Protocolo de Resgate de Embriões para Hibridização Interespecífica em Abóbora

Cucurbita (2n = 40) é um género botânico pertencente à família Cucurbitaceae, que contém 27 espécies diferentes, das quais cinco são domesticadas¹. Entre estes, Cucurbita moschata, C. pepo e C. maxima são os mais importantes economicamente em todo o mundo. Nos EUA, C. moschata e C. pepo são as duas espécies mais importantes na produção agrícola. C. pepo consiste em quatro subespécies (ovifera, pepo, fraternal e gumala) que contêm grupos de cultivares de abóbora de verão e inverno de crookneck, straightneck, bolota, vieira, cocozelle, medula vegetal, abobrinha e abóbora^2,3,4,5. C. moschata consiste principalmente em tipos de mercado de abóbora de inverno, incluindo butternut, Dickinson e queijo do grupo¹. As duas espécies são morfologicamente e fenotipicamente diversas, com C. pepo considerado por seu rendimento, precocidade, hábito de crescimento do arbusto e diversas características da fruta, incluindo forma do fruto, tamanho do fruto, cor da polpa e padrão da casca. Por outro lado, C. moschata é valorizada por sua adaptação ao calor e à umidade, bem como à resistência a doenças e pragas ^6,7. A hibridação interespecífica entre C. moschata e C. pepo não é apenas uma importante estratégia para a introgressão de características desejáveis entre as duas espécies, mas também permite a ampliação da base genética em programas de melhoramento ^7,8.

Os primeiros cruzamentos entre C. moschata e C. pepo foram feitos para determinar sua compatibilidade e/ou barreiras taxonômicas 9,10,11, enquanto estudos posteriores se concentraram principalmente na transferência de características desejáveis ^12,13,14. A hibridação interespecífica entre as duas espécies tem como alvo a transferência de novas características, como um hábito de crescimento de arbustos ou semi-arbustos e melhora do rendimento de C. pepo, juntamente com a resistência a doenças, adaptabilidade ao estresse abiótico e aumento do vigor de C. moschata^14,15,16. Por exemplo, cruzamentos específicos entre C. pepo (P₅) e C. moschata (MO₃) resultaram em maior produtividade de frutos 13, enquanto os acessos de C. moschata (Nigerian Local e Menina) têm sido amplamente utilizados como fonte primária de resistência a potyvirus em cultivares de C. pepo ^{cultivadas 17,18}.

Estudos prévios mostraram que a hibridação entre C. moschata e C. pepo é possível, mas difícil ^8,15. Os cruzamentos interespecíficos podem resultar em nenhum conjunto de frutos (aborto), frutos partenocárpicos desprovidos de sementes viáveis (sementes vazias), frutos sem sementes onde os embriões imaturos não se desenvolvem (estenospermocarpia) ou frutos com poucos embriões imaturos que podem ser resgatados em plantas maduras por meio do resgate embrionário^15,16. Por exemplo, não foram obtidas sementes viáveis pelo cruzamento de C. pepo (rainha de mesa, maternal) com C. moschata (queijo grande, paterno), no entanto, o cruzamento recíproco resultou em 57 sementes viáveis de 134 polinizações⁹. A Hayase obteve sementes viáveis dos cruzamentos de C. moschata e C. pepo somente quando os cruzamentos foram feitos às 04:00 da manhã, utilizando pólen armazenado a 10 °C durante a noite¹⁹. Baggett cruzou oito variedades diferentes de C. moschata com C. pepo (delicata) e relatou que, de 103 polinizações totais, foram obtidos 83 frutos que pareciam normais, mas nenhum deles continha sementes viáveis⁸. Em um cruzamento entre C. pepo (S179) e C. moschata (NK), Zhang et al. obtiveram 15 frutos com 2.994 sementes, mas apenas 12 dessas sementes eram viáveis, enquanto as restantes apresentavam apenas desenvolvimento rudimentar. Esses estudos sugerem que, embora o cruzamento interespecífico entre C. moschata e C. pepo seja altamente benéfico, a obtenção de frutos com sementes viáveis a partir dos cruzamentos é exigente¹⁶.

