Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En strategi för studier av IL-9-producerande lymfoida celler i Nippostrongylus brasiliensis-infektionsmodellen

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64075
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

IL-9-uttryckande T- och ILC2-celler induceras under N. brasiliensis-infektion , men deras karakterisering har till stor del förbisetts i den infekterade tarmen på grund av deras lågfrekventa och differentiella kinetik. Detta protokoll beskriver isoleringen av dessa celler från olika målorgan och bekräftelse av deras identitet via flödescytometri vid olika infektionsstadier.

Abstract

IL-9 är ett pleiotropiskt cytokin associerat med olika processer, inklusive antitumörimmunitet, induktion av allergiska patologier och immunsvaret mot helminthinfektioner, där det spelar en viktig roll vid utvisning av parasiten. I en murin modell av Nippostrongylus brasiliensis-infektion produceras IL-9 huvudsakligen av CD4 + T-lymfocyter och medfödda lymfoida celler som finns i lungan, tunntarmen och dränerande lymfkörtlar. Med tanke på de tekniska svårigheterna med intracellulär färgning av IL-9, liksom komplexiteten att isolera hematopoetiska celler från tunntarmen vid infektion, finns det ett pressande behov av ett omfattande men enkelt protokoll för att analysera uttrycket av IL-9 i olika lymfoida och icke-lymfoida vävnader i denna modell. Protokollet som beskrivs här beskriver kinetiken för IL-9 som produceras av CD4 + T-celler och medfödda lymfoida celler i lungan och tunntarmen, de viktigaste organen riktade mot N. brasiliensis, liksom i mediastinala och mesenteriska lymfkörtlar, under hela infektionen. Dessutom beskriver den antalet larver som behövs för infektion, beroende på celltyp och organ av intresse. Detta protokoll syftar till att hjälpa till med standardisering av analyser för att spara tid och resurser genom att erbjuda möjlighet att fokusera på de specifika cellerna, organen och sjukdomsstadierna av intresse för N. brasiliensis-infektionsmodellen.

Introduction

Hakmask är tarmparasiter som infekterar cirka 700 miljoner människor över hela världen, mestadels i tropiska områden i underutvecklade länder. Högintensiva infektioner med Ancylostoma duodenale och Necator americanus, de vanligaste hakmaskparasiterna hos människor, orsakar anemi och proteinbrist som kan leda till försenad tillväxt och mental utveckling1. N. americanus och gnagarparasiten Nippostrongylus brasiliensis inducerar ett prototypiskt typ 2-immunsvar hos sin värd och delar likheter i deras livscykel. Därför är infektion av möss med N. brasiliensis den vanligaste modellen för humana hakmaskinfektioner. Steg 3 (L3) N. brasiliensis infektiösa larver flyttar från huden till lungan under de första timmarna efter infektion. En gång i lungan blir de L4 och migrerar upp i luftstrupen för att sväljas, passera genom magen och nå tarmen för att bli vuxna (L5) inom 4-5 dagar. I tarmen lägger L5-maskar ägg som utsöndras i avföringen för att starta om parasitens livscykel2.

Immunsvaret inducerat av N. brasiliensis kännetecknas av en ökning av flera typ 2-cytokiner, inklusive IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 och IL-13, tillsammans med eosinofili, basofili, bägare och mastcellshyperplasi och ökad IgG1- och IgE-produktion. De flesta studier som försöker identifiera och definiera immunsvaren som framkallas vid N. brasiliensis-infektion är inriktade på rollen som IL-4 eller IL-13 i denna modell3. Identifieringen och karakteriseringen av IL-9-uttryckande celler och funktionen av detta cytokin hade emellertid i stor utsträckning förbisetts, tills Licona-Limón et al. publicerade den första studien som visade en kritisk roll för IL-9 i immunsvaret mot N. brasiliensis. Med hjälp av reportermöss beskrev denna studie T-celler (mestadels T-hjälpare 9) och typ 2 medfödda lymfoida celler (ILC2) som de viktigaste cellulära undergrupperna som uttrycker IL-9 vid infektion4.

Isolering och karakterisering av immunceller från helminthinfekterade lungor är möjlig och har rapporterats utförligt 3,4. Men på grund av den inneboende vävnadsremodelleringen och slemproduktionen visade det sig vara en teknisk utmaning att göra det i den infekterade tarmen fram till den senaste publiceringen av Ferrer-Font et al.5. Gruppen skisserade ett protokoll för att isolera och analysera encellssuspensioner av immunundergrupper från Heligmosomoides polygyrusinfekterade murina tarmar. Baserat på det har vi nu standardiserat ett protokoll för isolering och cytometrisk analys av IL-9-uttryckande lymfoida celler från N. brasiliensis-infekterad tarm. Dessutom har vi etablerat IL-9-kinetik från olika cellulära källor och anatomiska platser under hela infektionen.

Att karakterisera de distinkta cellpopulationerna som är involverade i denna infektion är avgörande för en bredare förståelse av immunsvaret mot parasiten och dess interaktion med värden. Detta omfattande protokoll ger en tydlig väg att isolera och analysera IL-9-producerande celler från önskade organ i sjukdomsstadier av intresse, vilket möjliggör en kraftig förbättring av kunskapen om dessa cellers roll i N. brasiliensis-infektion och parasitinfektioner i allmänhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök som beskrivs här godkändes av den interna kommittén för djurhantering (CICUAL) vid Institute of Cellular Physiology, National Autonomous University of Mexico.

OBS: Ett flödesschema över hela protokollet visas i figur 1.

