Summary
אנו מתארים את הטכניקה הכירורגית ואת תהליך הדה-סלוליזציה של חולדות מרוכבות. דה-סלוליזציה מתבצעת באמצעות נתרן דודציל סולפט בריכוז נמוך באמצעות מערכת פרפוזיה של מכונת ex vivo.
Abstract
חולים עם פציעות טראומטיות קשות ואובדן רקמות זקוקים לשחזור כירורגי מורכב. אלוטרנספלנטציה מרוכבת וסקולרית (VCA) היא דרך שחזור מתפתחת להעברת רקמות מרובות כתת-יחידה מרוכבת. למרות האופי המבטיח של VCA, הדרישות ארוכות הטווח של דיכוי חיסוני הן מגבלה משמעותית בשל הסיכון המוגבר לממאירויות, רעילות איברי קצה וזיהומים אופורטוניסטיים. הנדסת רקמות של פיגומים מרוכבים תאיים היא חלופה פוטנציאלית בהפחתת הצורך בדיכוי חיסוני. כאן מתוארת ההצטיידות של חולדה אחורית ודה-צלולריזציה שלה לאחר מכן באמצעות נתרן דודציל סולפט (SDS). אסטרטגיית הרכש המוצגת מבוססת על עורק הירך המשותף. נבנתה מערכת ביו-ריאקטור מבוססת זלוף מכונה ושימשה לדה-סלוליזציה של ה-ex vivo של ה-hindlimb. בוצעה דה-סלוליזציה מוצלחת של הזליפה, וכתוצאה מכך נוצר מראה לבן שקוף דמוי האחורי. נצפתה רשת כלי דם שלמה, ניתנת להעברה, לאורך כל החלק האחורי. ניתוחים היסטולוגיים הראו את הסרת התכולה הגרעינית ואת שימור ארכיטקטורת הרקמות בכל תאי הרקמות.
Introduction
VCA הוא אופציה מתפתחת עבור חולים הזקוקים לשחזור כירורגי מורכב. פציעות טראומטיות או כריתות גידול גורמות לאובדן רקמה נפחית שקשה לשחזר. VCA מציע השתלה של רקמות מרובות כגון העור, העצם, השרירים, העצבים וכלי הדם כשתל מורכב מתורם למקבל1. למרות אופיו המבטיח, VCA מוגבל בשל משטרים מדכאי חיסון ארוכי טווח. שימוש בתרופות כאלה לכל החיים גורם לסיכון מוגבר לזיהומים אופורטוניסטיים, ממאירויות ורעילות איברים סופית 1,2,3. כדי לעזור להפחית ו/או לבטל את הצורך בדיכוי חיסוני, פיגומים מהונדסים רקמות המשתמשים בגישות דה-סלוליזציה עבור VCA מראים הבטחה גדולה.
דה-סלוליזציה של רקמות כרוכה בשמירה על מבנה המטריצה החוץ-תאית תוך הסרת התכולה התאית והגרעינית. פיגום מתכלה זה יכול להיות מאוכלס מחדש עם תאים ספציפיים לחולה4. עם זאת, שימור רשת ECM של רקמות מרוכבות הוא אתגר נוסף. זאת בשל נוכחותם של סוגי רקמות מרובים עם צפיפויות רקמה שונות, ארכיטקטורות ומיקומים אנטומיים בתוך פיגום. הפרוטוקול הנוכחי מציע טכניקה כירורגית ושיטת דה-סלוליזציה עבור חולדה אחורית. זהו מודל הוכחת היתכנות ליישום טכניקה זו של הנדסת רקמות על רקמות מרוכבות. זה יכול גם להניע את המאמצים הבאים לחדש רקמות מרוכבות באמצעות recellularization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
חולדות לואיס זכרים קדבריים (300-430 גרם) שהתקבלו ממכון המחקר של בית החולים הכללי בטורונטו שימשו לכל הניסויים. עבור כל ההליכים הכירורגיים, מכשירים סטריליים ואספקה שימשו לשמירה על טכניקה אספטית (ראה טבלת החומרים). כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה לטיפול בבעלי חיים במכון המחקר של בית החולים הכללי בטורונטו, רשת הבריאות האוניברסיטאית (טורונטו, ON, קנדה). בסך הכל ארבעה אחוריים הוסרו.
