados tem sido investigada utilizando tecidos vascularizados simples, como retalho fasciocutâneo de espessura total em roedores 12, suínos13 e humanos14, bem como músculo esquelético reto abdominal suíno15. Além disso, tecidos vascularizados complexos também foram descelularizados por perfusão, como demonstrado nos modelos de orelha suína e humana 16,17 e nos modelos de enxerto de face inteira humana18.

Aqui, o protocolo descreve a descelularização de retalhos livres vascularizados utilizando andaimes de MEC derivados biologicamente. Apresentamos a descelularização de três retalhos clinicamente relevantes: 1) o omento, 2) o tensor fáscia lata e 3) o antebraço radial, todos representativos de retalhos de cavalos de trabalho utilizados rotineiramente em cirurgia reconstrutiva e não foram previamente examinados em estudos com animais no contexto da descelularização tecidual. Esses retalhos de bioengenharia oferecem uma plataforma versátil e prontamente disponível que tem o potencial para aplicações clínicas para uso no campo da reparação e reconstrução de grandes defeitos de tecidos moles.

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Protocolo

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Todos os procedimentos envolvendo sujeitos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Rede de Saúde da Universidade (IACUC) e são realizados de acordo com o protocolo e os procedimentos do Centro de Recursos Animais da Rede de Saúde da Universidade e as Diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Cinco porcos Yorkshire (35-50 kg; idade aproximada de 12 semanas de idade) foram utilizados para todos os experimentos.

1. Fabricação de biorreator de perfusão

  1. Ver figura 1 para todos os componentes utilizados no biorreator de perfusão. Para a fabricação da câmara de tecido, use recipientes de bloqueio de polipropileno comercialmente disponíveis com tampas estanques e herméticas contendo um revestimento de vedação de silicone. Certifique-se de que os recipientes sejam compatíveis com autoclave.
  2. Faça dois furos de 1/4 ao longo das laterais do recipiente e rosque um segmento curto de tubos de silicone revestidos de platina L/S-16. Uma tubulação carregará o perfusato de entrada e a outra é para a saída.
  3. Para a tubulação de entrada, prenda um conector Luer macho na porção interna que será usada para se conectar à cânula de tecido. Conecte um conector Luer fêmea na extremidade externa da tubulação de entrada que será usada para se conectar a uma torneira de três vias.
  4. Faça um único furo de 1/4 na tampa da câmara e rosque outro segmento curto de tubos de silicone revestidos de platina L/S-16. Esta tubulação servirá como a saída de ar.
  5. Faça a tubulação de entrada e saída medindo aproximadamente 50 cm de tubulação de silicone revestida de platina L/S-16. Conecte uma extremidade a uma tubulação amarela de bomba de três paradas e a outra extremidade a uma pipeta sorológica estéril de 2 mL para transportar o perfusato dos reservatórios de detergente para a câmara do biorreator.
  6. Autoclave todos os componentes (câmara e tubo) em embalagens estéreis embaladas individualmente.

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Figura 1: Fabricação do biorreator de perfusão. O biorreator de perfusão consiste em (A) uma câmara de tecido de polipropileno plástico (B) com orifícios laterais perfurados para acomodar tubos de perfusão com tampa estanque a ar e a água. (C) As torneiras são presas à tubulação para permitir a fixação da tubulação de perfusão que transporta agentes de descelularização do reservatório de detergente para resíduos de forma de passagem única. (D) de bomba compatíveis são usadas para conectar a tubulação de três paradas à bomba peristáltica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparação de soluções de descelularização