1. Hus av möss

  1. Använd 8-10 veckor gamla, kvinnliga eller manliga grupper av möss, inrymda i djuranläggningar med konstant temperatur och fuktighet i 12 timmars ljusa / mörka cykler, med ad libitum tillgång till vatten och mat.
    OBS: Detta protokoll använder en IL-9-rapportmusstam i C57BL / 6-bakgrund, som tidigare beskrivits4; andra IL-9-reporterstammar kan dock användas 6,7,8, såväl som intracellulär IL-9-färgning, med varierande resultat 9.

2. Infektion av möss

  1. Raka baksidan av mössen från mitten av kroppen till nära svansbasen 1 dag före infektion. Användningen av bedövningsmedel är inte nödvändig.
  2. Inokulera varje mus subkutant med 200 livskraftiga N. brasiliensis-larver i tredje stadiet (L3) i 100 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS)10 i nedre delen av ryggen, som tidigare beskrivits2,11, eller injicera 100 μl enbart PBS som kontroll. Offra djuren på dag 4, dag 7 eller dag 10 efter infektion.

3. Isolering av lung-, tunntarms-, mediastinal- och mesenteriska lymfkörtlar

  1. Eutanize musen genom cervikal dislokation. Placera musen på ryggen och spraya den med 70% etanol. Gör ett snitt i mittlinjen med sax och öppna huden för att exponera buk- och bröstområdena.
    OBS: Isofluran kan användas som alternativ dödshjälpsmetod12. Koldioxidkammare rekommenderas inte, eftersom CO2 leder till lungvävnadsskada och blödning13.
  2. Isolering av mediastinala lymfkörtlar och lungor
    1. Gör ett snitt vid bröstbenet och skär i en "V" -form för att ta bort revbenen och bröstmusklerna. När brösthålan är exponerad, lokalisera mediastinallymfkörtlarna bredvid matstrupen, under hjärtat (se kompletterande figur 1).
    2. Extrahera mediastinala lymfkörtlar och samla dem i 1 ml R-10-medium (tabell 1) i en odlingsplatta med 12 brunnar. Håll på is, skyddad från ljus tills bearbetning.
      OBS: Proverna bör skyddas från ljus för att undvika att minska den fluorescerande signalen från rapportmössen som används i dessa experiment.
    3. Extrahera lungorna och samla dem i 1 ml R-10-medium i en 12-brunns odlingsplatta per mus. Håll på is, skyddad från ljus tills bearbetning.
  3. Isolering av mesenteriska lymfkörtelkedjor och tunntarmen
    1. Exponera bukhålan och flytta försiktigt tunntarmen till höger för att exponera den mesenteriska lymfkörteln (MLN) kedjan längs tjocktarmen.
    2. Ta bort MLN med pincett, rulla den försiktigt på en pappershandduk och dra av fettet.
    3. Överför MLN till 1 ml R-10-medium i en odlingsplatta med 12 brunnar. Håll på is, skyddad från ljus tills bearbetning.
    4. Skär tunntarmen strax under pylorisk sfinkter och ovanför cecum. Dra ut tarmarna långsamt med hjälp av pincett, ta bort den bifogade mesenterien och fettvävnaden.
    5. Placera tunntarmen på en pappershandduk och fukta den generöst med PBS. Ta bort Peyers fläckar från tunntarmen med sax.
      OBS: För att bibehålla livskraften, ta bort den återstående fettvävnaden och håll tunntarmen fuktig med PBS under hela processen.
    6. Skär tunntarmen i längdriktningen med sax och skjut försiktigt pincetten över den öppna tarmen för att avlägsna fekalinnehållet och slem.
    7. Håll tunntarmen med pincett och tvätta den i 5 ml PBS på is genom att försiktigt nedsänka den några gånger. Upprepa två gånger.
    8. Skär tunntarmen i korta bitar (ca 5 mm) och samla dem i ett 50 ml koniskt rör med 10 ml HBSS14 med 2% FBS (tabell 1). Fortsätt omedelbart att isolera intraepiteliala och lamina propria-celler.

4. Beredning av encellssuspensioner från tunntarmen, lungan och lymfkörtlarna

OBS: Det är extremt viktigt att bearbeta högst sex möss per person vid beredning av encellssuspensioner från tunntarmen, eftersom cellviabiliteten minskar avsevärt med längre bearbetningsperioder. Denna metod anpassades från Heligmosomoides polygyrus infektionsmus modell5.