1. הכנה טרום כירורגית
- הכן 50 מ"ל של 5% מלוחים heparinized. מתוך שקית מלח של 50 מ"ל, יש להוציא 2.5 מ"ל של תמיסת מלח באמצעות מזרק של 5 מ"ל ולהשליך אותה. באמצעות מזרק 5 מ"ל, להוסיף 2.5 מ"ל של הפרין לשקית המלוח. הפוך את שקית המלח כדי לערבב את תכולתה.
- הניחו חולדה קדבורית בתנוחת שכיבה מתחת לכרית כחולה. יש לגלח את החלק האחורי ואת אזור המפשעה בהיקף באמצעות מכונת גילוח חשמלית ולהסיר שיער.
- הביאו את החולדה לתחנת הניתוחים ומרחו תמיסת פילינג יוד של Povidone באמצעות גזה על אזור המפשעה האחורית. לאחר מכן, להחיל 70% אלכוהול איזופרופיל כדי לנגב את תמיסת קרצוף באמצעות גזה.
- יש להשליך את הפד הכחול משלב 1.2 ולהחליף לכפפות חדשות וסטריליות.
2. רכישת חולדה אחורית
- בצע חתך בעור באמצעות להב כירורגי #10 ורץ להב #3 לאורך רמת הרצועה המפשעתית, תוך מעבר מכיוון רוחבי לכיוון מדיאלי (איור 1A). השתמש במלקחיים של Adson כדי להחזיק את העור שמסביב כדי להבטיח חתך חלק.
- כאשר השומן שמתחת נחשף, יש להשתמש בדיסקציה קהה כדי לנתח בזהירות את השומן. אתר את כלי הדם האפיגסטריים העליונים.
- השתמש במיקרו-מספריים כדי לנתח באופן פרוקסימלי ולחשוף את עצב הירך, העורק והווריד הבסיסיים ברמת הרצועה המפשעתית.
- תחת מיקרוסקופ דיסקציה, זהה את כלי הירך ונתח את העורק והווריד באופן פרוקסימלי באמצעות מלקחיים עדינים כדי להשיג אורך מספיק מנקודות הביפורקציה של רשת העורקים (איור 1B).
- Ligate את עורק הירך ואת הווריד בנפרד באמצעות 6-0 תפרים.
- לבצע דיסקציה היקפית סביב שארית החלק האחורי מבלי להפריע לכלי הירך הקשורים.
- להעביר את עצם הירך באורך בינוני באמצעות חותך עצם.
- כדי לבודד באופן מלא את החלק האחורי, העבירו את כלי הירך המחוברים מתחת לליגטורות באמצעות מיקרו-מספריים.
- ניתן לנטרל את עורק הירך באמצעות אנגיוקטטר 24 גרם מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה. השתמשו במלקחיים עדינים כדי להכניס את הצינורית בזהירות. לשטוף עם מלוחים heparinized עד זרימה ברורה הוא ציין מן וריד הירך.
- אבטחו את הצינורית על ידי קשירת תפר אחד סביב כלי הצינורית ותפר נוסף באופן דיסטלי סביב הצינורית עצמה. ודא שהצינורית ממוקמת באופן פרוקסימלי כדי למנוע חסימה של נקודות הביפורקציה.
- טבלו את הגפיים האחוריות הנרכשות בתמיסת מלח עם אגירת פוספטים (PBS) עד לדה-סלולריזציה.
איור 1: רכישה של חולדה אחורית. (A) סימון חתך העור ברמת הרצועה המפשעתית מלרוחב לאמצעי. (B) מבט על וריד הירך ועורק הירך, אשר נותחו באופן פרוקסימלי לכיוון הרצועה המפשעתית, המסומנים על ידי הקו המקווקו. קיצורים: L = לרוחב; M = מדיאלי; FV = וריד הירך; FA = עורק הירך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
3. הכנת פתרונות
- בבקבוק זכוכית בנפח 6 ליטר, הכינו מאגר דטרגנטים בנפח 5 ליטר המכיל 0.25% נתרן דודציל סולפט (SDS) על ידי המסת 12.5 גרם אבקת SDS ב-5 ליטר מים מזוקקים במיוחד. מכסים את פתח הבקבוקון בפרפילם כדי לאטום אותו.
- בצנצנת זכוכית בנפח 1 ליטר, הכינו בנפרד 1 ליטר של תמיסת SDS של 0.25% על ידי המסת 2.5 גרם של SDS בליטר אחד של מים מזוקקים במיוחד. הוסיפו מוט ערבוב כדי לערבב את התמיסה על מערבל מגנטי עד שכל ה-SDS מומס.
