Captação e Descelularização de Membros Posteriores de Rato Usando Biorreator Ex Vivo à Base de Perfusão para Alotransplante Composto Vascularizado

A VCA é uma opção emergente para pacientes que necessitam de reconstrução cirúrgica complexa. Lesões traumáticas ou ressecções tumorais resultam em perda volumétrica de tecido que pode ser difícil de reconstruir. A VCA oferece o transplante de múltiplos tecidos, como pele, osso, músculo, nervos e vasos, como um enxerto composto de um doador para um receptor¹. Apesar de sua natureza promissora, a VCA é limitada devido a regimes imunossupressores de longo prazo. O uso ao longo da vida dessas drogas resulta em aumento do risco de infecções oportunistas, neoplasias malignas e toxicidade de órgãos-alvo ^1,2,3. Para ajudar a reduzir e/ou eliminar a necessidade de imunossupressão, os andaimes de engenharia de tecidos usando abordagens de descelularização para VCA mostram grande promessa.

A descelularização tecidual implica a retenção da estrutura da matriz extracelular enquanto remove o conteúdo celular e nuclear. Este andaime descelularizado pode ser repovoado com células específicas do paciente⁴. No entanto, preservar a rede de ECM de tecidos compostos é um desafio adicional. Isto é devido à presença de vários tipos de tecido com diferentes densidades de tecido, arquiteturas e locais anatômicos dentro de um andaime. O presente protocolo oferece uma técnica cirúrgica e um método de descelularização para um membro posterior de rato. Este é um modelo de prova de conceito para aplicar esta técnica de engenharia de tecidos a tecidos compósitos. Isso também pode levar a esforços subsequentes para regenerar tecidos compostos através da recelularização.

Ratos Lewis machos cadavéricos (300-430 g) obtidos do Toronto General Hospital Research Institute foram utilizados para todos os experimentos. Para todos os procedimentos cirúrgicos, instrumentos e suprimentos estéreis foram utilizados para manter a técnica asséptica (ver Tabela de Materiais). Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê de Cuidados com os Animais do Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Canadá). Um total de quatro membros posteriores foram descelularizados.

1. Preparação pré-cirúrgica

1. Preparar 50 mL de solução salina heparinizada a 5%. De um saco salino de 50 ml, retire 2,5 ml de solução salina utilizando uma seringa de 5 ml e elimine. Usando uma seringa de 5 mL, adicione 2,5 mL de heparina ao saco salino. Inverta o saco salino para misturar seu conteúdo.
2. Coloque um rato cadavérico em decúbito dorsal sob uma almofada azul. Raspe o membro posterior e a área da virilha circunferencialmente usando um barbeador elétrico e remova os pelos.
3. Traga o rato para a estação cirúrgica e aplique a solução de esfoliação de iodo Povidona usando uma gaze no membro posterior e na região da virilha. Posteriormente, aplique álcool isopropílico a 70% para limpar a solução de esfoliante usando gaze.
4. Descarte a almofada azul da etapa 1.2 e mude para luvas novas e estéreis.

2. Aquisição de membro posterior de rato

1. Faça uma incisão na pele usando uma lâmina cirúrgica #10 e um blade runner #3 ao longo do nível do ligamento inguinal, passando de uma direção lateral para uma medial (Figura 1A). Use pinça Adson para segurar a pele circundante para garantir uma incisão suave.
2. Quando a gordura subjacente estiver exposta, use dissecção contundente para dissecar cuidadosamente a gordura. Localize os vasos epigástricos superiores.
3. Use microtesouras para dissecar proximalmente e expor o nervo femoral subjacente, artéria e veia no nível do ligamento inguinal.
4. Sob microscópio de dissecção, identificar os vasos femorais e dissecar a artéria e a veia proximalmente usando pinça fina para obter comprimento suficiente dos pontos de bifurcação da rede arterial (Figura 1B).
5. Ligue a artéria e a veia femoral separadamente usando suturas 6-0.
6. Realizar dissecção circunferencial em torno do restante do membro posterior sem interromper os vasos femorais ligados.
7. Transecto do osso femoral de comprimento médio usando um cortador ósseo.
8. Para isolar totalmente o membro posterior, transectar os vasos femorais ligados abaixo das ligaduras usando microtesouras.
9. Cânular a artéria femoral usando um angiocateter 24 G sob o microscópio de dissecção. Use pinças finas para inserir a cânula com cuidado. Lavar com solução salina heparinizada até que se observe uma saída clara da veia femoral.
10. Fixe a cânula amarrando uma sutura ao redor do vaso canulado e outra sutura distalmente ao redor da própria cânula. Certifique-se de que a cânula seja colocada proximalmente para evitar o bloqueio dos pontos de bifurcação.
11. Submergir os membros posteriores adquiridos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) até a descelularização.