  1. Förvärm skakinkubatorn, R-20-mediet, HBSS och HBSS-2 mM EDTA (tabell 1) vid 37 °C.
  2. Bered 10 ml tunntarmsdigestionsmedium (tabell 1) per prov.
  3. Skaka tarmbitarna kraftigt från steg 3.3.8 för hand.
  4. Filtrera varje prov genom ett nylonnät (ca 10 cm x 10 cm) över en glastratt. Tvätta provet genom att tillsätta 10 ml förvärmd HBSS över nätet och kasta genomflödet. Upprepa en gång till.
    OBS: Använd ett nytt nät för varje prov och återanvänd det under hela proceduren.
  5. Ta bort nätet från tratten och samla provet från nätet i ett 50 ml koniskt rör med 10 ml varm HBSS-2 mM EDTA (steg 4.1). Inkubera i 10 minuter vid 37 °C med skakning vid 200 rpm.
  6. Virvel i 10 s vid maximalt varvtal (3 200 varv/min) och filtrera provet med nätet över en glastratt och återvinn genomströmningen i ett 50 ml koniskt rör.
  7. Upprepa steg 4.5 och 4.6 två gånger och återställ genomströmningen i samma 50 ml koniska rör. De intraepiteliala cellerna är belägna i denna 30 ml fraktion. Spara den återstående vävnaden.
  8. Encellssuspensionspreparat från intraepitelceller
    1. Centrifugera 30 ml cellsuspension, återvunnen i steg 4.7, vid 450 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten.
    2. Tillsätt 5 ml PBS och centrifugera vid 450 x g i 5 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
    3. Resuspendera cellpelleten i 3 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNas (tabell 1). Håll på is, skyddad från ljus tills cellfärgning.
  9. Encellssuspensionspreparat från lamina propria-celler
    1. Tvätta den återstående tunntarmsvävnaden från steg 4.7 genom att hälla över 10 ml varm HBSS genom nätet över tratten. Upprepa tvätten. Samla vävnaden från nätet i ett 50 ml koniskt rör med 10 ml tunntarmsmatsmältningsmedium.
    2. Inkubera i 30 minuter vid 37 °C med skakning vid 200 varv/min. Virvel med maximal hastighet i 10 s var 5: e minut.
    3. Tillsätt 10 ml FACS-EDTA-buffert (tabell 1) för att stoppa matsmältningsreaktionen och lägg den på is.
    4. Filtrera varje prov genom en 100 μm cellsil med hjälp av en serologisk pipett och återvinn suspensionen i ett 50 ml koniskt rör placerat på is.
    5. Centrifugera vid 600 x g i 6 min vid 4 °C.
    6. Kassera supernatanten. Tvätta cellpelleten med 5 ml PBS och centrifugera vid 600 x g i 6 minuter vid 4 °C.
    7. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 1 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase. Håll på is, skyddad från ljus tills cellfärgning.
  10. Encellssuspensionspreparat från lunga
    OBS: Varje lunga och tunntarm bör behandlas parallellt av två personer för att undvika förlängda hanteringstider, vilket resulterar i låg cellviabilitet.
    1. Bered 4 ml lunguppslutningsmedium (tabell 1) per behandlat prov.
    2. Ta bort RPMI-mediet från brunnen som innehåller lungorna från steg 3.2.3. Skär lungan i små bitar med fin sax.
    3. Överför lungbitarna till ett 15 ml koniskt rör med en spatel. Tillsätt 4 ml lunguppslutningsmedium (tabell 1).
    4. Inkubera i 30 minuter vid 37 °C med skakning vid 250 varv/min. När du är klar, håll på is tills varje prov har bearbetats.
    5. Filtrera varje prov genom en 100 μm cellsil, placerad i en enda brunn på en 6-brunns odlingsplatta. Lossa vävnaden med en sprutkolv.
    6. Återvinn varje prov i ett 15 ml koniskt rör och tillsätt 4 ml R-2-medium (tabell 1). Håll på is medan de andra proverna bearbetas.
    7. Centrifugera vid 600 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten på nytt i 1 ml R-5-medium (tabell 1).
    8. Bered under centrifugering 4 ml 27,5% densitetsgradientlösning (tabell 1) per prov för att berika den hematopoetiska cellfraktionen15,16. Denna strategi för encellsseparation är effektivare, kostnadseffektivare och mindre giftig jämfört med andra liknande densitetsgradientmedier17.
    9. Tillsätt 4 ml 27,5 % densitetsgradientlösning till 1 ml cellsuspension från steg 4.10.7 och skaka kraftigt.
    10. Tillsätt långsamt 1 ml R-5-medium (tabell 1) ovanpå den blandade suspensionen för att skapa två faser.
    11. Centrifugera vid 1 500 x g i 20 minuter vid RT, med låg acceleration och bromsen avstängd. Observera ringen som bildas mellan de två faserna.
    12. Återställ ringen som bildats mellan de två faserna med en 1 ml mikropipett och resuspendera i 4 ml R-2-medium.
    13. Centrifugera vid 450 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 1 ml ACK-buffert (tabell 1) och inkubera i 1 min vid rumstemperatur.
    14. Tillsätt 4 ml R-5-medium och centrifugera vid 450 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 1 ml R-10-medium. Håll på is, skyddad från ljus tills färgning för flödescytometri.
  11. Encellssuspensionspreparat från lymfkörtlar
    1. Placera lymfkörtlarna från steg 3.2.2 eller 3.3.3 mellan två nätstycken i en brunn från en 6-brunns odlingsplatta och dissociera med en sprutkolv.
    2. Återställ cellsuspensionen i ett 1,5 ml koniskt rör och centrifugera vid 450 x g i 5 minuter vid 4 °C.
    3. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 1 ml R-10-medium. Håll på is, skyddad från ljus tills färgning för flödescytometri.
      OBS: Om klumpar är synliga, filtrera provet genom en 100 μm cellsil.

5. Cellfärgning för flödescytometri (figur 2 och figur 3)

Centrifugera lymfkörtelcellsuspensionerna från steg 4.11.3 vid 450 x g i 5 minuter vid 4 °C och suspendera cellpelleten på nytt i 500 μl FACS-buffert (tabell 1).