O resgate embrionário tem sido sugerido como um método apropriado para superar problemas decorrentes de aborto precoce ou embriões pouco desenvolvidos e é uma das primeiras e mais bem-sucedidas técnicas de cultura in vitro para regeneração de embriões imaturos^16,20. O resgate embrionário envolve a cultura in vitro de embriões subdesenvolvidos/imaturos, seguida de transferência para um meio nutriente estéril para facilitar a recuperação de plântulas e, finalmente, de plantas maduras²¹. Embora o resgate de embriões seja comumente usado na criação de abóbora, falta uma descrição detalhada da metodologia apropriada que permita sua aplicação de rotina. O uso da técnica de resgate embrionário para superar barreiras de hibridização interespecíficas em espécies de Cucurbita foi relatado já em 1954²². No entanto, o sucesso do resgate de embriões nos primeiros estudos não foi relatado ou muito baixo. Metwally et al. relataram uma taxa de sucesso de 10% (regeneração em plantas maduras) entre 100 embriões híbridos interespecíficos resgatados de um cruzamento entre C. pepo e C. martinezii²³. Sisko et al. relataram uma taxa variável de sucesso de regeneração embrionária entre embriões obtidos a partir de diferentes combinações cruzadas: a taxa de regeneração de híbridos obtidos pelo cruzamento de C. maxima (Bos. Max) e C. pepo (Corrida do Ouro) foi de 15,5%, para C. pepo (abobrinha) e C. moschata (Hokaido) foi de 20%, enquanto para C. pepo (Corrida do Ouro) e C. moschata (Dolga) foi de 37,5%²⁴. Além do genótipo, as condições do meio e da cultura in vitro são fatores importantes para o sucesso da técnica^25,26. No presente estudo, várias combinações cruzadas entre C. moschata e C. pepo foram testadas, e uma metodologia simples para utilizar a técnica de resgate embrionário em abóbora foi desenvolvida. O desenvolvimento de uma técnica de resgate embrionário simples e facilmente reprodutível facilitará a hibridização interespecífica e o aprimoramento do germoplasma em programas de melhoramento de abóbora.

1. Plantio e polinização

NOTA: É importante identificar genótipos compatíveis cuja hibridização resultaria em frutificação e produção de embriões viáveis.

1. Condições de plantio e manutenção
   1. Obter sementes de genótipos de abóbora (cultivares/acessos) para hibridização (Tabela 1).
   2. Encher 50 planos de partida de células (25 cm de largura x 50 cm de comprimento) com meio de envasamento alterado com fertilizante NPK completo contendo 1,38 g/kg de N, 1,38 g/kg de P e 1,38 g/kg de K.
   3. Semeie as sementes a uma profundidade igual ao seu comprimento e cubra com meio de envasamento. Regue as planícies sem criar água parada. Depois, mantenha a mídia úmida regando-a à mão uma vez por dia.
   4. No segundo estágio de folha verdadeira, transplante as plântulas para vasos de 25 cm a 30 cm de diâmetro alterados com um fertilizante NPK completo a 3 colheres de sopa/pote. Adubar as plantas uma vez por semana com 500 mL/vaso de fertilizante líquido contendo NPK 20:20:20 adicionado a uma concentração de 1 g por galão de água.
   5. Manter as plantas na estufa a temperaturas entre 22-28 °C sob regime de luz natural. Para genótipos de vinha, fornecer uma treliça de suporte na estufa (Figura 1).
2. Realização de polinizações
   1. Normalmente, a floração em abóbora começa em 6 a 8 semanas a partir da semeadura, dependendo da cultivar (Figura 2A,B). Comece a fazer hibridação controlada (cruzamentos) assim que as plantas começarem a florescer. Em condições de estufa, a polinização pode ser feita durante todo o ano.
   2. Identificar flores masculinas e femininas das cultivares C. pepo e C. moschata que estarão prontas para polinização no dia seguinte. Para identificar essas flores, verifique se há flores cujas pétalas tenham uma tonalidade amarela, mas não estejam abertas. Cole suavemente as flores fechadas no topo usando fita adesiva para evitar a polinização acidental de insetos (Figura 2C,D).
   3. Na manhã do dia seguinte, as flores estão prontas para polinizar. Realizar a polinização antes das 10:00 da manhã para melhorar a taxa de sucesso da hibridização²⁷.
   4. Abra as flores femininas e masculinas removendo suavemente a parte superior colada das pétalas. Remova as pétalas da flor masculina e transfira o pólen esfregando suavemente a antera no estigma da flor feminina (Figura 3A).
   5. Após a polinização, feche imediatamente a flor feminina polinizada com fita adesiva. Use uma etiqueta para registrar a data da polinização e indicar os pais paternos e maternos utilizados na cruz (Figura 3B).
   6. Um cruzamento bem-sucedido é indicado por um ovário expandido que forma rapidamente um pequeno fruto dentro de 1 semana (Figura 4A). A planta está então pronta para a colheita 45-55 dias após a polinização²⁸ (Figura 4B).