  1. Preparar solução salina normal heparinizada (15 UI/mL) diluindo 1,5 mL de 1000 UI/mL de solução de estoque de heparina em 100 mL de solução salina normal.
  2. Preparar solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,05% p/v, adicionando lentamente 9 g de pó SDS a 18 L de água desionizada destilada autoclavada. Use um garrafão de polipropileno (PP) de grande volume para acomodar a solução SDS. A solução está pronta para uso quando totalmente dissolvida. Armazenar à temperatura ambiente.
  3. Preparar a solução de trabalho DNase I. Em primeiro lugar, reconstituir a DNase I liofilizada para uma concentração de estoque de 10 mg/mL com CaCl 2 5 mM em dH2O. Armazenar a solução de DNase I de estoque reconstituída como alíquotas em um freezer de -20 °C até estar pronta para uso. No dia do uso, diluir DNase I estoque 1:100 com Mg++ (1,29 mM) e Ca++ (1,98 mM) em dH2O estéril até uma concentração final de 0,1 mg/mL.
    NOTA: A atividade DNase será degradada, a menos que armazenada congelada. Apenas a solução de DNase fresca de trabalho deve ser utilizada para a digestão enzimática do ADN à temperatura ambiente.
  4. Preparar 1x solução de PBS diluindo 10x PBS estoque 1:10 com água autoclavada estéril em um volume final de 5 L em um garrafão PP. Armazenar à temperatura ambiente.
  5. Prepare 1% de antibióticos/antimicóticos (A/A) em PBS. Diluir 100x antibióticos/antimicóticos 1:100 com solução estéril de 1x PBS até um volume final de 1 L. Conservar à temperatura ambiente.
  6. Preparar 0,1% (v/v) de ácido peracético (PAA)/4% (v/v) de etanol (EtOH) adicionando 3,13 mL de PAA + 40 mL de etanol a 100% + 956 mL de dH2O. Trazer o volume final para 1.000 mL e armazenar em temperatura ambiente.

3. Aquisição de retalhos suínos

NOTA: Este é um procedimento terminal. Um porco foi usado para obter todos os três retalhos. Eutanasiar humanamente o animal após a aquisição de todas as abas.

