Detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus implantável em campo usando amplificação de recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a

Resumo

Neste trabalho, foi desenvolvido um método de detecção rápido, sensível e portátil de Candidatus Liberibacter asiaticus baseado na amplificação da recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a.

Resumo

A detecção precoce de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) por citricultores facilita a intervenção precoce e previne a propagação da doença. Um método simples para o diagnóstico rápido e portátil de Huanglongbing (HLB) é apresentado aqui que combina amplificação da recombinase polimerase e um repórter fluorescente utilizando a atividade nuclease do sistema palindrômico curto agrupado regularmente interespaçado/CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a). A sensibilidade desta técnica é muito maior do que a PCR. Além disso, este método mostrou resultados semelhantes à qPCR quando as amostras foliares foram utilizadas. Em comparação com os métodos convencionais de detecção de CLas, o método de detecção aqui apresentado pode ser concluído em 90 min e funciona em uma condição isotérmica que não requer o uso de máquinas de PCR. Além disso, os resultados podem ser visualizados através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente no campo.

Introdução

O Huanglongbing (HLB) é uma das doenças cítricas mais problemáticas do mundo¹. O HLB é causado pela bactéria colonizadora de floemas e fastidiosa Candidatus Liberibacter spp., incluindo Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus e Ca. L. americanus ². A espécie associada ao HLB mais prevalente na China e nos EUA é a CLas, que é transmitida por psilídeos cítricos asiáticos (Diaphorina citri) ou por enxerto³. Após serem infectadas por CLas, as árvores cítricas demonstram declínio de crescimento até a morte². Os sint....

Protocolo

1. Construção do CLas-DETECTR

NOTA: A construção do CLas-DETECTR é um processo de quatro etapas: preparação da solução, isolamento do DNA total dos citros, amplificação isotérmica do DNA e visualização dos resultados. O esquema do ensaio CLas-DETECTR é ilustrado na Figura 1A.

1. Preparação da solução
   1. Preparar tampão A: 20 mM de NaOH em 6% de PEG 200. Para 100 ml, adicione 113 mg de NaOH e 6 g de PEG 200 em 80 ml de H₂O num frasco. Incubar o frasco em banho-maria a 60 °C até que todo o PEG 200 esteja dissolvido. Em seguida, adicione H₂O a um volume de 100 mL.
   2. Prepar....

Resultados

Aqui, descrevemos uma plataforma portátil, CLas-DETECTR, que vasculha os sistemas RPA e CRISPR-Cas12a para diagnosticar o HLB em campo. O esquema do CLas-DETECTR é ilustrado na Figura 1A.

Quando amostras foliares das árvores de Newhall infectadas e não infectadas por HLB (Figura 1B), para as quais a presença de CLas foi confirmada por PCR (Figura 1C), foram submetidas ao teste CLas-DETECTR, observou-se sinal de fluorescência verde na amostra infectada por HLB, mas.......

Discussão

Este estudo apresenta um método rápido e portátil para detecção de CLas denominado CLas-DETECTR, que combina os sistemas RPA e CRISPR-Cas12a. O fluxo de trabalho é ilustrado na Figura 1. O CLas-DETECTR detecta CLas com especificidade e sensibilidade (Figura 2 e Figura 3). Além disso, usando amostras de folhas de Newhall, o CLas-DETECTR detecta CLas com a mesma sensibilidade que a qPCR (Figura 4<.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Extração de DNA Gel AxyPrep	Corning	09319KE1
China Kit de Extração de DNA Genômico Bacteriano	Solarbio	D1600	China
EnGen LbCas12a	TOLOBIO	32104-01	China
Ex Taq Versão 2.0 plus corante	TaKaRa	RR902A	China
Dispositivo de detecção fluorescente portátil	LUYOR	3415RG
China Furador de furos	Deli	114	China
Acetato de magnésio, MgOAc	TwistDx	TABAS03KIT	UK
NaOH	SCR	10019718
China NEB buffer 3.1	NEB	B7203
EUA	LABSELECT	PST-0208-FT-C	China
PEG 200	Sigma	P3015	USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras	TaKaRa	R045A	China
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	New England Biolabs	N0550S	EUA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	TaKaRa	RR820B	China
TwistAmp Basic	TwistDx	TABAS03KIT	Reino Unido