  1. Cellfärgning för identifiering av ILC2s (figur 3 och kompletterande figur 2)
    OBS: Denna färgningsprocedur är specifik för identifiering av IL-9-uttryckande ILC2-celler.
    1. Platta 150 μl per lungprov (ungefär 1,8 x 10 6 celler) från steg 4.10.14 och 50 μl per lymfkörtelprov från steg 4.11.3 (ungefär 0,7 x 10 6 och 2,2 x 106 celler för mediastinala respektive mesenteriska lymfkörtelprover) i en konisk bottenodlingsplatta med 96 brunnar. Tillsätt 100 μl FACS-buffert och centrifugera vid 450 x g i 5 minuter vid 4 °C.
    2. Platta 100 μL per tunntarmsprov (ca 2,7 x 10 6 och 0,6 x 106 celler för intraepiteliala respektive lamina propria-prover) från steg 4.8.3 och 4.9.7 i en 96-brunns konisk bottenodlingsplatta. Tillsätt 150 μl FACS-buffert och centrifugera vid 450 x g i 5 min vid 4 °C.
    3. Kassera supernatanten och suspendera varje cellpellet i 50 μl biotinylerad antikroppscocktail (tabell 2) utspädd i FACS-buffert. Inkubera i 30 minuter vid 4 °C skyddad från ljus.
      OBS: Använd FACS-buffert med 20 μg/ml DNas för intraepiteliala och lamina propria-prover.
    4. Tillsätt 150 μL FACS-buffert. Centrifugera vid 450 x g i 5 min vid 4 °C.
    5. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 200 μL FACS-buffert. Centrifugera igen och kassera supernatanten.
    6. Återsuspendera cellpelleten i 50 μl av antikropps-/fläckcocktailen (tabell 2) och inkubera i 30 minuter vid 4 °C skyddad från ljus.
    7. Tillsätt 150 μL FACS-buffert. Centrifugera vid 450 x g i 5 min vid 4 °C.
    8. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 200 μL FACS-buffert. Centrifugera igen och kassera supernatanten. Upprepa tvätten (steg 5.1.7) och kassera supernatanten.
    9. Resuspendera cellpelleten i 300 μL FACS-buffert och analysera med flödescytometri.
    10. För tunntarms- och lungproverna, använd grindstrategin: lymfocyter, enskilda celler, levande celler, hematopoetiska celler, CD90 + Lineage-celler, ST2 + -celler och IL-9 + -celler (figur 3A, B och kompletterande figur 2A). För lymfkörtelproverna, använd grindstrategin: levande celler, enskilda celler, CD90 + Lineage-celler, ST2 + -celler och IL-9 + -celler (kompletterande figur 2B, C).
  2. Cellfärgning för identifiering av IL-9-producerande lymfocyter (figur 2 och kompletterande figur 3)
    1. Överför 800 μl per lungprov från steg 4.10.14 till ett 1,5 ml rör (ungefär 14,6 x 106 celler). Centrifugera vid 450 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten.
    2. För lymfkörtelprover, platta 400 μL av cellsuspensionen från steg 4.11.3 (ungefär 5,6 x 10 6 och 17,5 x 106 celler för mediastinala respektive mesenteriska lymfkörtelprover) i en 96-brunns konisk bottenplatta i två steg.
      1. Överför först 200 μl, centrifugera vid 450 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten.
      2. Överför ytterligare 200 μL till motsvarande brunn. Centrifugera vid 450 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
    3. Återsuspendera cellpelleten i 50–400 μl av antikropps-/fläckcocktailen (tabell 3) och inkubera i 30 minuter vid 4 °C skyddad från ljus.
      OBS: Lungprover ska återsuspenderas i 400 μL, mediastinala lymfkörtelprover i 50 μL och mesenteriska lymfkörtelprover i 100 μL av färgningscocktailen.
    4. Tillsätt 150 μl FACS-buffert till mediastinallymfkörtelproverna och 100 μl till mesenteriallymfkörtelproverna. Centrifugera vid 450 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
    5. Tvätta lung- och lymfkörtelproverna genom att återsuspendera pelletsen i 1 ml respektive 200 μl FACS-buffert. Centrifugera vid 450 xg i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och upprepa tvätten.
    6. Resuspendera lungproverna i 600 μL FACS-buffert och analysera dem med flödescytometri. Använd grindstrategin: lymfocyter, enskilda celler, levande celler, hematopoetiska celler, CD4 + TCRβ + -celler och IL-9 + -celler (figur 2A).
    7. Resuspendera lymfkörtelproverna i 300 μL FACS-buffert och analysera med flödescytometri. Använd grindstrategin: lymfocyter, enskilda celler, levande celler, CD4 + TCRβ + -celler och IL-9 + -celler (figur 2B och kompletterande figur 3A).

6. Bestämning av det absoluta antalet celler i encellssuspensioner

  1. Späd proverna från isoleringsstegen 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 och 4.11.3 med PBS i förhållandet 1:20 (10 μl prov + 190 μl PBS).
  2. Blanda 10 μl av varje utspätt prov från steg 6.1 med 10 μl trypan blue. Fyll 10 μL i en hemocytometer och räkna de levande cellerna, med hänsyn till varje utspädning.
  3. Erhåll det absoluta antalet celler genom att multiplicera procentandelen av populationen av intresse från levande celler bestämda genom flödescytometri (viabilitetsfärgnegativa celler) med det totala antalet levande celler i encellssuspensionen efter isolering och dividera detta antal med 100 (kompletterande figur 4, kompletterande figur 5 och kompletterande figur 6).
    Absolut tal = (Procentandel av populationen av intresse från levande celler bestämd med flödescytometri x Totalt antal levande celler i encellssuspensionen)/100