  1. Cuidados pré-operatórios
    1. Porcos rápidos pelo menos 12 h antes da cirurgia. Sedadar os animais com cetamina (20 mg/kg intramuscular, IM), atropina (0,04 mg/kg IM) e midazolam (0,3 mg/kg IM).
    2. Induzir anestesia por inalação de isoflurano a 5% através de uma máscara a uma taxa de fluxo de 22-44 mL/kg/min para inserção e intubação de linhas periféricas. Manter a anestesia com isoflurano a 0,5%-2% a 22-44 mL/kg/min. Garantir uma profundidade adequada da anestesia, verificando a estabilidade hemodinâmica e observando a ausência de reflexos de retirada palpebral/pedal ou tônus muscular da mandíbula para denotar um nível apropriado de anestésico administrado. Administrar infusão intravenosa de taxa contínua de remifentanil (10-20 μg/kg/h) durante a cirurgia para analgesia.
    3. Intubar o porco com um tubo endotraqueal apropriado (7-8 mm) e conectar o tubo a um ventilador ajustado a um volume corrente de 8 mL/kg, PEEP de 5 cm H 2 0,FiO2 de 0,5 e frequência respiratória de 14.
    4. Insira um cateter angiocath 22 G na veia da orelha. Uma vez obtido o acesso intravenoso (IV), infundir solução salina quente 0,9% normal a 5-10 mL/kg/h durante todo o procedimento para manter a pressão arterial média entre 60 mmHg e 90 mmHg.
    5. Monitore continuamente a frequência cardíaca, a oximetria de pulso e o CO2 final da maré. Avalie a pressão arterial e a temperatura corporal a cada 5 min.
    6. Aplique pomada ocular para evitar a secura ocular durante a anestesia. Prepare todo o campo cirúrgico com iodopovidona. Drape o campo cirúrgico com toalhas estéreis.
  2. Retalho ocmental
    1. Coloque o porco em decúbito dorsal e realize uma laparotomia xifo-umbilical.
    2. Ao entrar no abdômen, mobilize o estômago cefálico para visualizar o omento maior. Colocar cuidadosamente o omento no campo operatório e identificar os vasos gastroepiplóicos que correm ao longo da maior curvatura do estômago (Figura 2A).
    3. Comece no aspecto esquerdo da curvatura maior, onde a artéria gastroepiplóica esquerda se junta à artéria esplênica. Usando tesouras de tenotomia de Stevens retas, esqueletizar tanto a artéria e veia gastroepiplóica esquerda. Em seguida, divida ambos separadamente usando laços cirúrgicos ou clipes.
    4. Prossiga ao longo da curvatura maior do estômago da esquerda para a direita. Ligue e divida os ramos vasculares curtos que surgem do omento supondo a maior curvatura do estômago. Tome cuidado para não ferir o pedículo gastroepiplóico principal do omento durante esta etapa.
    5. Continue a mobilização do omento maior até que a junção dos vasos gastroepiplóicos direitos e da artéria gastroduodenal seja encontrada. Com clipes ou laços, ligue então divida a artéria gastroepiplóica direita e as veias separadamente para liberar o retalho omental.
    6. Uma vez liberado, o omento pode ser dividido ao longo do meio em duas metades, com cada metade acompanhada por uma respectiva artéria e veia gastroepiplóica. Isso permite a aquisição de dois retalhos livres omentais de uma operação animal. Individualmente canular os vasos gastro-epiplóicos com uma cânula de 20-22 G e, em seguida, fixar com laços de seda 3-0.
    7. Lavar soro fisiológico heparinizado (15 UI/mL) na cânula arterial gastroepiplóica até que se observe um fluxo venoso claro.
  3. Retalho tensor da fáscia lata
    NOTA: O protocolo baseia-se em uma descrição prévia do retalho de fáscia lata do tensor suíno por Haughey et al.19. A modificação é feita para isolar apenas a porção fascial do retalho tensor da fáscia lata.
    1. Coloque o porco na posição de decúbito lateral e raspe todo o membro posterior superior bilateralmente. Prepare e cubra usando os procedimentos estéreis usuais.
    2. Marque o limite anterior do retalho com uma linha que se estende da espinha ilíaca anterossuperior (EIAS) em direção à patela lateral. A localização do pedículo é de aproximadamente 6-8 cm do ASIS ao longo desta linha.
    3. Marque uma linha posterior paralela a aproximadamente 8 cm a 10 cm da incisão anterior ao longo do eixo do fêmur para incluir a largura do retalho. Marque a borda distal do retalho na patela lateral.