- הכינו 1 ליטר של תמיסת PBS אחת עם תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית (AA) של 1%. בבקבוק 1 ליטר, הוסף 990 מ"ל של תמיסת PBS אחת ו-10 מ"ל של AA.
- בנפרד, בצנצנת זכוכית של 500 מ"ל, הכינו שוב תמיסת PBS + 1% AA אחת באמצעות 495 מ"ל של תמיסת PBS אחת ו-5 מ"ל של AA.
- הכינו 200 מ"ל של 1% חומצה פראצטית (PAA)/4% אתנול (EtOH) פתרון. הכן פתרון זה מתחת למכסה אדים.
4. ביוריאקטור ובניית מעגלי פרפוזיה
הערה: עיין באיור 2 עבור התצורה של הביוריאקטור ומעגל הזליפה לאורך השלבים המפורטים.
- בתא של 500 מ"ל (מיכל פלסטיק), קדחו שלושה חורים (1/4 אינץ') במקומות המסומנים באיור 2: יציאה A היא קו הכניסה, יציאה B היא קו החידוש, ויציאה C היא קו היציאה. הסר והשלך פלסטיק עודף. רססו ונגבו את התא ב-70% אתנול.
- חותכים שלושה צינורות סיליקון באורך 5 ס"מ ומכניסים אחד באמצע הדרך לכל יציאה של התא. חבר מחבר Luer זכר בפתח יציאה A הפונה לחלק הפנימי של התא ומחבר Luer נקבה בקצה השני של הצינור מחוץ לתא.
- חבר מחבר Luer נקבה ביציאה B וביציאה C בקצות הצינורות הפונים אל מחוץ לתא.
- במכסה אטום לאוויר למיכל הפלסטיק, קדחו חור אחד על פני המכסה.
- חותכים צינור סיליקון בקוטר 3 ס"מ ומכניסים אותו לחור המכסה. ודאו שכ-2 ס"מ מהצינור ממוקמים מחוץ למכסה, כפי שמוצג באיור 2.
- יש לעקר הן את התא והן את המכסה בעזרת הצינורות.
- חותכים שני צינורות סיליקון בקוטר 30 ס"מ בעזרת מספריים. חבר 1/16 אינץ' למחבר של 1/8 אינץ' בקצה אחד של כל צינור.
- בנפרד, חותכים שני צינורות סיליקון בקוטר 12 ס"מ באמצעות מספריים. חבר 1/16 אינץ' למחבר של 1/8 אינץ' בקצה אחד של שני הצינורות. חבר מחבר Luer זכר בקצה השני של צינור אחד ומחבר Luer נקבה לצינור השני.
- יש לחטא את כל חומר הצינורות משלב 4.7 ושלב 4.8. כלול שני צינורות משאבה 3-stop (1.85 מ"מ) בעיקור.
- הכינו שלושה מזרקים תלת-כיווניים, מסנן מזרק אחד, שני פיפטות סרולוגיות של 1 מ"ל ומזרק אחד של 10 מ"ל למערך הדה-סלוליזציה. הסר את המסנן מהפיפטות הסרולוגיות של 1 מ"ל.
איור 2: הכנת ביו-ריאקטור ובניית מעגלי פרפוזיה. המנגנון המוצג של מעגל הזליפה כולל (A) משאבה פריסטלטית ו-(B) קלטות מתאימות הן לקווי הכניסה והן לקווי היציאה. (ג, ד) צינורות סיליקון של 12 ס"מ ו -30 ס"מ מוצגים גם עם מחברים בהתאמה. (E) צינורות למשאבה פריסטלטית (1.85 מ"מ). תא ביוריאקטור עם יציאות מסומנות עבור (F) זרימה, (G) יציאה מתחדשת, ו-(H) יציאה. (I) מכסה ביוריאקטור מוצג עם יציאת אוורור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
5. דה-סלוליזציה של חולדות אחוריות
- הנח את התא המעוקר והבורג על שלושה פקקי חד-כיווניים תלת-כיווניים בכניסה, בשקע ובקווי החידוש. ודא שפתח העצירה של יציאת החידוש מוגבל לשתי היציאות הנותרות שלו כדי למנוע דליפה.
- חבר את הצינורות המיוצרים בשלב 4.8 לעצירות בקווי הכניסה והיציאה.