2. Técnica de resgate embrionário

1. Preparação para a mídia
   1. Preparar estoques de antibióticos: Para cefotaxima (sal de sódio), dissolver o antibiótico em 4 mL de água deionizada ou destilada, filtrar através de um filtro de seringa estéril de 0,22 μm e fazer alíquotas de 0,5 mL. Conservar a -20 °C. A solução-mãe resultante terá uma concentração de 250 mg/ml.
   2. Para ampicilina (sal de sódio), dissolver o pó em 10 ml de água, filtrar através de um filtro de seringa estéril de 0,22 μm e alíquota em caldo de 1 ml com uma concentração final de 100 mg/ml. Conservar a -20 °C.
   3. Fazer Murashige e Skoog (MS) meio dissolvendo 2,45 g de meio (concentração de 4,91 g/L) em 500 mL de água destilada em uma garrafa de 1 L. Adicionar 1,5 g de goma gelana e autoclave a 121 °C durante 20 minutos. A goma gelana dissolve-se completamente durante a autoclavagem.
   4. Após a autoclavagem, arrefecer o meio colocando a garrafa em banho-maria a 50 °C. Retire os estoques de antibióticos do freezer e descongele-os no gabinete de fluxo laminar.
   5. Transfira o frasco médio para o exaustor de fluxo laminar. Adicionar 0,6 ml de solução-mãe de cefotaxima (250 mg/ml) e 0,25 ml de caldo de ampicilina (100 mg/ml) ao frasco médio e misturar bem. Despeje cerca de 7 mL do meio em uma placa de Petri estéril (60 mm x 15 mm).
   6. Deixe o meio solidificar nas placas de Petri por aproximadamente 15-20 min. Feche as placas de Petri com um embrulho de vedação e coloque-as em uma caixa de armazenamento. Armazenar à temperatura ambiente.
2. Resgate de embriões
   1. Antes de começar, limpe e esterilize o armário de fluxo de ar laminar com álcool etílico a 70%.
   2. Colha o fruto da abóbora quebrando/cortando-o da videira principal e desinfete a superfície do fruto lavando com detergente líquido (por exemplo, cloroxilenol a 0,3%) na pia do laboratório até que toda a sujeira solta seja removida (Figura 5A).
   3. Enxaguar com água da torneira ampla. Seque a fruta com toalhas de papel limpas. Mova a fruta para o gabinete de fluxo de ar laminar (Figura 5B).
   4. Esterilizar superficialmente o fruto pulverizando etanol a 70% sobre o fruto no armário estéril de fluxo de ar laminar. Bissecte o fruto com uma faca estéril (Figura 5C) e extraia as sementes.
   5. Utilizar pinça estéril para abrir assepticamente o revestimento da semente e expor os embriões imaturos (Figura 6). Colocar cuidadosamente os embriões imaturos em uma placa de Petri contendo meio MS suplementado com cefotaxima e ampicilina (Figura 7A). Feche a placa de Petri e lacre com filme de embrulho.
      NOTA: Dependendo do tamanho do embrião, é possível encaixar cinco ou seis embriões em uma placa de Petri.
   6. Colocar as placas de Petri seladas com embriões numa câmara de crescimento sob fotoperíodo de 16 h a 25 °C e 70% de humidade relativa. Se ocorrer contaminação, subcultura imediatamente os embriões não contaminados em uma nova placa com o mesmo meio.
   7. Os cotilédones começarão a se expandir após 4 dias e ficarão verdes em 10 dias (Figura 7B). Neste ponto, se necessário, realize a subcultura em novas placas contendo o mesmo meio para permitir a expansão do tecido. As raízes começarão a aparecer aos 14 dias (Figura 7C) e, aos 21 dias, as plântulas terão raízes e cotilédones estendidos (Figura 7D).
      NOTA: O meio de cultura utilizado no protocolo é apropriado para diferenciação em parte aérea e raízes sem reguladores de crescimento suplementares.
   8. Nesta fase, retire as plântulas das placas de Petri e lave suavemente o meio das raízes com água da torneira (Figura 8). Coloque as plântulas em um recipiente plástico (14 cm x 9 cm x 4 cm) e cubra as raízes com toalhas de papel molhadas (Figura 9A). Cubra o recipiente e reumedeça as toalhas de papel conforme necessário.
   9. Mantenha os recipientes à temperatura ambiente (25-28 °C) e com um fotoperíodo de 16 h. Esta etapa irá aclimatar as plântulas. Após a aclimatação por 7-10 dias no recipiente, as mudas terão aproximadamente 3-4 de comprimento. Durante este período, reumedeça as toalhas de papel conforme necessário.
   10. Transferir as plântulas para 50 planos de partida de células (25 cm de largura x 50 cm de comprimento) emendados com adubo conforme descrito anteriormente e movê-los para a estufa (Figura 9B). Não regue demais as mudas para evitar o apodrecimento; adicionar aproximadamente 10-20 mL por célula, conforme necessário.
   11. Na segunda a terceira etapa de folha verdadeira, transplante as plântulas para vasos de 30 cm de diâmetro preenchidos com meio de envasamento alterado com adubo conforme descrito anteriormente (Figura 10A). Fornecer suporte de treliça para plantas vinicultura e realizar hibridização controlada quando as plantas iniciarem a floração, conforme descrito anteriormente (Figura 10B).
   12. Manter as plantas na estufa a temperaturas entre 22-28 °C sob regime de luz natural. Avaliar as plantas quanto às características dos frutos e sementes.