    4. Comece a dissecção na margem distal na patela com uma incisão afiada da pele usando um bisturi. Aprofunde a incisão da pele com cauterização através do tecido subcutâneo até que a fáscia que recobre o reto femoral seja encontrada.
    5. Continue as incisões cutâneas em direção ao ASIS ao longo dos limites anteriores e posteriores marcados descritos acima. Para isolar o retalho fascial sozinho, remova o componente da pele sobrejacente da camada fascial subjacente. Ligue ou cauterize quaisquer pequenos vasos perfuradores na pele.
    6. Retornar à borda distal do retalho e incidir a fáscia profunda para permitir a mobilização do músculo vasto lateral subjacente. Mobilize a fáscia em direção ao ASIS.
    7. Durante a mobilização, identificar o pedículo vascular que emerge entre os músculos vasto lateral e reto femoral (Figura 2B). Tome cuidado para evitar a tração excessiva para não ferir os vasos pediculares.
    8. Dissecar o aspecto proximal da SAIS enquanto protege o pedículo vascular. Dissecar até que o retalho esteja suficientemente mobilizado em torno de seu pedículo.
    9. Trace o pedículo em direção aos vasos femorais profundos. Esqueletizar tanto a artéria femoral circunflexa lateral quanto a veia que supre o retalho fascial. Ligate então divide ambos os vasos proximalmente onde eles se juntam aos vasos femorais profundos.
    10. Canular os vasos pediculares individualmente com angiocateteres 20 G a 24 G, fixados com laços de seda 3-0. Lavar solução salina heparinizada (15 UI/mL) na cânula arterial do retalho até que se observe um fluxo venoso claro.
  4. Retalho radial do antebraço
    NOTA: O protocolo abaixo baseia-se em uma descrição publicada do modelo de retalho radial do antebraço suíno por Khachatryan et al.20.
    1. Coloque o porco na mesa de operação na posição de decúbito lateral. Posicione o membro anterior dependente dentro do campo operatório.
    2. Marque um retalho cutâneo aproximado de 3 cm x 3 cm quadrado no antebraço radial. Desenhe uma linha entre o ponto médio da margem do retalho proximal e a fossa antecubital para denotar o curso aproximado do pedículo da artéria radial. Confirme o curso arterial com palpação.
      NOTA: No modelo suíno, os vasos radiais estão localizados relativamente mais profundamente do que nos seres humanos. Sua localização é entre o flexor radial do carpo e o braquiorradial.
    3. Incise a pele usando um bisturi no aspecto distal com uma profundidade até a fáscia antebraquial. Dissecar com tesoura de tenotomia até que a artéria radial distal e suas duas veias comitantes sejam encontradas. Ligate a artéria e veias com laços cirúrgicos individualmente e dividir.
    4. Continue as incisões cutâneas nas margens radial e ulnar do quadrado da pele marcado. Mobilize o retalho do osso radial subjacente com uma lâmina cirúrgica procedendo de uma direção radial para ulnar, ao mesmo tempo em que eleva o retalho cutâneo proximalmente em direção à fossa antecubital.
      NOTA: Manter um plano de dissecção subfascial para garantir que o pedículo da artéria radial permaneça associado à camada cutânea sobrejacente.
    5. Na margem proximal, retrair o espaço entre o braquiorradial e o flexor radial do carpo com um afastador auto-retentor para expor a artéria radial proximal e suas veias comitantes (Figura 2C).
    6. Usando tesoura de tenotomia, esqueletizar a artéria radial e as veias comitantes proximalmente na fossa antecubital, onde se unem à artéria braquial e às veias, respectivamente. Dissecar os vasos dos tecidos fibrogordurosos circundantes para alcançar um comprimento pedicular suficiente de aproximadamente 5-6 cm. Ligue e divida a artéria e as veias separadamente para liberar o retalho radial do antebraço.
    7. Canular os vasos pediculares com angiocateteres 20 G a 24 G, fixados com laços de seda 3-0. Lavar soro fisiológico heparinizado (15 UI/mL) na cânula arterial do retalho até que se observe um fluxo venoso claro.
    8. Após a obtenção do retalho, manter os retalhos em solução salina fria a 4 °C até estarem prontos para a descelularização. Sob anestesia com isoflurano profundo, eutanasiar os animais com injeção intravenosa de cloreto de potássio (100 mg/kg IV). Confirmar a morte pela ausência de sinais vitais.