- חבר צינורות פריסטלטיים לצינורות בשלב למעלה. מהדקים את הקלטת על הצינורות הפריסטלטיים ומניחים אותה על המשאבה הפריסטלטית. אין לאבטח את הקסטות עם צינורות במקום עדיין.
- חבר צינור אחד משלב 4.7 לסוף הצינורות הפריסטלטיים של קו היציאה מהשלב שמעל. חבר פיפטה סרולוגית של 1 מ"ל בקצה השני. להשעות את הקצה מחובר עם פיפטה סרולוגית בבקבוק מאגר הפסולת.
- חזור על שלב 4.7 עבור קו הכניסה. להשעות את קצה הצינור המחובר לפיפטה הסרולוגית לתוך מאגר חומרי הניקוי. אטמו מיד את פתיחת בקבוק מאגר חומרי הניקוי עם פרפילם. ראו איור 3A,B לסקירה כללית של מעגל הדה-סלוליזציה.
- הוסיפו 0.25% SDS מצנצנת הזכוכית בנפח 1 ליטר (שלב 3.2) לתא הביוריאקטור בגובה מחצית הדרך.
- קח את החלק האחורי שנרכש באמצעות מלקחיים של אדסון והשעה אותו לתוך תא הביוריאקטור בזהירות.
- השתמש בשני זוגות של מלקחיים מסוג Adson כדי להנחות את החלק המשומר של החלק האחורי אל קו הכניסה. בעת החזקת הצינורית בזוג מלקחיים אחד, השתמש בזוג המלקחיים השני כדי לסובב ולהדק את קו הכניסה לצינורית. ודאו שהצינורית אינה נמשכת או מעוותת כדי למנוע פירוק.
- לאחר האבטחה, הוסיפו עוד 0.25% SDS מצנצנת הזכוכית בנפח 1 ליטר כדי להטביע את הגפה במלואה, לפי הצורך. ודא שיציאת היציאה שקועה גם היא במאגר הביוריאקטור כדי להבטיח שמירה על זרימה עקבית (איור 3C).
- חבר מסנן מזרק חד פעמי ליציאת האוורור במכסה של תא הביוריאקטור, בהתייחסו לשלב 4.4 ושלב 4.5.
- הדקו את המכסה של הביוריאקטור וודאו שהתא אטום מכל הצדדים (איור 3B).
- כדי להוציא אוויר מצינורות ולהכין את מעגל הזליפה, השתמש במזרק חדש וחד-פעמי של 10 מ"ל כדי לשאוב חומר ניקוי ממאגר חומרי הניקוי באמצעות הפקק התלת-כיווני בקו הכניסה.
- לאחר המשיכה, השתמש באותו נוזל כדי להחדיר לתוך stopcock 3-way בקו היציאה. ודאו שיש חומר ניקוי לאורך כל הצינורות הן בקווי הכניסה והן בקווי היציאה.
- לחץ למטה והדק את הקסטות עם הצינורות לתוך המשאבה הפריסטלטית. הפעל את המשאבה הפריסטלטית באמצעות לחצן ההפעלה.
- במסך המשאבה הפריסטלטית, המשך לכרטיסייה השנייה באמצעות מקש החץ כדי להגדיר את קצב הזלוף עבור הערוץ הראשון. קצב זרימת קלט כמצב המסירה והגדר את קצב הזלוף על 1 מ"ל/דקה. ודא שכיוון הזרימה נכון בהתאם למערך המכשירים. חזור על הפעולה עבור הערוץ השני.
- כייל את המשאבה הפריסטלטית כדי להבטיח שכמות הנוזלים המועברת דרך קו הכניסה ו/או הנלקחת מקו היציאה זורמת בקצב עקבי בין השניים. ודא שמזהה הצינורות מוגדר ל-1.85 מ"מ.
- התחל דה-סלוליזציה באמצעות זליגת מכונה במהירות של 1 מ"ל/דקה הן עבור קווי הכניסה והן עבור קווי היציאה על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בלוח המקשים. נטר וודא שהזרימה עקבית ומתמשכת הן בקווי הכניסה והן בקווי היציאה.
- יש להמשיך בדה-סלולריזציה ולנטר מדי יום. השתמש ב-1 ליטר של 0.25% SDS (שלב 3.2) כדי לחדש את מאגר הביוריאקטור דרך יציאת החידוש, לפי הצורך. חפשו מראה לבן ושקוף של הרקמה, אשר יופיע עד יום 5, המציין decellularization של החולדה האחורית.