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Möss injicerades subkutant med 200 L3-stadium N. brasiliensis-larver eller med PBS för skenkontroller. Antalet larver som användes i detta protokoll justerades för att isolera livskraftiga celler från lungorna, lymfoid vävnad och tunntarmen, till skillnad från tidigare rapporter där högre belastningar av maskar användes för att detektera celler i lymfoida vävnader och lungor endast4. Lungor, mediastinala lymfkörtlar, mesenteriska lymfkörtlar och tunntarmen skördades vid dag 0, 4, 7 och 10 efter infektion för lymfocytisolering och karakterisering av IL-9-producerande populationer. Totalt 27 möss användes i två eller flera oberoende experiment, inklusive nio kontroller och fyra till sex N. brasiliensis-infekterade möss per analyserad tidpunkt. Sham-infekterade kontroller inkluderades i varje experiment för att erhålla basaltal. Med hjälp av detta protokoll kan IL-9-producerande CD4 + T-celler (mestadels Th9-celler i denna modell) isoleras från lung-, mesenteriska och mediastinala lymfkörtlar för kvantifiering och vidare analys.

Efter det naturliga infektionsförloppet bedömde vi först frekvenserna av IL-9-producerande CD4 + T-lymfocyter (Th9) som finns i lungorna och mediastinala lymfkörtlar (grindstrategi som visas i figur 2A och kompletterande figur 3A). I båda organen ökade Th9-frekvenserna, med början på dag 4, och nådde en topp vid dag 7 efter infektion (figur 2C), en ökning som också observerades i Th9 absoluta tal (kompletterande figur 4A, B). I de mesenteriska lymfkörtlarna (grindstrategi som visas i figur 2B) sågs en signifikant ökning av både frekvenserna och det absoluta antalet Th9-celler dag 7 och 10 efter infektion (figur 2C och kompletterande figur 4C), i enlighet med tidigare rapporter4. Förekomsten av T-celler och ILC2s bekräftades i intraepitelial- och lamina propria-proverna; dock observerades inga Th9-celler i dessa tarmkompartment under hela infektionen (kompletterande figur 3B, C).

Vi utvärderade sedan IL-9-uttryckande ILC2-celler i lymfoida och icke-lymfoida vävnader hos infekterade möss (gatingstrategi som visas i figur 3A, B och kompletterande figur 2). Vi observerade en signifikant ökning av frekvenserna av ST2+ IL-9- och ST2+ IL-9+ som uttrycker ILC2s i lungorna vid dag 7 efter infektion (figur 3C). Samtidigt avslöjade analys av absoluta tal en statistiskt signifikant ökning endast i ST2+ IL-9+-populationen vid dag 7 efter infektion (kompletterande figur 5A). I de mediastinala lymfkörtlarna (grindstrategi som visas i kompletterande figur 2B) ökade antalet IL-9-uttryckande ILC2-celler (ST2+ IL-9+) signifikant vid dag 10 efter infektion, medan det absoluta antalet ST2+-celler visade en trend att öka, från dag 7 och fortsätter till dag 10 efter infektion (kompletterande figur 6A, C).

IL-9+ ILC2-celler hittades också i lamina propria och intraepiteliala kompartment i tunntarmen (gating strategi visas i figur 3B och kompletterande figur 2A). N. brasiliensis-infektion resulterade i en statistiskt signifikant ökning av frekvenserna av ST2+ IL-9+-celler vid dag 4 och ST2-IL-9+ populationer vid dag 7 och 10 i lamina propria. I det intraepiteliala kompartmentet observerades också en signifikant förändring i frekvenserna av ST2+ IL9+ och ST2-IL-9+ celler vid dag 7 respektive dag 10 efter infektion (figur 3C). Viktigt, även med ett relativt lågt antal larvbelastning, orsakade infektion med parasiten omfattande skador på tunntarmen; Därför är analysen av IL-9-uttryckande ILC2s absoluta tal tekniskt omöjlig, vilket hindrar en korrekt kvantifiering av denna population på grund av låga utbyten av levande celler (kompletterande figur 5B, C). Å andra sidan avslöjade analysen av mesenteriska lymfkörtlar (grindstrategi som visas i kompletterande figur 2C) en signifikant ökning av absoluta tal ST2 + IL-9-, ST2 + IL-9 + och ST2- IL-9 + ILC2-celler vid dag 10 efter infektion (kompletterande figur 6D), som tidigare rapporterats4. Samtidigt observerades ingen skillnad i frekvensen av dessa populationer under hela infektionen (kompletterande figur 6B). Dessa olika undergrupper av ST2- och IL-9-uttryckande celler är spännande populationer med potentiellt differentiella roller in vivo och kan motsvara naturliga kontra inflammatoriska ILC2 som nyligen beskrivits 18,19,20,21. Detta måste dock tas upp i framtida studier.

Sammanfattningsvis justerade vi detta protokoll för återhämtning av IL-9-uttryckande celler från N. brasiliensis-infekterad tarm, samtidigt som vi fortfarande kunde upptäcka dem i lung- och lymfoidvävnaden. Att hämta immunceller från parasitinfekterade tarmar har visat sig vara tekniskt svårt. Här resulterade ett justerat antal larver som användes för infektion i förbättrad tarmvävnadsintegritet, vilket möjliggjorde återhämtning av en IL-9 + -population. Såvitt vi vet är detta det första protokollet som utvecklats specifikt för analys av IL-9-uttryckande celler i tarmen under N. brasiliensis-infektion. Ändå kan andra immunceller också isoleras efter dessa steg. Data som presenteras här visar att de flesta vävnadsbosatta IL-9-uttryckande celler i tunntarmen är ILC2s.