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Figura 2: Captação de três retalhos vascularizados suínos . (A) Omento. As artérias gastroepiplóicas direita (i) e esquerda (ii) são canuladas no retalho omental (iii). (B) Tensor da fáscia lata. O pedículo do retalho (iv) é o ramo ascendente da artéria circunflexa femoral lateral (v). (C) Retalho radial do antebraço. A aquisição do retalho radial do antebraço (vi) baseia-se na artéria radial e na veia comitante (vii) como pedículo vascular (NOTA: Os drenos foram omitidos para fins de demonstração). Barras de escala: 3 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Configuração do sistema de descelularização

  1. Monte a câmara de tecido com abas em condições estéreis em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar.
  2. Anexe uma torneira de três vias às portas de entrada e saída do biorreator. Fixe um filtro de 0,2 μm à porta de ventilação de ar na tampa da câmara de tecido. Prepare a tubulação de entrada com solução salina heparinizada estéril para eliminar bolhas de ar.
  3. Coloque as abas na câmara. Usando hemostatos estéreis, conecte as abas à tubulação de entrada usando o conector Luer macho. Parafuse a respectiva cânula arterial de cada aba no Luer macho e garanta uma vedação apertada.
  4. Lavar soro fisiológico heparinizado através da torneira para verificar se a conexão Luer está sem vazamentos e se os retalhos podem ser perfundidos com evidências de saída venosa. Feche a tampa da câmara de tecido.
  5. Conecte a tubulação de entrada com uma tubulação de bomba amarela de três paradas à torneira de entrada da câmara de tecido. Além disso, conecte um transdutor de sensor de pressão em linha à torneira de três vias de entrada para permitir o monitoramento da pressão de perfusão.
  6. Ligue a bomba peristáltica de entrada. Na tela inicial, vá para a terceira guia usando a tecla de seta para definir o ID da tubulação para 1,85 mm. Em seguida, prossiga para a segunda guia para definir a taxa de perfusão. Taxa de entrada como o modo de entrega e ajustada para 2 mL/min. Verifique se a direção do fluxo está correta, conforme exibido na tela. Carregue a tubulação da bomba de três paradas na bomba peristáltica com um compatível.
  7. Repita o procedimento para a bomba peristáltica de saída semelhante à acima. Defina a configuração da bomba de saída para uma taxa de 4 mL/min. Conecte a tubulação de saída com uma tubulação de bomba amarela de três paradas à torneira de saída da câmara de tecido. Carregue a tubulação da bomba de três paradas na bomba peristáltica com um compatível. Inicie o fluxo para ambas as bombas pressionando o botão liga/desliga .
    NOTA: A maior taxa da bomba de saída é uma medida de segurança crucial para evitar o transbordamento da câmara de tecido, garantindo que a saída da câmara sempre exceda o fluxo de entrada durante o curso da descelularização. Toda a configuração de descelularização montada é representada na Figura 3.

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Figura 3: Sistema de descelularização de perfusão montado. (A) Esquema do sistema de descelularização de perfusão. A tubulação de entrada transporta perfusato do reservatório de detergente para a câmara de tecido de forma única com monitoramento do sensor de pressão. A tubulação de saída remove o perfusato ativamente da câmara de tecido para o recipiente de resíduos. Setas pretas denotam a direção do fluxo de perfusão. Uma bomba peristáltica é usada com a bomba esquerda para controlar o fluxo de entrada. O fluxo de saída é ativamente removido usando uma segunda bomba peristáltica através da respectiva tubulação. Figura criada com BioRender.com. (B) Fotografia do sistema de descelularização de perfusão montado na bancada com a bomba peristáltica de entrada (i) conectada às câmaras de tecido (ii) e, em seguida, a bomba peristáltica de saída (iii). A pressão de perfusato de entrada é monitorada com um sensor de pressão em linha (iv) antes de entrar na câmara de tecido. Aqui, três retalhos são descelularizados em paralelo. Tanto o detergente quanto os reservatórios de resíduos estão abaixo da bancada e não são fotografados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Descelularização de retalhos suínos

  1. Execute todas as etapas a seguir para descelularização por perfusão à temperatura ambiente. Para um resumo das taxas de perfusão e durações, ver Tabela 1. Iniciar a perfusão de solução salina heparinizada a 2 mL/min usando uma bomba peristáltica e perfundir os retalhos com solução salina heparinizada na câmara de tecido por 15 min para remover quaisquer coágulos sanguíneos retidos.
  2. Após a conclusão da perfusão salina heparinizada, aspirar solução salina residual na câmara tecidual. Encha a câmara tecidual com aproximadamente 500 mL de solução de descelularização SDS para submergir suficientemente o retalho.
  3. Transfira o tubo de entrada para a solução de descelularização SDS e perfunda o tecido a 2 mL/min. A duração da perfusão varia dependendo do retalho; perfundir SDS por 2 dias para o omento, 3 dias para a fáscia tensorial e 5 dias para o retalho fascio-cutâneo radial do antebraço.
  4. Após a conclusão da descelularização da SDS, aspirar o perfusato SDS existente contido dentro da câmara tecidual. Transfira a tubulação de entrada para 1x solução de PBS e perfunda os retalhos por 1 dia a 2 mL/min.
  5. Remova a solução PBS anterior e transfira a tubulação de entrada para a solução de trabalho DNase. Perfundir por 2 h a 2 mL/min. Remova a solução de DNase da câmara de tecido e coloque a tubulação de entrada em 1x solução de PBS. Submergir os tecidos com 1x solução de PBS na câmara e perfundir 1x solução de PBS por 1 dia a 2 mL/min.
  6. Esterilizar os retalhos com solução de PAA/EtOH. Transfira a tubulação de entrada para PAA/EtOH em solução de dH2O e submerja os tecidos na mesma solução. Perfundir PAA/EtOH a 2 mL/min por 3 h. Quando a esterilização PAA/EtOH estiver concluída, desconecte a tubulação das torneiras de três vias.
  7. Remova os retalhos usando técnica asséptica e coloque os instrumentos estéreis em PBS contendo 1% de antibióticos/antimicóticos (A/A). Mergulhe os retalhos com PBS + 1% A/A por 15 min em duas lavagens separadas para neutralizar totalmente o ácido residual. Manter os retalhos em PBS + 1% A/A a 4 °C até estarem prontos para a recelularização.
  8. Verifique a esterilidade dos andaimes realizando uma cultura de swab em placas de ágar e examine o crescimento microbiano. Inocular placas de ágar com zaragatoas retiradas de cada superfície do retalho. Cultivar as placas de ágar a 37 °C durante um período máximo de 2 semanas. A esterilidade é demonstrada pela ausência de crescimento de colônias microbianas.

Tabela 1: Resumo dos parâmetros do protocolo de perfusão-descelularização. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

6. Avaliação da descelularização

  1. Usando uma biópsia por punção, obtenha amostras de 3 mm a 10 mm de espessura dos retalhos.
  2. Para histologia, fixar biópsias em histológicas em formalina tamponada normal por 24 h à temperatura ambiente.
  3. Lave as de biópsia em água ou PBS por 15 minutos e coloque-as em etanol a 70% até que estejam prontas para o processamento tecidual. Processe as em um processador de tissue de acordo com protocolos padrão.
  4. Incorpore as biópsias em parafina, permitindo que a cera se solidifique por 10-15 minutos em uma placa fria. Seção de blocos de parafina em um micrótomo de 5 μm de espessura. Coloração das lâminas com hematoxilina e eosina (H&E) de acordo com os protocolos padrão. Imagem das lâminas de tecido com microscopia de luz.
  5. Para a quantificação do teor de ADN, obter o peso seco das biópsias teciduais após secagem dos tecidos durante a noite numa estufa a 60 °C. Digerir as amostras num tampão de extracção de papaína a 65 °C durante a noite. Centrifugar as amostras digeridas a 10.000 x g e transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco. Teste o conteúdo de DNA com um kit comercial de extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante.

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Resultados

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Este protocolo de descelularização de retalhos suínos vascularizados baseia-se na perfusão de um detergente de base iônica, SDS, através da vasculatura do retalho em um biorreator de perfusão personalizado. Antes da descelularização, três retalhos vascularizados em modelo suíno foram colhidos e canulados de acordo com seus principais vasos fornecedores. Os retalhos foram imediatamente lavados após a aquisição, a fim de manter uma vasculatura patente e perfusível para permitir uma descelularização bem-sucedida. Usando rec...

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Discussão

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O protocolo proposto utiliza a perfusão de SDS de baixa concentração para descelularizar uma gama de retalhos derivados de suínos. Com este procedimento, o omento acelular, o tensor da fáscia lata e os retalhos radiais do antebraço podem ser descelularizados com sucesso usando um protocolo que favorece a SDS de baixa concentração. Experimentos preliminares de otimização determinaram que a SDS em baixa concentração (0,05%) entre 2 dias a 5 dias é capaz de remover material celular para o omento, tensor da fáscia lata e ret...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 µ m pore Filtro AcrodiskVWRCA28143-310
Solução de Cloreto de Sódio a 0,9% (Solução Salina Normal)BaxterJF7123
20 L Polipropileno CarboyCole-ParmerRK-62507-20
3-0 Sofsilk Gravata Cirúrgica Não AbsorvívelCovidien  LS639
Torneira de 3 viasCole-ParmerUZ-30600-04
Adson ForcepsFine Science Tools11027-12
Solução Antibiótica-Antimicótica, 100XWisent450-115-EL
Sulfato de Atropina 15 mg/30mlViga 8 Produtos238481
BD Angiocath 20-GaugeVWRBD381134
BD Angiocath 22-GaugeVWRBD381123
BD Angiocath 24-GaugeVWRBD381112
Cloreto de CálcioSigma-AldrichC4901DNAse Co-factor
DNase I do pâncreas bovinoSigma-AldrichDN25
Ensaio de ADN (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)InvitrogenP7589
DPBS, 10XWisent311-415-CLnbsp; sem Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools13008-12
Heparina, 1000 I.U./mLLeo Pharma A/S453811
Cloridrato de Cetamina  5000 mg/50 mlBimeda-MTC Animal Health Inc.
Bomba Ismatec Tygon Tubulação de 3 ParadasCole-ParmerRK-96450-40Diâmetro Interno:  1.85 mm
Bomba Ismatec REGLO de 4 CanaisCole-Parmer78001-78
de Tubulação IsmatecCole-ParmerRK-78016-98
Isoflurano 99.9%, 250 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.
LB Agar LennoxBioshop CanadaLBL406.500Placas de ágar para teste de esterilidade
Sulfato de magnésioSigma-AldrichM7506Cofator DNAse
Masterflex L / S 16 TubulaçãoCole-ParmerRK-96410-16
Midazolam 50 mg / 10 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.
Lápis de Cauterização MonopolarValleylabE2100
Formalina Tamponada Normal, 10%Sigma-AldrichHT501128
N° 11 lâminas de bisturiSwann Morton303
Papaína de látex de mamãoSigma-AldrichP3125
Ácido PeracéticoSigma-Aldrich269336
Conector de Plástico Farpado para Tubo de 1/4" a 1/8" IDMcMaster-Carr5117K61
Tubo de Plástico Farpado 90° Conectores de cotoveloMcMaster-Carr5117K76
Plugues de tubo de giro rápido de plásticoMcMaster-Carr51525K143Soquetes
tubo de giro rápido de plásticoMcMaster-Carr51525K293Luer Punch fêmea
Integra Miltex3332
Cloreto de potássio 40 mEq / 20 mlHospira Healthcare Corporation37869
Povidona-Iodo, 10%Rougier833133
Pipeta Sorológica, 2mLFisher Science13-678-27D
Tampa de Encaixe Recipientes herméticosSnapLock142-3941-4
Dodecil Sulfato de Sódio em PóSigma-AldrichL4509
Clipes de Ligadura Cirúrgica de Metal, PequenoTeleflex001200
Tesoura de tenotomia Stevens, 115 mm, retaBC004RB. Braun
Edwards LifesciencesPX260
61231622319292242905 de Luer macho Ferramenta de biópsia Conjunto de monitoramento de pressão TruWave da

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