Frutificação e viabilidade das sementes
Um teste inicial foi realizado para determinar o conjunto de frutos e a viabilidade das sementes em uma variedade de combinações cruzadas. Foram escolhidos 15 genótipos de abóbora, quatro de C. pepo e 11 de C. moschata (Tabela 1). Das 24 combinações cruzadas interespecíficas tentadas, obteve-se um conjunto de frutos para 22 (Tabela 2), representando um sucesso global de >92% no fruto. Nenhum fruto maduro foi obtido pelo cruzamento de O e M e E e J, enquanto o maior número de frutos (n = 6) foi obtido pelo cruzamento de F e J (Tabela 2). O número de flores polinizadas para diferentes combinações cruzadas variou de um a 11, e a taxa de sucesso da polinização variou de 0% a 100%. O número de flores polinizadas em diferentes combinações cruzadas variou dependendo do número de conjuntos de flores e da sincronização da floração entre flores masculinas e femininas. Embora os frutos tenham sido obtidos de todos os cruzamentos, exceto dois, a avaliação dos frutos após o corte revelou que a maioria dos frutos havia abortado embriões sem sementes viáveis. Os frutos da maioria dos cruzamentos pareciam normais, mas eram desprovidos de sementes ou consistiam de sementes com embriões rudimentares. Um total de 44 frutos foram produzidos a partir de todas as combinações cruzadas, e apenas um fruto, desenvolvido pelo cruzamento C e J, tinha embriões pouco desenvolvidos que poderiam ser recuperados através da técnica de resgate embrionário.

Resgate de embriões e avanço adicional
O híbrido interespecífico F1 desenvolvido pelo cruzamento C e J tinha 44 sementes no total, mas apenas 10 delas tinham embriões que poderiam ser resgatados para o avanço da geração. As sementes restantes não tinham embriões. Todos os 10 embriões foram cultivados no meio de resgate embrionário e verificados diariamente quanto ao seu crescimento e desenvolvimento. O tamanho dos 10 embriões imaturos variou de 3,51 mm a 8,26 mm. A taxa de sucesso do resgate embrionário foi de 80%. Os híbridos interespecíficos F 1 (linhas de ponte) desenvolvidos pelo cruzamento de C. moschata e C. pepo (C e J) continham os genomas de ambas as espécies em uma proporção de 1:1 (50% cada). Essas plantas foram usadas como linhas de ponte para a introgressão de características economicamente importantes entre as duas espécies. Por exemplo, cruzar essas linhas de ponte com C. moschata resultaria em híbridos com 75% de C. moschata e 25% de fundo genético de C. pepo, respectivamente. Os frutos obtidos a partir dessas linhagens de ponte tinham uma mistura de sementes inviáveis e sementes com embriões imaturos que posteriormente necessitaram de cultura de tecidos para regeneração. Por exemplo, um dos frutos tinha um total de 54 sementes, entre as quais 14 sementes tinham embriões imaturos que foram resgatados usando o protocolo descrito aqui.

Figura 1: Treliça de suporte para plantas de abóbora de crescimento vertical na estufa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ilustração de flores abertas e coladas. Abrir (A) macho e (B) flor de abóbora fêmea na estufa. (C) Uma flor macho colada de Cucurbita moschata paternal parental. (D) Uma flor fêmea colada de Cucurbita pepo mãe mãe. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Ilustração da polinização . (A) Transfira o pólen da flor masculina esfregando suavemente a antera no estigma da flor feminina. (B) Após a polinização, cole a flor feminina e use uma etiqueta para registrar a data da polinização e os pais paternos e maternos usados na cruz. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Conjunto de frutos . (A) Após a polinização, o ovário se expandirá rapidamente, formando um pequeno fruto dentro de 1 semana. (B) O fruto está pronto para a colheita 45 dias após a polinização. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Preparação dos frutos. (A) Lave os frutos com detergente. Colha e desinfete a superfície da fruta lavando-a com detergente líquido na pia do laboratório. (B) Enxaguar e secar o fruto. Seque a fruta com toalhas de papel limpas, após enxaguar com ampla água da torneira, e mova-a para o armário de fluxo de ar laminar. (C) Bissecte o fruto aberto com uma faca estéril. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Extrair embrião das sementes. Use pinças estéreis para abrir assepticamente o revestimento da semente e expor o embrião imaturo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Regeneração embrionária no meio MS . (A) Coloque cuidadosamente embriões imaturos em uma placa de Petri contendo meio MS. (B) Os cotilédones se expandirão e se tornarão verdes dentro de 10 dias. (C) As raízes começarão a aparecer aos 14 dias. (D) Aos 21 dias, as plântulas terão raízes estendidas e cotilédones que estão prontos para serem transferidos para um recipiente de plástico para aclimatação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Lave as raízes. Retire as plântulas das placas de Petri e lave suavemente o meio das raízes com água da torneira. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Aclimate as plântulas . (A) Coloque as plântulas em um recipiente de plástico e cubra as raízes com uma toalha de papel molhada por 5 dias para aclimatá-las. (B) Transferir as plântulas para bandejas de células contendo mistura de vasos comerciais alterada com fertilizante NPK completo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Transplante as mudas em vasos . (A) Na segunda a terceira fase de folha verdadeira, transplante as mudas para vasos de 30 cm de diâmetro cheios de meio de envasamento emendado com fertilizante. (B) Fornecer suporte de treliça para plantas de videira e fazer hibridização controlada quando as plantas começarem a florescer. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Um total de 15 genótipos de abóbora, quatro C. pepo e 11 C. moschata, foram utilizados no estudo para cruzamentos interespecíficos.

Tabela 2: Combinações cruzadas tentadas com os 15 genótipos de abóbora e o conjunto de frutos correspondente, número de sementes abortadas, embriões imaturos e resgates de embriões bem-sucedidos.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.