Figure 1
Figur 1: Flödesschema för det beskrivna protokollet. Schematiskt diagram med de viktigaste stegen som används för att bearbeta olika organ och de förväntade IL-9-uttryckande cellundergrupperna erhållna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Th9-celler finns i lungor, mediastinum och mesenteriska lymfkörtlar under hela N. brasiliensis-infektion. Representativ flödescytometrianalys och grindstrategi som används för Th9-cellidentifiering från (A) lungor och (B) mesenteriska lymfkörtlar. Encellssuspensioner från varje organ färgades med ett fixerbart livskraftsfärgämne, fluorescerande märkt anti-CD45 för identifiering av hematopoetiska celler och anti-T-cellreceptor (TCR) β och anti-CD4 för identifiering av CD4 + T-lymfocyter. GFP+-signalen anger procentandelen närvarande Th9-celler. Den första grinden visar sidospridning (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A-egenskaper med lymfoida cellers klassiska morfologi. Encellshändelser valdes, följt av levande celler och sedan CD45 + -celler. Inom denna population fokuserade vi på TCR-β och CD4 dubbelpositiva celler, från vilka GFP + -celler identifierades som Th9-celler. Färgningen av lymfkörtlar inkluderade inte anti-CD45-antikroppen, eftersom hela befolkningen förväntas vara positiv. (C) Frekvenser av Th9-celler som finns i lungor, mediastinum och mesenteriska lymfkörtlar vid de angivna tidpunkterna efter infektion. Data representerar medelvärdet ± SEM för en eller två möss analyserade per grupp, från tre oberoende experiment, per tidpunkt; Oparat T-test; *p≤ 0,05, **p≤ 0,001, ***p≤ 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: IL-9-producerande ILC2-celler finns i icke-lymfoida organ. Representativ flödescytometrianalys och grindstrategi som används för identifiering av IL-9+ ILC2-celler från (A) lunga och (B) tunntarmen lamina propria. Encellssuspensioner från varje organ märktes med biotinylerade antikroppar för att identifiera härstamningsceller (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 och anti-Ter119) och Fc-Block. Cellsuspensioner färgades sedan med fixerbart livskraftsfärgämne, fluorkrommärkt streptavidin, anti-CD45 för identifiering av hematopoetiska celler och anti-CD90 för identifiering av ILC2-celler. Den första grinden visar scatter (SSC)-A/side scatter (FSC)-A egenskaper med lymfoida cellers klassiska morfologi. Encellshändelser valdes, följt av levande celler och sedan CD45 + -celler. Inom denna population fokuserade vi på CD90+ linceller; från denna grupp utvärderade vi ST2- och GFP-uttryck för att identifiera IL-9 + ILC2-celler. (C) Frekvenser av ILC2-celler som påträffas i lungor, lamina propria och intraepitelcellfacket vid de angivna tidpunkterna efter infektion. Data representerar medelvärdet ± SEM för en eller två möss analyserade per grupp, från tre oberoende experiment, per tidpunkt; oparad T-test; *p ≤ 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Förteckning över kemiska lösningar och deras sammansättningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Antikroppscocktail för att identifiera IL-9-producerande ILC2-celler. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Antikroppscocktail för att identifiera IL-9-producerande T-lymfocyter. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande figur 1: Schematisk representation av mediastinallymfkörtelns läge. Skapad i BioRender.com Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Representativ flödescytometri och grindstrategi som används för att identifiera IL-9+ ILC2s inom intraepitelceller från tunntarmen och lymfkörtlarna. (A) Encellssuspensioner från intraepitelceller i tunntarmen inkuberades först med biotinmärkta antikroppar för att välja härstamningsceller (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 och anti-Ter119) och Fc-Block. Detta följdes av färgning med ett fixerbart livskraftsfärgämne, fluorokrommärkt streptavidin, anti-CD45 för identifiering av hematopoetiska celler och anti-CD90 för identifiering av ILC2-celler. Den första grinden visar sidospridning (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A-egenskaper med lymfoida cellers klassiska morfologi. Encellshändelser valdes, följt av levande celler och sedan CD45 + -celler. Inom denna population fokuserade vi på CD90+ linceller; från denna grupp identifierades GFP + -celler som IL-9 + ILC2-celler. (B,C) Representativ flödescytometri och grindstrategi för (B) mediastinala lymfkörtlar och (C) mesenteriska lymfkörtlar för att identifiera IL-9+ ILC2-celler. Färgning av lymfkörtlar inkluderade inte anti-CD45-antikroppen, eftersom hela populationen förväntades vara positiv. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Representativ flödescytometrianalys och grindstrategi som används för att identifiera Th9-celler i mediastinala lymfkörtlar och tunntarmen. Encellssuspensioner från (A) mediastinala lymfkörtlar färgades med ett fixerbart livskraftsfärgämne och fluorescerande märkta anti-TCR-β och anti-CD4-antikroppar. Den första grinden visar sidospridning (SSC)-A/forward scatter (FSC)-A-egenskaper med lymfoida cellers klassiska morfologi. Encellshändelser valdes, följt av levande celler och sedan TCR-β och CD4 dubbelpositiva celler; från denna grupp identifierades GFP + -celler som Th9-celler. En liknande flödescytometristrategi användes för (B) lamina propria och (C) intraepitelceller från tunntarmen, förutom att CD45 + -celler valdes efter de levande cellerna, följt av TCR-β och CD4 dubbelpositiva celler, varifrån GFP + -celler identifierades som Th9-celler. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Det absoluta antalet Th9-celler förändras signifikant under hela infektionen. Absoluta antal IL-9+ celler från TCR-β och CD4 dubbelpositiva celler bestämdes dag 0, 4, 7 och 10 efter infektion i (A) lunga, (B) mediastinala lymfkörtlar och (C) mesenteriska lymfkörtlar. Data representerar medelvärdet ± SEM för en eller två möss analyserade per grupp, från tre oberoende experiment, per tidpunkt; oparad T-test *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: Absoluta antal IL-9 + ILC2-celler skiljer sig åt under hela infektionen. Absoluta antal IL-9+ ILC2-celler från lin-CD90+-populationen dag 0, 4, 7 och 10 efter infektion bestämdes i (A) lunga, (B) lamina propria och (C) intraepitelceller från tunntarmen. Data representerar medelvärdet ± SEM för en eller två möss analyserade per grupp, från tre oberoende experiment, per tidpunkt; oparad T-test *p ≤ 0,05. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 6: Frekvenser och absoluta antal IL-9 + ILC2-celler i lymfkörtlar ökar signifikant under infektion. (A) Frekvens och (C) absoluta antal IL-9+ ILC2-celler från mediastinala lymfkörtlar. (B) Frekvens och (D) absoluta tal av IL-9+ ILC2-celler från mesenteriska lymfkörtlar. Värdena bestämdes som IL-9+ ILC2-celler inom lin-CD90+-populationen dag 0, 4, 7 och 10 efter infektion. Data representerar medelvärdet ± SEM för en eller två möss analyserade per grupp, från tre oberoende experiment, per tidpunkt; oparad T-test * p ≤ 0,05, ***p ≤ 0,0001. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 7: Flödescytometrianalys av IL-9 som uttrycker ILC2-celler från N. brasiliensis-infekterad tarm. Representativa diagram över ILC2-celler isolerade från tarmen hos IL-9-reportermöss vid dag 7 efter infektion. IL-9-uttryck bedömdes i ILC2-celler som nyligen isolerats från intraepiteliala eller lamina propria-fack hos infekterade reportermöss (IL-9 REP) jämfört med att följa det tidigare beskrivna IL-9 intracellulära färgningsprotokollet 9 (IL-9 AB, med användning av en IL-9-antikroppsklon RM9A4, BioLegend). För att identifiera IL-9-uttryckande ILC2s inkuberades enstaka cellsuspensioner först med biotinmärkta antikroppar för att välja härstamningsceller (anti-B220, anti-CD11b, anti-FcεRI, anti-TCR-β, anti-TCR-γδ, anti-Siglec F, anti-CD4, anti-CD11c, anti-Gr-1, anti-CD8, anti-CD19, anti-NK1.1 och anti-Ter119) och Fc-Block, följt av färgning med flexibelt livskraftsfärgämne, fluorkrommärkt streptavidin, anti-CD45 och anti-CD90. Diagrammen visar IL-9-uttryckande ILC2-celler gated på lin-CD45 + CD90 + -populationen närvarande i intraepitelial (A, B) och lamina propria (C, D) fack, detekterad via reportersignalen från nyligen isolerade celler (A, C) eller efter intracellulär färgning av IL-9 (B, D). Kontrollmöss injicerades med PBS. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En fullständig förståelse av intestinala parasit-värdinteraktioner och immunsvar mot helminthinfektion kräver identifiering och analys av de olika cellpopulationerna och effektormolekylerna som är nyckeln till induktion av vävnadsremodellering och maskutdrivning. Jordöverförda helminthinfektioner utgör ett stort problem i utvecklingsländer över hela världen. Fram till nyligen var emellertid ett protokoll som möjliggjorde analys av sällsynta cellpopulationer närvarande i tunntarmen, huvudorganet som påverkas av denna infektion, inte tillgängligt5. Detta protokoll täcker tidigare beskrivna metoder som möjliggör flödescytometrisk analys av IL-9-uttryckande lymfoida celler i lung-, mediastinal- och mesenteriska lymfkörtlar under N. brasiliensis-infektion , med den ytterligare fördelen att identifiera denna population för första gången i tunntarmen.