איור 3: סקירה כללית של מעגל ביוריאקטור של פרפוזיה דה-סלולאריזציה של חולדה. (A) ייצוג סכמטי של מעגל פרפוזיה ביוריאקטור. חיצים כחולים מציינים את כיוון זרימת חומרי הניקוי והפסולת. (B) סקירה כללית של מעגל הדה-סלוליזציה עם ביוריאקטור המכיל חולדה אחורית. מאגר SDS (בקבוקון שמאלי) מוביל לתוך המשאבה הפריסטלטית ולתוך צינורות הכניסה של הביוריאקטור. הזרימה מחוברת למאגר הפסולת (בקבוקון ימני) דרך המשאבה הפריסטלטית. (C) (I) ביוריאקטור המכיל אחורי חולדה עם צינורות כניסה המחוברים לעורק הירך המשומר. (II) חידוש יציאה הממוקמת בפינה עבור חומר ניקוי perfused. (III) צינורות זרימה תלויים במאגר תלוי. קיצור: SDS = נתרן דודציל סולפט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
6. כביסה ועיקור לאחר דה-סלוליזציה
- לאחר אישור הדה-סלולריזציה, החלף את מאגר חומרי הניקוי במאגר 1x PBS + 1% AA. חותמים את פתיחת הבקבוקון עם פרפילם. יש להתחיל 1x PBS + 1% זליגת AA במהירות של 1 מ"ל/דקה ולהמשיך במשך יומיים.
- החלף את מאגר 1x PBS + 1% AA עם 200 מ"ל של 0.1% PAA / 4% מאגר EtOH והתחל זלוף ב 1 מ"ל / דקה במשך 2 שעות.
- נתקו את החלק האחורי מקו הכניסה באמצעות שני זוגות של מלקחי אדסון סטריליים, כאשר זוג מלקחיים אחד מסובב את קו הכניסה והשני מחזיק את הצינורית. ודא כי הצינורית אינה נמשכת כדי למנוע decannulation.
- יש לאחסן את הגפה בצנצנת זכוכית בגודל 500 מ"ל המכילה 1x PBS + 1% AA ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול הרכש הצליח לבודד ולשמר את עורקי הירך המשותפים לשלבי הזלוף הבאים. תמונות הנתיחה המייצגות באיור 1A,B מראות את מיקום החתך והחשיפה של כלי הירך עם מרחק מספיק מנקודות הביפורקציה. איור 2 מראה את המנגנון הדרוש להכנת הביו-ריאקטור ומעגל הזליפה. נקודת הקצה של דה-סלוליזציה נקבעה על ידי התבוננות במראה לבן, שקוף דמוי רקמה. מערכת הזלוף של מכונת ex vivo הצליחה בדה-סלוליזציה של הזלוף של החולדה האחורית. נשמר מעגל סגור במעבר אחד (איור 3). המורפולוגיה הגסה של החלק האחורי המקומי השתנתה למראה לבן וחיוור לאחר 5 ימים של 0.25% זליגת SDS (איור 4).
הסרת התוכן התאי נצפתה כאשר הוכתמו בהמטוקסילין ובאוזין (H&E) בכלי הירך, העור, העצב, העצם והשריר שבהם לא נמצאו גרעינים. המבנים של כל מבנה רקמה נותחו ביחס לרקמה המקומית. גם עורק הירך וגם הווריד הראו אובדן של תוכן גרעיני בכל השכבות ורקמת החיבור שמסביב, בהתחשב בהיעדר גרעינים מוכתמים בכחול, שנמצאים אחרת בכלי הדם המקומיים (איור 5A,B ואיור 5D,E). הטוניקה אינטימה, המדיה והאדוונטיטיה של וריד הירך והעורקים נשמרו בכלי הדם שעברו דה-תאי (איור 5D,E). עצב הירך הראה שימור של מבנה הרקמה, כולל האנדונוריום (איור 5C ואיור 5F). העצם שמרה על מבנה הרקמה הכולל שלה לאחר הדה-סלולריזציה, עם אובדן נצפה של גרעינים מוכתמים של אוסטאוציטים מהעצם ומשכבות האנדוסטאום והפריוסטאום הסובבות אותה (איור 5G ואיור 5J). העור הראה אובדן תאים מהאפידרמיס והדרמיס. הדרמיס הראה סיבי קולגן שמורים, בדומה לרקמת עור מקומית (איור 5H ואיור 5K). לבסוף, המבט הרוחבי של שרירי השלד הראה אובדן של גרעינים הממוקמים אחרת בשולי האנדומיסיום. תכולת המיופייבר נותרה שמורה בתוך הפאסיקלים המתאימים לאחר הדה-סלוליזציה (איור 5I ואיור 5L). בוצע גם כימות דנ"א באמצעות Picogreen, שבו תכולת הדנ"א הופחתה באופן משמעותי על פני כלי הירך, העצבים, העור, השרירים והעצמות (איור 6).
איור 4: מורפולוגיה גסה של אחוריים של חולדות מקומיות ודה-תאליות . (A) עורק הירך של ההינדלימב המקומי משומר עם אנגיוקטטר של 24 גרם לאחר הרכישה. (B) מראה לבן ושקוף של אחוריים לאחר 5 ימים של דה-סלוליזציה עם 0.25% SDS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: צביעה היסטולוגית של רקמות אחוריות של חולדות באמצעות המטוקסילין ואאוזין. מוכתם ב-H&E מקורי (פנל עליון) ודה-תאי (פאנל תחתון) (A, D) וריד הירך ו-(B, E) עורק, עצב (C, F), עצם (G, J), עור (H, K) ושריר (I, L). אובדן גרעינים ותכולת התאים הנראים בכל הדגימות שעברו דה-תאי. מוטות אבנית = 200 מיקרומטר (כלי דם, עצב, עצם) ו- 300 מיקרומטר (עור, שריר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: כימות דנ"א של רקמות אחוריות מקומיות ודה-תאיות של חולדות. תכולת הדנ"א מופחתת על פני כלי דם מקומיים ודה-תאיים, עצבים, שרירים, עור ועצמות, ומתבטאת במשקל יבש של ng/mg. רקמות יובשו ועוכלו בפפאין במשך הלילה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. הדנ"א זוהה באופן פלואורסצנטי באמצעות PicoGreen. בוצעו מספר בדיקות t לא מזווגות. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. קיצורים: N = יליד; D = decellularized. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עכברושים אחוריים שימושיים כמודלים ניסיוניים ב-VCA5. הנדסת רקמות של פיגומים תאיים מייצגת את הצעד הראשון בטיפול בחסרונות של משטרי דיכוי חיסוני ארוכי טווח הקשורים ל-VCA. השימוש בשתלים מרוכבים מהווה אתגר נוסף בהתחשב בנוכחותן של רקמות מרובות, שלכל אחת מהן תכונות תפקודיות, אימונוגניות ומבניות ייחודיות. הפרוטוקול הנוכחי מראה שיטה מוצלחת להשגת חולדות מרוכבות א-תאיות אחוריות. פיגומים אלה ניתנים לשחזור נוסף ומייצגים מודל הוכחת היתכנות עבור VCA.
כדי להבטיח רכש ודה-סלוליזציה מוצלחים, ישנם שלבים קריטיים שונים בשלבי הניתוח והדה-סלולריזציה. כדי להבטיח הפצה מערכתית של חומר הניקוי ותמיסת העיקור ברחבי כלי הדם המקומיים, השלבים הקריטיים כוללים קשירת כלי הדם האפיגסטריים, כמו גם השגת מרחק מספיק מנקודות הביפורקציה של הרשת העורקית לפני קשירת כלי הירך. הליך העיקור המתואר מסייע להפחית את העומס הביולוגי עבור ניסויי recellularization שבהם נדרשת סביבה סטרילית לחיבור תאים, הישרדות וגדילה6.
אנו מציגים גם מערכת ביו-ריאקטור של פרפוזיה שתוכננה ליישם דה-סלולריזציה. מרכיבים קריטיים כוללים את היכולת של זלוף רציף באמצעות משאבה פריסטלטית ומאפשרים זלוף חד פעמי של חומר הניקוי והסטרילנט דרך העורק המשומר. גם המשאבה הפריסטלטית הוגדרה לזרימה פועמת, בדומה לתנאים פיזיולוגיים. לבסוף, נכללה יציאת חידוש לחידוש מאגר ההשעיה בביוריאקטור מבלי לחשוף את החלק האחורי לסביבה החיצונית. לפיכך, מערכת ביו-ריאקטור זו היא בעלת יתרון, שכן היא יכולה לבצע דה-צלוליזציה ולעקר של חולדה אחורית ex vivo באופן סגור, במעבר אחד. רכיבי המעגל ניתנים לעיקור אוטומטי וניתן לעקר אותם לפני כל מחזור דה-סלולריזציה. בהתחשב בצפיפות ובנוכחות הגדולה יחסית של שריר בחלק האחורי, שתי שיטות הזלוף והטבילה של חומרי ניקוי שולבו בתכנון של מעגל ex vivo זה כדי לסייע בגישה ובפירוק השריר.
אף על פי שתא הביו-ריאקטור ומעגל הדה-סלוליזציה תוכננו והותאמו בקפידה לחלק האחורי של החולדה, יש לו תכנון הניתן לשחזור שניתן לשנותו בעת התאמת פרוטוקול זה לרקמות אחרות. שינויים נוספים עשויים לכלול שילוב מלכודת בועות במעגל הזליפה כדי להבטיח שקצב הזרימה לא יופרע עקב בועות אוויר 7,8. יתר על כן, לא שילבנו מערכת ניטור לחץ כדי לנטר את לחץ הזלוף לאורך כל משך הדה-סלוליזציה. זה אפשרי עבור לחצי זלוף להשתנות עקב פסולת תאית intraluminal. לאחרונה, Cohen et al. דיווחו על תנודות זמניות בלחץ הזליפה במהלך זליגת SDS בגישה ליצירת כימריזם וסקולרי באחורי החולדה, תוך שימוש בקצב זרימת מטרה דומה של 1-2 מ"ל/דקה. לחץ הזליפה התייצב בעקבות טיפול בקבקבים פוטנציאליים9. עבור שינויים עתידיים בתכנון מערכת הזליפה עבור הפרוטוקול הנוכחי, שילוב של צג לחץ יכול להיות אינפורמטיבי של כל חסימה תוך-לומינלית ולהצביע על הצורך בטיפול כדי לסייע במניעת נזק לכלי הדם.
במודל זה, הזרימה נצפתה במהלך ואחרי decellularization. כדי להבטיח את הכדאיות והפונקציונליות של הפיגומים, נדרשת פטנסיות וסקולרית לאספקת חמצן וחומרים מזינים לרקמות שונות בשתלמרוכב 10. עם הפוטנציאל של פרוטוקול דה-סלוליזציה זה להיות מורחב למחקרי recellularization נוספים, התצפית של זרימה החוצה היא קריטית, כך עץ כלי הדם decellularized יכול להיות מאוכלס מחדש ו refunctionalized במהלך recellularization. ניתן להשתמש בהדמיית כלי דם לאחר דה-סלוליזציה כדי לאשר את הפטנטיות של כלי הדם.
עד כה, מעט מחקרים נערכו על דה-סלוליזציה של החולדה האחורית, עם תוצאות מוגבלות על ההצלחה בכל אחד מתאי הרקמה 9,11. התוצאות המייצגות במחקר הנוכחי מראות את ההשפעה של דה-סלוליזציה על פני כל תאי הרקמה הנמצאים בחלק האחורי. השיטה הכירורגית גם שומרת על כמויות גדולות של שרירים ועור שניתן לבצע ביופסיה סדרתית ולהשתמש בהם לניתוחים נוספים. בנוסף, פרוטוקול זה מציע גישה פחות רעילה של דה-סלוליזציה על ידי שימוש בריכוז SDS נמוך יותר מזה המשמש בדרך כלל בפרוטוקולי דה-סלוליזציה עבור רקמות מורכבות ומבודדות12. מערכת הביוריאקטור ex vivo המוצעת יכולה להיות מותאמת גם לרקמות ומודלים אחרים.
לסיכום, הפרוטוקול המוצע מציע טכניקה כירורגית אמינה וניתנת לשחזור ושיטת דה-סלוליזציה עבור חולדות אחוריות באמצעות מערכת זלוף מכונת ex vivo. יישומים עתידיים כוללים אכלוס מחדש של פיגום זה בתאים ספציפיים לרקמות ובחינת דרכים לחידוש יכולת תפקודית ברקמות כגון עצם, שריר ועצב. מחקרים עתידיים עשויים גם לאפיין את המטריצה החוץ-תאית, את שימור כלי הדם המקומיים ואת התכונות הביוכימיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
איור 3A נוצר בשנת BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
References
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