Figura 1: Aquisição do membro posterior do rato. (A) Marcação da incisão cutânea ao nível do ligamento inguinal de lateral a medial. (B) Vista da veia femoral e da artéria femoral, que foram dissecadas proximalmente em direção ao ligamento inguinal, indicadas pela linha pontilhada. Abreviaturas: L = lateral; M = medial; FV = veia femoral; AF = artéria femoral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparação de soluções

1. Num balão de vidro de 6 L, preparar um reservatório detergente de 5 L de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,25%, dissolvendo 12,5 g de pó SDS em 5 L de água destilada ultrapura. Cobrir a abertura do balão com parafilme para o selar.
2. Em um frasco de vidro de 1 L, prepare 1 L de solução de SDS a 0,25% separadamente, dissolvendo 2,5 g de SDS em 1 L de água destilada ultrapura. Adicione uma barra de agitação para misturar a solução num agitador magnético até que todo o SDS esteja dissolvido.
3. Prepare 1 L de solução de lavagem PBS a 1x com solução antibiótico-antimicótica (AA) a 1%. Num balão de 1 L, adicionar 990 ml de 1x solução de PBS e 10 ml de AA.
4. Separadamente, em um frasco de vidro de 500 mL, prepare 1x PBS + solução AA a 1% novamente usando 495 mL de solução 1x PBS e 5 mL de AA.
5. Preparar 200 mL de solução a 1% de ácido peracético (PAA)/etanol a 4% (EtOH). Prepare esta solução sob um exaustor.

4. Construção de biorreator e circuito de perfusão

NOTA: Consulte a Figura 2 para a configuração do biorreator e do circuito de perfusão ao longo das etapas listadas.

1. Em uma câmara de 500 mL (recipiente de plástico), faça três furos (1/4 pol) nos locais rotulados na Figura 2: A porta A é a linha de entrada, a porta B é a linha de reabastecimento e a porta C é a linha de saída. Remova e descarte o excesso de plástico. Pulverize e limpe a câmara com etanol a 70%.
2. Corte três tubos de silicone de 5 cm de comprimento e insira um a meio caminho em cada porta da câmara. Conecte um conector Luer macho na abertura da porta A voltada para o interior da câmara e um conector Luer fêmea na outra extremidade do tubo fora da câmara.
3. Conecte um conector Luer fêmea na Porta B e na Porta C nas extremidades dos tubos voltados para fora da câmara.
4. Em uma tampa hermética para o recipiente de plástico, faça um furo na superfície da tampa.
5. Corte um tubo de silicone de 3 cm e insira-o no orifício da tampa. Certifique-se de que aproximadamente 2 cm do tubo estejam localizados fora da tampa, como mostra a Figura 2.
6. Esterilize a câmara e a tampa com a tubulação.
7. Corte dois tubos de silicone de 30 cm usando uma tesoura. Conecte um conector de 1/16 a um conector de 1/8 de polegada em uma extremidade de cada tubo.
8. Separadamente, corte dois tubos de silicone de 12 cm usando uma tesoura. Conecte um conector de 1/16 a um conector de 1/8 de polegada em uma extremidade de ambos os tubos. Conecte um conector Luer macho na outra extremidade de um tubo e um conector Luer fêmea ao outro tubo.
9. Esterilize todo o material da tubulação a partir das etapas 4.7 e 4.8. Inclua duas tubulações de bomba de 3 paradas (1,85 mm) na esterilização.
10. Prepare três torneiras de 3 vias, um filtro de seringa, duas pipetas sorológicas de 1 mL e uma seringa de 10 mL para a configuração de descelularização. Remova o filtro das pipetas sorológicas de 1 mL.

Figura 2: Preparação do biorreator e construção do circuito de perfusão. Aparelhos indicados do circuito de perfusão, incluindo (A) bomba peristáltica e (B) correspondentes para as linhas de entrada e de saída. (C, D) Tubos de silicone de 12 cm e 30 cm também são mostrados com os respectivos conectores. (E) Tubulação para bomba peristáltica (1,85 mm). Câmara de biorreator com portas rotuladas para (F) entrada, (G) porta de reabastecimento e (H) saída. (I) Tampa do biorreator mostrada com porta de ventilação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Descelularização dos membros posteriores de ratos

1. Coloque a câmara esterilizada e parafuse em três torneiras de 3 vias de uso único nas linhas de entrada, saída e reabastecimento. Certifique-se de que a torneira da porta de reabastecimento esteja tampada em suas duas portas restantes para evitar vazamentos.
2. Fixar os tubos fabricados no passo 4.8 às torneiras nas linhas de entrada e saída.
3. Conecte a tubulação peristáltica aos tubos na etapa acima. Prenda o na tubulação peristáltica e coloque-o na bomba peristáltica. Não prenda as com tubos no lugar ainda.
4. Conecte um tubo da etapa 4.7 até o final da tubulação peristáltica da linha de saída a partir da etapa acima. Conecte uma pipeta sorológica de 1 mL na outra extremidade. Suspender a extremidade fixada com uma pipeta serológica no balão do reservatório de resíduos.
5. Repita a etapa 4.7 para a linha de entrada. Suspender a extremidade do tubo ligado à pipeta serológica no reservatório de detergente. Selar imediatamente a abertura do balão reservatório de detergente com parafilme. Consulte a Figura 3A,B para obter uma visão geral do circuito de descelularização.
6. Adicionar 0,25% de SDS do frasco de vidro de 1 L (passo 3.2) à câmara do biorreactor a meio nível.
7. Pegue o membro posterior adquirido usando a pinça de Adson e suspenda-o na câmara do biorreator com cuidado.
8. Use dois pares de pinças de Adson para guiar a porção canulada do membro posterior até a linha de entrada. Ao segurar a cânula com um par de pinças, use o outro par de pinças para torcer e fixar a linha de entrada à cânula. Certifique-se de que a cânula não esteja puxada ou torcida para evitar a decanulação.
9. Uma vez fixado, adicione mais 0,25% de SDS do frasco de vidro de 1 L para submergir totalmente o membro, conforme necessário. Certifique-se de que a porta de saída também esteja submersa no reservatório do biorreator para garantir que o fluxo de saída consistente seja mantido (Figura 3C).
10. Fixar um filtro de seringa de utilização única à porta de ventilação na tampa da câmara do biorreactor, referindo-se às etapas 4.4 e 4.5.
11. Prenda a tampa do biorreator e assegure-se de que a câmara esteja selada de todos os lados (Figura 3B).
12. Para remover o ar da tubulação e preparar o circuito de perfusão, use uma seringa nova de 10 mL de uso único para extrair detergente do reservatório de detergente usando a torneira de 3 vias na linha de entrada.
13. Uma vez desenhado, use o mesmo fluido para inserir na torneira de 3 vias na linha de saída. Certifique-se de que há detergente presente em toda a tubulação nas linhas de entrada e saída.
14. Pressione para baixo e prenda as com a tubulação na bomba peristáltica. Ligue a bomba peristáltica usando o botão liga/desliga.
    1. Na tela da bomba peristáltica, prossiga para a segunda guia usando a tecla de seta para definir a taxa de perfusão para o primeiro canal. Taxa de fluxo de entrada como o modo de entrega e definir a taxa de perfusão em 1 mL/min. Certifique-se de que a direção do fluxo está correta de acordo com a configuração do aparelho. Repita para o segundo canal.
    2. Calibre a bomba peristáltica para garantir que a quantidade de fluido entregue através da linha de entrada e/ou retirada da linha de saída esteja fluindo a uma taxa consistente entre as duas. Certifique-se de que o ID da tubulação esteja definido como 1,85 mm.
15. Inicie a descelularização via perfusão da máquina a 1 mL/min para as linhas de entrada e saída pressionando o botão liga/desliga no teclado. Monitore e garanta que o fluxo seja consistente e contínuo nas linhas de entrada e saída.
16. Continue a descelularização e monitore diariamente. Use o 1 L de 0,25% SDS (etapa 3.2) para reabastecer o reservatório do biorreator através da porta de reabastecimento, conforme necessário. Procure uma aparência branca e translúcida do tecido, que aparecerá no dia 5, indicando descelularização dos membros posteriores do rato.

Figura 3: Visão geral do circuito do biorreator de descelularização da perfusão do membro posterior do rato. (A) Representação esquemática do circuito de perfusão do biorreator. As setas azuis indicam a direção do fluxo de detergente e resíduos. (B) Visão geral do circuito de descelularização com biorreator contendo membro posterior de rato. O reservatório SDS (balão esquerdo) conduz à bomba peristáltica e à tubulação de entrada do biorreator. A saída é ligada ao reservatório de resíduos (balão direito) através da bomba peristáltica. (C) (I) Biorreator contendo membro posterior de rato com tubo de entrada conectado à artéria femoral canulada. (II) Porto de reabastecimento localizado no canto para perfusão de detergente. (III) Tubulação de saída suspensa em reservatório de suspensão. Abreviatura: SDS = dodecil sulfato de sódio. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Lavagem e esterilização pós-descelularização

1. Após a confirmação da descelularização, substitua o reservatório de detergente pelo reservatório de 1x PBS + 1% AA. Selar a abertura do balão com parafilme. Comece 1x PBS + 1% de perfusão AA a 1 mL/min e continue por 2 dias.
2. Substitua o reservatório 1x PBS + AA a 1% por 200 mL de PAA a 0,1%/reservatório de EtOH a 4% e inicie a perfusão a 1 mL/min por 2 h.
3. Desconecte o membro posterior da linha de entrada usando dois pares de pinças Adson estéreis, com um par de pinças para torcer a linha de entrada e o outro segurando a cânula. Certifique-se de que a cânula não seja puxada para evitar a decanulação.
4. Conservar o membro num frasco de vidro de 500 ml contendo 1x PBS + 1% AA a 4 °C até nova utilização.

O protocolo de aquisição foi bem sucedido em isolar e canular as artérias femorais comuns para as etapas subsequentes de perfusão. As imagens de dissecção representativas da Figura 1A,B mostram a localização da incisão e a exposição dos vasos femorais com distância suficiente dos pontos de bifurcação. A Figura 2 mostra o aparelho necessário para a preparação do biorreator e do circuito de perfusão. O desfecho da descelularização foi determinado pela observação de uma aparência branca, translúcida, do tecido. O sistema de perfusão por máquina ex vivo foi bem sucedido na descelularização perfusional do membro posterior de ratos. Foi mantido um circuito de passagem única, de sistema fechado (Figura 3). A morfologia macroscópica do membro posterior nativo evoluiu para uma aparência branca e pálida após 5 dias de perfusão de SDS a 0,25% (Figura 4).

A remoção do conteúdo celular foi observada quando corada com hematoxilina e eosina (H&E) nos vasos femorais, pele, nervo, osso e músculo onde não foram encontrados núcleos. As estruturas de cada estrutura tecidual foram analisadas em relação ao tecido nativo. Tanto a artéria femoral descelularizada quanto a veia apresentaram perda de conteúdo nuclear em todas as camadas e tecido conjuntivo circundante, dada a ausência de núcleos corados de azul, de outra forma presentes nos vasos nativos (Figura 5A,B e Figura 5D,E). A túnica íntima, a média e a adventícia da veia femoral e das artérias foram mantidas nos vasos descelularizados (Figura 5D,E). O nervo femoral apresentou preservação da estrutura tecidual, incluindo o endoneurio (Figura 5C e Figura 5F). O osso manteve sua estrutura tecidual geral pós-descelularização, com perda observável de núcleos corados de osteócitos do osso e das camadas circundantes do endósteo e periósteo (Figura 5G e Figura 5J). A pele apresentou perda de células da epiderme e derme. A derme apresentava fibras colágenas retidas, semelhantes ao tecido cutâneo nativo (Figura 5H e Figura 5K). Por fim, a visão transversal do músculo esquelético mostrou perda de núcleos de outra forma localizados nas periferias do endomísio. O conteúdo de miofibras permaneceu retido dentro dos respectivos fascículos pós-descelularização (Figura 5I e Figura 5L). A quantificação do DNA usando Picogreen também foi realizada, onde o conteúdo de DNA foi significativamente reduzido nos vasos femorais, nervo, pele, músculo e osso (Figura 6).

Figura 4: Morfologia macroscópica dos membros posteriores nativos e descelularizados de ratos . (A) Artéria femoral de membro posterior nativo canulada com angiocateter 24 G após a coleta. (B) Aspecto branco, translúcido, do membro posterior após 5 dias de descelularização com SDS a 0,25%. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Coloração histológica dos tecidos dos membros posteriores de ratos com hematoxilina e eosina. Veia femoral e artéria (B, E) nativa corada com H&E (painel superior) e descelularizada (painel inferior) (A, D), artéria femoral (B, E), nervo (C, F), osso (G, J), pele (H, K) e músculo (I, L). Perda de núcleos e conteúdo celular visível em todas as amostras descelularizadas. Barras de escala = 200 μm (vasos, nervo, osso) e 300 μm (pele, músculo). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Quantificação do DNA dos tecidos nativos e descelularizados dos membros posteriores de ratos. O conteúdo de DNA é reduzido em vasos nativos e descelularizados, nervos, músculos, pele e ossos, expressos em ng/mg de peso seco. Os tecidos foram secos e digeridos em papaína durante a noite a 65 °C. O DNA foi detectado fluorescentemente usando PicoGreen. Múltiplos testes t não pareados foram realizados. Os dados apresentados como DP médio ± **p < 0,01, ****p < 0,001, ****p < 0,0001. Abreviaturas: N = nativo; D = descelularizado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.