Framgången för detta protokoll är starkt beroende av vävnadsbehandlingstider. Det är absolut nödvändigt att behandla högst sex tunntarmsprover, per person, samtidigt. Om olika organ ska bearbetas rekommenderar vi att det görs parallellt av en annan person. Genom att använda en relativt låg parasitbelastning (200 L3-larver) möjliggör detta protokoll isolering av lymfoida celler från N. brasiliensis-infekterad tarm samtidigt som förmågan att isolera dessa celler från andra organ bibehålls. Användningen av högre parasitbelastningar äventyrar kvaliteten och kvantiteten av celler isolerade från tunntarmen (data visas inte); Det kan dock resultera i en signifikant ökning av IL-9-uttryckande lymfoida celler i andra organ4. Vid bearbetning av tarmen och mesenteriska lymfkörtlar är det viktigt att ta bort den vidhäftade fettvävnaden, eftersom underlåtenhet att göra det resulterar i ökad celldöd. Data stöder observationen att det naturliga infektionsförloppet negativt påverkar det absoluta antalet lymfoida celler som återvinns från tunntarmen. I de studier som beskrivs här förblir frekvenserna av IL-9 + ILC2-celler konsekventa, medan absoluta tal visar hög variabilitet i varje oberoende experiment. Därför kan slutsatser som dras från absoluta tal vara felaktiga och bör undvikas. Dessutom, med tanke på den låga frekvensen av IL-9-uttryckande T-celler i vävnader, rekommenderas förvärv och färgning av högsta möjliga antal celler.

En begränsning med denna ILC2-analys är användningen av en diskret kombination av markörer för att definiera denna population. Beroende på vävnaden av intresse och infektionsfas kan ytterligare markörer, såsom CD25, Klrg1 och ST2 bland andra, användas för en mer detaljerad fenotypisk karakterisering av ILC2-celler22. Vi erkänner att protokollet som presenteras här är baserat på INFER-rapportmusstammen4 och kan utgöra en fördel för identifiering av IL-9-uttryckande celler. Vi förväntar oss dock att resultaten som finns här kan erhållas med hjälp av alternativa strategier, inklusive användning av andra musreporterstammar och intracellulär IL-9-färgning 6,7,8,9. Det är viktigt att nämna att användning av konventionella möss och utförande av intracellulär färgning av IL-9 i intraepiteliala och lamina propria-celler kan leda till att man förlorar någon detekterbar signal och äventyrar de erhållna uppgifterna (kompletterande figur 7). Detta kan bero på den långsiktiga manipulation som krävs för att färga en delmängd som redan är svår att isolera och upprätthålla ex vivo. Därför rekommenderar vi användning av rapportmössstammar för att minska bearbetningstiderna och säkerställa en tillförlitlig analys av IL-9-uttryck in vivo. Vi erkänner också det faktum att Th9-celler inte är de enda T-cellerna som uttrycker IL-923; Men i denna parasitiska modell skulle vi inte förvänta oss att andra delmängder skulle uttrycka det. För att förkasta närvaron av andra IL-9-uttryckande delmängder i det beskrivna sammanhanget är en fullständig karakterisering av typ 2-cytokiner tillsammans med användningen av transkriptionsmarkörer möjlig.

Kvantifiering av IL-9-uttryckande lymfoida celler före dag 5 efter infektion har tidigare rapporterats; Det resulterar dock i mycket låga cellfrekvenser4. Protokollet i denna studie täcker en stor del av N. brasiliensis-infektionskinetiken fram till början av parasitclearance2. Vi märkte dock att några av cellpopulationerna i denna studie inte återvände till basala nivåer inom den analyserade tidsramen, vilket tyder på att studien kan dra nytta av utökade tidpunkter för att få ett fullständigt perspektiv på beteendet hos dessa celler i ett mer avancerat stadium av infektionen in vivo. Oavsett tror vi att arbetet som presenteras här kan fungera som en referensguide för forskare som är intresserade av att studera IL-9-uttryckande lymfoida celler i parasitinfektionsmodeller, så att de kan välja den ideala infektionsfasen för detektion av de specifika celltyperna från vävnader av intresse. Sammantaget kommer de metoder som beskrivs här att vara användbara för att bedöma fenotypen och funktionen hos T-lymfocyter och ILC2-celler som uttrycker IL-9 under en fysiologiskt relevant modell av parasitinfektion, vilket breddar vår kunskap om dessa celler och potentiellt förbättrar vår förståelse av dem vid andra patologiska tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka José Luis Ramos-Balderas för hans tekniska stöd. Detta arbete stöddes av följande bidrag till PLL från CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P och EO-M fick ett stipendium från CONACYT (736162 respektive 481437). MCM-M fick ett stipendium från CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK buffer Homemade
Attune Nxt cytometer Thermofisher
B220 Biolegend 103204
CD11b Biolegend 101204
CD11c  Biolegend 117304
CD19  Biolegend 115504
CD4 Biolegend 100404
CD4 (BV421) Biolegend 100443
CD45.2 Biolegend 109846
CD8  Biolegend 100703
CD90.2 Biolegend 105314
Collagenase D Roche 11088866001
DNAse I Invitrogen 18068015 Specific activity: ≥10 000 units/mg   
Facs ARIA II sorter BD Biosciences
FACS Melody cell sorter BD Biosciences
Fc-Block Biolegend 101320
FcεRI eBioscience 13589885
Fetal bovine serum Gibco 26140079
FlowJo FlowJo Flow cytometry analysis data software
Gr-1 Tonbo 305931
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Homemade
IL-9 biolegend 514103
NK1.1  Biolegend 108704
Nylon mesh  ‎ lba B07HYHHX5V
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Phosphate-buffered saline  Homemade
RPMI Gibco 11875093
Siglec F  Biolegend 155512
Streptavidin Biolegend 405206
TCR-β  Biolegend 109203
TCR-β (PE/Cy7) Biolegend 109222
TCR-γδ  Biolegend 118103
Ter119 Biolegend 116204
Tricine buffer  Homemade
Zombie Aqua Fixable Viability Dye Biolegend 423101

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
  2. Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
  3. Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
  4. Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
  5. Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
  6. Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
  7. Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
  8. Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
  9. Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
  10. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  11. Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
  12. Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
  13. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
  14. old Spring Harbor Protocols. Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
  15. Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
  16. Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
  17. Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
  18. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  19. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  20. Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
  21. Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
  22. Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
  23. Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).

Tags

Immunologi och infektion IL-9 Th9 ILC2 IL-9 lymfoida celler parasit tunntarmen N. brasiliensis
En strategi för studier av IL-9-producerande lymfoida celler i <em>Nippostrongylus brasiliensis-infektionsmodellen</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muñoz-Paleta, O.,… More

Muñoz-Paleta, O., Olguín-Martínez, E., Ruiz-Medina, B. E., Alonso-Quintana, A., Marcial-Medina, M. C., Licona-Limón, P. A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model. J. Vis. Exp. (193), e64075, doi:10.3791/64075 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter