Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Generere en reproduserbar modell av midtsvangerskaps mors immunaktivering ved bruk av poly (I: C) for å studere følsomhet og motstandskraft hos avkom

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64095
Automatic Translation
1, 1
1Center for Neuroscience, UC Davis

Summary

Mors infeksjon er en risikofaktor for nevroutviklingsforstyrrelser. Musemodeller av maternell immunaktivering (MIA) kan belyse infeksjonens innvirkning på hjernens utvikling og funksjon. Her gis generelle retningslinjer og en prosedyre for å produsere pålitelig motstandsdyktig og mottakelig avkom utsatt for MIA.

Abstract

Maternal immunaktivering (MIA) under graviditet er konsekvent knyttet til økt risiko for nevrodevelopmental og nevropsykiatriske lidelser hos avkom. Dyremodeller av MIA brukes til å teste årsakssammenheng, undersøke mekanismer og utvikle diagnostikk og behandling for disse lidelsene. Til tross for deres utbredte bruk, lider mange MIA-modeller av mangel på reproduserbarhet og ignorerer nesten alle to viktige aspekter ved denne risikofaktoren: (i) mange avkom er motstandsdyktige mot MIA, og (ii) mottakelige avkom kan vise forskjellige kombinasjoner av fenotyper. For å øke reproduserbarheten og modellere både følsomhet og motstandskraft mot MIA, brukes baseline immunoreaktivitet (BIR) hos hunnmus før graviditet til å forutsi hvilke graviditeter som vil resultere i enten motstandsdyktige avkom eller avkom med definerte atferdsmessige og molekylære abnormiteter etter eksponering for MIA. Her er det gitt en detaljert metode for å indusere MIA via intraperitoneal (i.p.) injeksjon av dobbeltstrenget RNA (dsRNA) viral etterligne poly (I: C) ved 12,5 dagers svangerskap. Denne metoden induserer en akutt inflammatorisk respons i dammen, noe som resulterer i forstyrrelser i hjernens utvikling hos mus som kartlegger på lignende påvirkede domener i humane psykiatriske og nevrodevelopmental disorders (NDDs).

Introduction

Epidemiologiske bevis knytter mors infeksjon til økt risiko for psykiatriske og NDDs, inkludert schizofreni (SZ) og autismespektrumforstyrrelse (ASD) 1,2,3,4,5,6,7. MIA-musemodellen ble utviklet for å teste kausalitet og den mekanistiske rollen til MIA i etiologien til disse lidelsene, samt å identifisere molekylære biomarkører og utvikle både diagnostiske og terapeutiske verktøy 4,6. Til tross for nytten av denne modellen og dens økende popularitet, er det betydelig variasjon i MIA induksjonsprotokoller innen feltet, noe som gjør det vanskelig å sammenligne resultater på tvers av studier og replikere funn 8,9. I tillegg undersøker de fleste iterasjoner av modellen ikke to viktige translasjonsaspekter ved MIA: (i) mange avkom er motstandsdyktige mot MIA, og (ii) mottakelige avkom kan vise forskjellige kombinasjoner av fenotyper8.

For å generere en reproduserbar MIA-modell, bør etterforskere rapportere minst ett kvantitativt mål på størrelsen på MIA indusert i dammer. For å indusere MIA under svangerskapet, utfører laboratoriet vårt intraperitoneale (i.p.) injeksjoner av dobbeltstrenget RNA-viral etterligner polyinositisk: polycytidilsyre [poly (I: C)]. Poly (I: C) induserer en immunkaskade som ligner på influensavirus som den gjenkjennes av tolllignende reseptor 3 (TLR3) 10. Som et resultat aktiverer poly (I: C) den akutte faseresponsen som resulterer i rask forhøyning av proinflammatoriske cytokiner 8,11,12. Tidligere studier har vist at forhøyning av proinflammatoriske cytokiner, inkludert interleukin-6 (IL-6), er nødvendig for å produsere atferdsavvik og nevropatologi hos avkom som følge av MIA11,12,13. Dermed er nivået av IL-6 i mors serum samlet under sin topp ved 2,5 timer etter poly (I: C) injeksjon et overbevisende kvantitativt mål for MIA som kan brukes til å sammenligne resultater på tvers av laboratorier innen feltet.

For å generere en MIA-modell som adresserer de translasjonelt essensielle elementene i resiliens og følsomhet med en enkelt induksjonsprotokoll 8,14, kan forskere kombinere typiske induksjonstilnærminger med karakterisering av dammens baseline immunoreaktivitet (BIR) før graviditet8. Nylig ble det oppdaget at jomfru kvinnelige C57BL/6 mus viser et bredt spekter av IL-6 responser på en lavdose eksponering for poly (I: C) før graviditet8. Det er bare en undergruppe av disse hunnene som fortsetter å produsere mottakelige avkom, og bare ved visse størrelser av immunaktivering som diktert av kombinasjonen av BIR og poly (I: C) dose8. MIA induserer fenotyper i et omvendt U-mønster; Avkom viser de største atferdsmessige og molekylære avvikene når dammer er moderat immunoreaktive, og størrelsen på mors betennelse når, men ikke overskrider, et kritisk område8. Her er det gitt en detaljert metode for hvordan man på en pålitelig måte kan skape både elastiske og mottakelige avkom med divergerende atferdsfenotyper som følge av injeksjon av poly (I: C) midt i svangerskapet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protokoller utføres under godkjenning av University of California-Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Dyr forberedelse

  1. Når du anskaffer dyr, må du holde følgende parametere konsistente for å sikre maksimal reproduserbarhet.
    1. Leverandør- og leverandørplassering: som tidligere rapportert, viser villtype C57BL/6J-mus forskjellige responser på samme dose poly (I: C) avhengig av leverandøren8. Velg en leverandør og musestamme som viser en konsekvent respons. For forsøkene her viste C57BL/6-mus hentet fra Charles konsistente endringer i atferd etter eksponering for mid-gestational MIA, mens de som ble kjøpt fra Taconic viser en større størrelsesrespons, med noen forskjeller på tvers av behandlingsgrupper sammenlignet med Charles-mus8.
    2. Stamme: C57BL / 6J-mus er de mest brukte, men BTBR-mus og andre stammer viser differensielle responser på MIA9 midt i svangerskapet. Legg merke til disse differensielle responsene, da disse forbedrer reproduserbarheten av metoden og kan være en potensiell variabel for å bidra til differensielle utfall hos avkom.
    3. For å sikre minimal variasjon, bruk bare jomfruhunner for MIA-studier8 og noter tydelig detaljer i metoder.
    4. Alder ved frakt og akklimatiseringsperiode: mus sendt før 7 uker viser dysregulerte endokrine systemer15. La dyrene akklimatisere seg i minimum 48 timer16,17. Bestill mus som skal sendes etter 7 uker (± 2 dager) og injiser for BIR ved 8 uker (± 2 dager).
    5. Alder ved parring: Dyrs immunsystem er dynamisk over levetiden. Pass på å minimere variasjonen ved å holde alder ved parring/injeksjon så konsistent som mulig18,19,20. Mate kvinnelige mus på 9 uker (± 2 dager). Ikke bruk hanner over 6 måneder til parring.

2. Poly (I: C) mye testing og forberedelse

  1. Forbered poly med høy molekylvekt (I: C) som beskrevet nedenfor.
    1. Autoklav 1,5 ml mikrosentrifugerør for oppbevaring. Resuspendert poly (I:C) kan lagres ved -20 °C, men gjentatte frysetininger kan påvirke styrken. Varmtvannsbad til 70 °C.
    2. Bruk steril teknikk, tilsett 10 ml sterilt fysiologisk saltvann (NaCl 0,9%) til lyofilisert poly (I: C) ved hjelp av en sprøyte. Varm opp i 70 °C vannbad i 15 minutter for full glødning. Fjern og la avkjøles til romtemperatur.
    3. I en steril hette, tilsett ytterligere 40 ml fysiologisk saltvann til flasken og vend opp ned flere ganger for å blande. Fjern toppen av poly(I:C)-flasken eller bruk en sprøyte til å alikote i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Oppbevares ved -20 °C.
  2. Forbered blandet molekylvekt poly (I: C) som beskrevet nedenfor.
    1. Autoklav 1,5 ml mikrosentrifugerør for oppbevaring. Resuspendert poly (I:C) kan lagres ved -20 °C, men gjentatte frysetininger kan påvirke styrken. Sett vannbadet på 50 °C.
    2. Bruk steril teknikk, tilsett 10 ml steril 0,9% NaCl til lyofilisert poly (I: C) og fest lokket. Varm opp i 50 °C vannbad i 25 minutter for full glødning. Fjern og la avkjøles til romtemperatur.
    3. Ved steril teknikk, alikot i 1,5 ml mikrosentrifuge rør og lagre ved -20 ° C.
  3. Administrer poly (I: C) gjennom intraperitoneale (i.p.) injeksjoner som beskrevet nedenfor.
    1. Vei musen for å bestemme nøyaktig dosering. Bruk en 0,5 cc insulinnål, trekk opp resuspendert poly (I: C). Skrubb musen og snu slik at magen blir eksponert.
    2. Bruk den andre hånden til en dybde på ca. 0,5 cm mellom de to fremre brystvortene i en vinkel på ca. 45°.
    3. Trekk opp for å fastslå at det ikke kommer blod eller urin inn i sprøyten før injisering. Hvis en av disse oppstår, plasser kanylen på nytt og prøv igjen. Injiser langsomt. Hvis poly (I:C) bobler ut, var injeksjonen sannsynligvis subkutant. En vellykket plassering av injeksjonen vil føre til at ingenting trekkes opp når nålen er satt inn, og ingen lekkasje når den er fjernet.
  4. Test MMW poly (I: C) mye styrke som beskrevet nedenfor8.
    1. Oppnå ønsket form for poly (I: C). Noen produsenter vil tillate forskere å holde på et helt eller delvis parti mens styrken testes, slik at flere flasker kan fås senere samtidig. Vanligvis kan disse oppbevares lyofilisert ved -20 °C i flere år hvis fryse-tining unngås.
    2. Skaff eller avl 30 drektige dammer for testing. Ved E12.5, utfør i.p. injeksjoner på 20, 30 og 40 mg / kg i minst 10 mus per dose.
    3. Ved 2,5 timer etter injeksjon, samle blod via haleblødning. Vær oppmerksom på at perifert blod og trunkblod kan variere i cytokinnivåer, så hold innsamlingsmetoden konsistent i en studie.
    4. La blodet koagulere over natten ved romtemperatur. Etter 12-24 timer, spinn ned blodprøver ved 3,768 x g ved 4 ° C i 8 minutter. Samle serum og oppbevar ved -80 °C til analyse.
    5. Isoler serum og mål IL-6 nivåer via ELISA eller Luminex. Hold måleverktøyene konsistente, da det er betydelig variasjon i den totale konsentrasjonen målt med forskjellige modaliteter og produsenter. Bestem størrelsen på IL-6-responsen som trengs for å indusere fenotyper ved hjelp av en pilotkohort.

3. Baseline immunoreaktivitet (BIR) testing

MERK: Figur 1 viser skjematisk av trinnene. Bruk en annen molekylvekt poly (I: C) for BIR-testing sammenlignet med svangerskap for å redusere sannsynligheten for adaptive immunresponser på forbindelsen.

  1. Bestill jomfruhunnmus som skal sendes når de er 7 uker gamle. Ved ankomst grupperer og huser du fire til fem mus i et bur og holder gruppen innlosjert til de er parret. Bruk ørehakk eller et annet identifikasjonssystem.
  2. Injiser kvinner intraperitonealt med 5 mg / kg poly (I: C) 1 uke etter ankomst. Ved 2,5 timer etter injeksjon, når sirkulerende IL-6 er høyest6, samles fullblod fra injiserte dyr via halesnipp.
  3. La blodet koagulere over natten ved romtemperatur. Etter 12-24 timer, spinn ned blodprøver ved 3,768 x g ved 4 ° C i 8 minutter.
  4. Samle minimum 32 μL serum fra hver prøve. Frys ved -80 °C til du er klar til å teste for cytokiner. For å måle IL-6 nivåer mest konsekvent, bruk en multiplex analyse som Luminex. Hold måleverktøyene konsistente, da det er betydelig variasjon i den totale konsentrasjonen målt med forskjellige modaliteter og produsenter.
    1. For Luminex analyseprotokoll, se Bruce et al.21.
  5. Ved hjelp av relative IL-6-nivåer deler du dyrene inn i lave (nederste kvartil), middels (to midterste kvartiler) og høye (høyeste kvartil) BIR-grupper.

4. Tail bleed metode for blodoppsamling

MERK: For å unngå bruk av potensielt immunmodulerende beroligende midler, bruk haleblødningsmetoden for blodoppsamling.

  1. For å sette opp, plasser et loddestativ og fastholdelseskopp på en overflate på siden av den ikke-dominerende hånden. I en 35 mm petriskål, tilsett 1-2 ml spiselig olje av matkvalitet. Fjern hetten fra den raske blodproppen og plasser den i nærheten av oppsettet.
  2. Legg noen lag papirhåndkle på loddestativet og det første kapillærrøret i et klips, plasser det nær der musens halespiss skal holdes og holdes parallelt med bordets overflate. Ha et barberblad tilgjengelig.
  3. For å samle blodet, utfør følgende trinn.
    1. På ønsket tid, fjern musen fra buret og legg under koppen med halen som kommer ut av hakk ved basen. Bruk et nytt barberblad, klipp helt enden (1-2 mm) av halen og samle den første bloddråpen i kapillærrøret festet til loddestativet.
    2. Dypp fingrene med dominerende hånd i den spiselige oljen og bruk til å klemme fra bunnen av halen til spissen, og led halespissen til kapillærrøret for å samle resulterende bloddråper. Fortsett til ~200 μL blod er samlet.
    3. Sett en liten endehette på den koniske enden av kapillærrøret før topphetten. Hvis topphetten settes på først, vil prøven bli utvist fra den koniske enden av røret. Sett rør i beskyttende ytre skall.
    4. La koagulere over natten ved romtemperatur. Avkjøl en mikrosentrifuge til 4 °C og spinn ned blodet som angitt i trinn 3.3.

Figure 1
Figur 1. Tidslinjen for testing av jomfruhunners baseline immunoreaktivitet og parring. Bestill mus til å ankomme ved 7 ukers alder og la akklimatisere seg til anlegget i 1 uke. Injiser dyr med 5 mg/kg poly(I:C) og 2,5 timer trekker senere blod. La blodet koagulere over natten, deretter sentrifugere ved 3 768 x g, 4 °C i 8 minutter. Samle serum og vurdere relative IL-6 nivåer via ELISA eller Multiplex. Ved 9 uker gammel, sett opp parringspar. Opprettet ved hjelp av BioRender.com Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Vektbasert metode for parring og svangerskapsinjeksjon E12.5

MERK: Figur 2 viser skjematisk av trinnene. To metoder kan brukes til å sette opp parringspar og bestemme E12.5-tidspunktet. Den første, tidsparring, er beskrevet andre steder22. Vektbaserte beregninger kan også brukes til å vurdere for en E12.5 graviditet23. Fordelen med denne tilnærmingen er at den tillater tidslåsing av dammens alder ved parring, noe som reduserer variasjonen i immunresponsen. Denne prosedyren brukes her.

  1. Plasser hannene i rene bur og la dem akklimatisere seg i minst 2 timer. Dette reduserer sannsynligheten for kvinnelig aggresjon, da menn allerede vil danne en dominerende duft i buret.
  2. Sett opp single hann, single kvinnelige avlspar ved å legge hunnen til hannens bur. Før du plasserer henne i buret, veier du henne og registrerer vekten. Legg til en liten håndfull solsikkefrø til hvert bur for å øke parringseffektiviteten.
  3. For å bestemme vektøkningsområdet, utfør følgende trinn.
    1. Få en testgruppe av kvinner og sett opp parringspar, og registrer vekt på tidspunktet for parring.
    2. Når kvinner begynner å virke synlig gravide, veier de dem og deler seg i delmengder på 8,5 g, 9,5 g, 10,5 g og 11,5 g vektøkning. Fostrene på E12.5 har så vidt begynt å utvikle tydelige sifre i potene. Bruk fostermorfologi for å bestemme gjennomsnittlig vektøkning for å nå E12.5.
  4. På 12 dager etter parring, veie kvinner og bestemme vektøkning. I et testanlegg får hunnene konsekvent 9,5-10,5 g fra parring til E12,5. Injiser via i.p. dosen av oppløselig poly (I: C) bestemt i trinn 2.3.2 når kvinnens vektøkning faller innenfor det forhåndsbestemte området.
  5. Observer responsen på MIA i dammer ved hjelp av følgende parametere.
    1. Sykdomsatferd: Samle subjektive skårer på en skala fra 1-3 for hvordan aktive dammer blir som respons på å bli håndtert, hvor 1 er liten eller ingen bevegelse som respons på å bli håndtert og 3 er en normal respons på fangst og tilbakeholdenhet. Dyr med større immunrespons vil vise mindre motstand mot håndtering8.
    2. Febril respons: Bruk et IR-termometer til å samle inn temperaturer før injeksjon og 2,5 timer etter injeksjon. Dyr med større immunrespons viser ofte hypotermi som respons på større immunaktivitet8.
    3. Vektendring: Vei dyrene 24 timer etter injeksjon. Dyr med større styrke immunresponser mister generelt mer vekt8.
    4. Mål svangerskaps IL-6 nivåer som følger:8.
      1. Ved 2,5 timer etter injeksjon, samle blod med den foretrukne metoden. La blodet koagulere over natten ved romtemperatur. Etter 12-24 timer, spinn ned blodprøver ved 3,768 x g ved 4 ° C i 8 minutter.
      2. Samle serum og oppbevar ved -80 °C til analyse. Isoler serum og mål IL-6 nivåer via ELISA eller Luminex. Hold måleverktøyene konsistente, da det er betydelig variasjon i den totale konsentrasjonen målt med forskjellige modaliteter og produsenter.
      3. Hus demningen enkeltvis etter injeksjon med passende anrikning som reir og anrikningsanordninger. Hold all berikelse konsekvent da endringer i berikelse kan ha betydelig innvirkning på gnageradferd 24,25,26,27,28,29.
  6. Drektighetstid for C57-mus varierer fra 18,5-20,5 dager. Utfør søppelkontroller for å avgjøre om dyr ble født innenfor dette området for å sikre at injeksjonen ble utført på riktig tidspunkt. Når du sjekker for kull, forstyrr buret så lite som mulig. Stress umiddelbart etter at kullet er født kan øke risikoen for kannibalisering.

Figure 2
Figur 2. MIA induksjon. MIA induksjon krever vurdering av graviditet, i.p. injeksjon av poly (I:C), og kullkontroll for å sikre riktig tidspunkt for mors betennelse. Etter å ha vurdert svangerskapsdagen enten via tidsbestemt parring eller vektøkningsmetoden, leverer du en i.p. injeksjon av poly (I: C) ved E12.5. Ta en blodprøve 2,5 timer etter injeksjon for å bekrefte immunaktivering og bestemme nivået av IL-6-aktivering. Kull vil bli født på ca E18.5-E20.5. Opprettet ved hjelp av BioRender.com Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Undersøkelse av endringer i atferd hos voksne MIA og kontrollavkom (valgfritt)

  1. Fra P60 og før du utfører atferdstester, akklimatiserer dyr til menneskelig kontakt med skånsom håndtering i 1 min om dagen i 3 påfølgende dager. Pass på at dager med burskifte ikke skjer samme dag som atferdstester utføres.
  2. La musene akklimatisere seg til testrommet i 30-60 minutter før du starter atferdstester. Bruk svakt opplyste (15-20 lux) rom for å minimere angst.
  3. For repeterende pelsstell, plasser mus alene i rene, sengetøyfrie bur med lokk. Bruk et kamera til å filme musene i disse burene i 20 minutter. De første 10 min fungerer som en akklimatiseringsperiode, de siste 10 min er testperioden.
  4. Ved hjelp av lagrede videoer og en stoppeklokke, score kumulativ pleietid for hver mus i løpet av 10 min testperiode. Andre atferder som kan scores fra disse videoene inkluderer oppdrett (stående på bakben), frysing og hopping8.
  5. Bruk andre vanlige tester for MIA-modellen som prepulsinhibering (PPI) 14,30,31,32, åpent felt12,33,34, 3-kammer sosial tilnærming 13,35,36, ny objektgjenkjenning 37, y-labyrint 30, forhøyet pluss labyrint33 og kontekst/cued fryktkondisjonering 38.
  6. Postnatal immunoblotting8 (valgfritt)
    1. Ved P0 halshugges raskt og dissekere fosterets hjernevev i HBSS, fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved −80 °C.
    2. Forstyrr prøver ved hjelp av en sonde sonde sonde med en amplitude på 20% i 5 s i 2x Laemmli buffer, deretter denaturere ved 85 ° C i 5 minutter. Sentrifugelysat ved 16 000 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Oppsamling supernatant og oppbevares ved -80 °C.
    3. Mål totalt proteininnhold ved hjelp av et kommersielt BCA-proteinanalysesett, etter produsentens instruksjoner, og bruk bovint serumalbumin som kalibreringsstandard.
    4. Tilsett dithiothreitol som reduksjonsmiddel til prøvene som en endelig konsentrasjon på 100 mM. Varm opp til 85 °C i 2 minutter før du legger på en gel.
    5. Kjør 5 μg / bane protein under reduserende forhold på 7,5% TGS geler og overfør elektroforetisk til PVDF-membraner. Blokker membraner med blokkerende buffer og inkuber med utvalgte antistoffer.
    6. Vask tre ganger med TBS + 0,05% Tween 20 og inkuber membraner i 45 min med fluorescerende merkede sekundære antistoffer.
    7. Vask ytterligere fire ganger i TBS/Tween 20 og bilderesultater. Standardiser resultatene ved bruk av β-tubulin, oppdaget ved bruk av anti-β-tubulin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ikke alle dyr utsatt for 30 mg/kg poly(I:C) ved E12.5 produserer avkom med konsistente atferdsavvik 8,31. Selv om både 30 mg / kg og 40 mg / kg poly (I: C) pålitelig produserer sykdomsadferd hos dammer, inkludert redusert aktivitetsnivå, hypoterm respons og vekttap, og også forårsaker signifikante forhøyninger i IL-6, vil bare en delmengde av kull utsatt for MIA fortsette å utvikle atferdsavvik i domener som ligner de som er observert hos humane psykiatriske og NDDs (figur 3A-C) 8 . En lavere dose på 20 mg / kg poly (I: C) induserer også sykdomsadferd og vekttap, men i motsetning til høyere doser produserer det ikke konsekvent IL-6-responser som er høye nok i størrelse til å indusere atferdsavvik hos avkom, selv om IL-6-responsene er forhøyet godt over de fra dammer injisert med saltvann (figur 3D) 8.

Figure 3
Figur 3. Ulike doser poly (I: C) fører til differensielle effekter i dammer. (A) Dammer eksponert for 20 mg/kg, 30 mg/kg eller 40 mg/kg poly (I:C) opplevde redusert aktivitet i en subjektiv skala (enveis ANOVA; P < 0,0001). (B) Dammer eksponert bare for 30 mg/kg poly (I:C) viste signifikant endret temperatur i form av en hypoterm respons (enveis ANOVA; F3,35 = 4,289, P < 0,05). (C) Både 30 mg/kg poly (I:C) og 40 mg/kg poly (I:C) induserte signifikant vekttap (enveis ANOVA; F7,187 = 26,93, P < 0,0001) og (D) viste forhøyede IL-6-nivåer over terskelen som kreves for å indusere atferdsendringer (enveis ANOVA; F3,35 = 25,54, P < 0,0001). (E) Baseline immunoreaktivitet hos isogene kvinnelige C57BL/6J-dyr er svært variabel, og kategorisering av kvinnelige BIR i lave, middels og høye grupper gjør det mulig for forskere å forutsi hvilke avkom som mest sannsynlig vil være utsatt for virkningen av MIA. Barer representerer gjennomsnittlig ± SEM. Denne figuren er modifisert fra Estes et al.8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Uventet viser jomfruelige hunner C57BL/6-mus ganske variabel baseline immunoreaktivitet (BIR) til en lav dose poly(I:C) (5 mg/kg poly(I:C)) før graviditet, selv om de er isogene, og denne variasjonen er ikke forbundet med vekt (figur 3E, tilleggsfigur 1)8. Dammer injisert med 5 mg / kg poly (I: C) før graviditet hvis IL-6-respons er i midten 50% (middels BIR-dammer) produserer voksne mannlige avkom med endringer i STAT3, MEF2 og tyrosinhydroksylaseproteinnivåer i P0 striatalvev (figur 4C-E) 8. Mannlige avkom av medium BIR-dammer eksponert for 30 mg/kg poly (I:C) viser også redusert synapsetetthet og forhøyet hovedhistokompatibilitetskompleks I (MHCI) i dissosiert nevronkultur (figur 4A,B)8. Dammer injisert med 5 mg / kg poly (I: C) før graviditet hvis IL-6-respons er i midten 50% (middels BIR dammer) produserer pålitelig voksne mannlige avkom med forhøyet repeterende atferd og redusert utforskende atferd når de utsettes for 30 mg / kg poly (I: C) ved E12.5 (figur 5A-F) 8.

Omvendt produserer mus fra den høye BIR-gruppen (med IL-6-nivåer i de øverste 25% når de blir utsatt for 5 mg / kg poly (I: C) før graviditet) pålitelig avkom uten repeterende atferdsendringer etter MIA. Imidlertid viser mannlige avkom av disse høye BIR-dammene forhøyet eksplorativ atferd etter MIA (figur 5D) 8. Sammen indikerer disse resultatene at MIA kan forårsake differensielle utfall hos avkom, avhengig av dammens BIR8.

Figure 4
Figur 4. En mellomdose poly(I:C) og BIR gir størst utfall i MIA-modeller. (A) Kortikale nevroner fra avkom eksponert for maternell immunaktivering midt i svangerskapet viste signifikant økt MHCI-presentasjon bare når dammer ble gitt 30 mg / kg poly (I: C) (enveis ANOVA; F3,19 = 5,156, P < 0,01). (B) Derimot resulterte alle doser (20 mg/kg, 30 mg/kg og 40 mg/kg) i signifikant redusert synapsetetthet i dissosiert nevronkultur (enveis ANOVA; F3,43 = 11,01, P < 0,0001). (VG Nett) P0 striatale vestlige flekker viser forhøyet STAT3, MEF2A og TH, kun hos dyr hvis mødre hadde middels BIR og ble eksponert for 30 mg/kg poly(I:C) (One-way ANOVA; MEF2A: F3,24 = 3,968, P < 0,05; STAT3: F3,24 = 6,401, P < 0,01; TH: F3,24 = 3,668, P < 0,05). Barer representerer gjennomsnittlig ± SEM. Denne figuren er modifisert fra Estes et al.8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Mottakelige dyr i gruppene medium BIR 30 mg/kg og høy BIR 30 mg/kg kan ikke bare sammenlignes med kontroller, men også med motstandsdyktige dyr. Injeksjon av medium BIR-dammer med en enda høyere dose på 40 mg/kg poly (I:C) produserer avkom uten signifikante endringer i atferd identifisert ved hjelp av analysene som hittil er brukt (figur 5A-F)8. Dette antyder et omvendt U-forhold mellom immunaktivering og følsomhet for MIA.

Figure 5
Figur 5. Mannlige avkom fra dammer utsatt for en mellomdose poly (I: C) viser de største endringene i atferd. (VG Nett) Mannlige avkom fra dammer utsatt for 30 mg / kg poly (I: C) (Nestet enveis ANOVA; F3,27 = 8,775; Lav: P = 0,0427; Middels: P = 0,0062; Høy: (P = 0,9568), men ikke 20 mg/kg eller 40 mg/kg poly(I:C) viser endringer i repeterende pelsstell og utforskende oppdragelsesatferd. I tillegg viser dyr i behandlingsgruppen 30 mg/kg poly(I:C) ulike former for mottakelighet, og mannlige avkom av middels BIR-mødre viser økt repeterende atferd og redusert utforskning, mens mannlige avkom av mødre med høy BIR ikke viser noen endring i repeterende atferd, men hadde økt utforskende atferd (A,D ; Nestet enveis ANOVA; F3,15 = 9,407, Lav: P = 0,4910; Middels: P < 0,001; Høy: P = 0,0117). Avkom utsatt for 20 mg / kg poly (I: C) syntes ikke å møte terskelen for immunaktivering som kreves for å endre nevronutvikling, siden de ikke viste noen endringer i atferdene som ble testet, mens avkom utsatt for 40 mg / kg poly (I: C) også var mest motstandsdyktige mot effektene (B, C, E, F). Barer representerer gjennomsnittlig ± SEM. Denne figuren er modifisert fra Estes et al.8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1. Baseline immunoreaktivitet er ikke korrelert med dyrevekt. Jomfruelige hunnmus viser et stort utvalg av IL-6-responser på 5 mg/kg Poly(I:C) injisert før graviditet på en vektuavhengig måte, R2 = 0,0086, P = 0,9. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mors infeksjon endrer løpet av hjernens utvikling hos mennesker og hos både gnagere og ikke-menneskelige primater 4,5,7. Her skisseres en prosedyre for å indusere MIA hos mus ved et midtsvangerskapstidspunkt ved bruk av poly (I: C). Denne metoden inkorporerer vurdering av BIR før graviditet, noe som øker reproduserbarheten og gir muligheten til mekanistisk å undersøke mekanismer som fører til motstandskraft og følsomhet hos avkom for MIA8. Etter MIA genererer dammer fra den mellomstore BIR-gruppen (med IL-6-nivåer i midten 50%) pålitelig voksne avkom med endringer i repeterende atferd, endringer i MHCI-nivåer på nevroner fra nyfødte avkom som bestemt av immunocytokjemi og forhøyede nivåer av striataltyrosinhydroksylase, MEF2 og STAT3-protein fra nyfødte avkom som bestemt av Western blot8.

Bruken av MIA som miljømodell gir økt translasjonsrelevans ettersom den oppfyller kriteriene for en sykdomsmodell: construct, face og predictive validity7. Men som med enhver miljømodell, må det utvises stor forsiktighet for å minimere eksterne variabler. Mange faktorer som leverandør, poly (I: C) mye, tidspunkt for injeksjon, alder av dammer, og til og med caging systemet kan endre virkningen av MIA på avkom 8,9,39. Som tidligere rapportert, er styrken av poly (I: C) inkonsekvent mellom produsenter, partier og til og med flasker i mye på grunn av høy variasjon i dsRNA-konsentrasjonene og molekylvektene 8,40. Fordi denne variabiliteten kan øke heterogeniteten i mors immunrespons, er det avgjørende at laboratorier bestemmer den effektive dosen for hvert parti for å opprettholde maksimal reproduserbarhet i observerbare fenotyper. For eksempel har det blitt bemerket at Charles-mus utsatt for MIA produserer konsistente BIR og doseavhengige fenotyper hos avkom, og mus fra Taconic kan også påvirkes på lignende måte med noen forskjeller på tvers av behandlingsgrupper8. I tillegg er det viktig at forskere standardiserer oppdrettspraksis og holder detaljerte poster for å øke reproduserbarheten av modellen. Publikasjonen forfattet av Kentner et al. skisserte de mange detaljene som bør inkluderes i eksperimentelle rapporter og kan også fungere som en sjekkliste for forskere når de fullfører sine protokoller9.

BIR er vurdert ved hjelp av relative serum interleukin-6 (IL-6) nivåer fra jomfruelige hunnmus. Å dele disse musene inn i tre grupper (lav, middels og høy) avslører reproduserbare elastiske og mottakelige modeller8. Fordi BIR er et spørsmål om relativ konsentrasjon av IL-6, er det ikke avgjørende å grundig teste poly (I: C) potens med høy molekylvekt som er nødvendig med blandet molekylvekt poly (I: C) som brukes til å indusere mors immunaktivering under svangerskapet. BIR er et relativt nytt tiltak som kanskje ikke reduserer alle variable resultater.

Immunresponsene til dammer under deres første eksponering for svangerskapsdoser av poly (I: C) kan avvike fra deres respons under påfølgende graviditeter og eksponeringer. For dette formål reduserer bruk av jomfruhunner potensialet for variabilitet som endringer i immunrespons som følge av flere graviditeter kan presentere. Den vektbaserte metoden for estimering av graviditetstidspunkt er nødvendig fordi mus ofte ikke blir gravid innen de første 24 timene etter parring.

Det er viktig å merke seg at det er statistiske utfordringer med denne modellen. Fordi MIA induseres i dammene, kan ikke avkommet randomiseres til behandlingsbetingelser. Dermed må hvert kull betraktes som en n på 1 9,41,42, og individer innenfor det kullet bør gjennomsnittes for å opprette hvert datapunkt. Det mest hensiktsmessige statistiske designet for disse dataene benytter derfor nestede analyser8. Minst seks kull per gruppe (BIR x dose) er nødvendig for pålitelig å oppdage endringer i atferdsmessige og molekylære mål. Signifikante kjønnsforskjeller er påpekt i stor utstrekning i MIA-litteraturen, og kjønn bør derfor aldri slås sammen i analyser 8,9,43,44.

BIR er et relativt nytt prediktivt verktøy, og det er ennå ikke definert med tanke på mekanistisk effekt. Det er fortsatt ukjent om BIR er assosiert med spesifikke svangerskapsimmunresponser, men IL-6-responsen hos mus før graviditet er ikke ekvivalent med deres respons under graviditet8. BIR representerer derfor et korrelativt prediktivt mål, og mer forskning pågår for å bestemme opprinnelsen.

Til tross for variasjonen som ligger i MIA-modellen, kan ingen annen miljømodell for nevropsykiatriske lidelser og NDDs til dags dato gi samme nivå av translasjonsrelevans. Forberedelser og omfattende pilottesting er nødvendig for å produsere konsistens i MIA-modellen, men robustheten til fenotypiske resultater gjør opp for denne første investeringen. Til syvende og sist tilbyr MIA dyremodeller uovertruffen potensial for å undersøke en enkelt risikofaktor som skaper divergerende og distinkte klynger av atferdsmessige og molekylære endringer i avkom, som ligner de som er observert i menneskelige populasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Myka Estes for hennes utholdenhet i å adressere variasjon i muse-MIA-modellen og alle bidragsyterne i Estes et al.8 for deres arbeid som førte til utviklingen av metodeprotokollen beskrevet her. Forskningen rapportert her ble støttet av NIMH 2P50 MH106438-06 (AKM) og NIMH T32MH112507 (K.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% NaCl physiological endotoxin free saline Sigma-Aldrich 7647-14-5 Control and vehicle for Poly(I:C)
35mm petri dish Thomas Scientific 1219Z45 Used to hold oil during tail bleed
7.5% TGX gels Bio-rad 4561084 Optional
Ancare Nestlets Fisher Scientific NC9365966 Optional
anti-β-tubulin Millipore MAB3408 Optional
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I Bio-rad 171I50001
Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate Bio-rad 171304070M
Bovine Serum Albumin ThermoFisher 23209 Optional
Centrifuge Eppendorf 5810R Optional
Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle Spectrum 552-58457-083
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779-10G Optional
Environmental enrichment Bio-serv K3327 and K3322 Optional
Ethovision Noldus Ethovision Optional
Fluorsecent-tagged seondary ntibodies Li-cor 925-32213 and 925-68072 Optional
Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed) Various vendors Use to lubricate tail during tail bleeds
HBSS ThermoFisher 14060040 Optional
High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Invivogen #tlrl-pic-5 Used to establish females' BIR
Humane Mouse Restrainer AIMS 1000 Used to restrain mouse during tail bleeds
Image Studio Software Licor 5.2 Optional
Laemmli buffer Bio-rad 1610737EDU Optional
Luminex200 ThermoFisher APX10031
Microvette CB300 300μl Serum capillary tube Sarstedt 16.440.100
Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Sigma-Aldrich #P0913 Gestational induction of MIA
monoclonal anti-MEF2A AbCam ab76063 Optional
monoclonal anti-STAT3 Cell signaling 12640S Optional
Observer Noldus Observer Optional
Odyssey blocking buffer (TBS) Li-cor 927-50003 Optional
Odyssey CLx imaging system Li-cor 9140 Optional
Omnipure PBS Millipore 65054L Optional
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23227 Optional
polyclonal anti_TH Pel-Freez P4101-150 Optional
PVDF membrane Bio-rad 162-0177 Optional
Qsonica Sonicator Q500 Fisher Scientific 15-338-282 Optional
Quick blood stopper Petco 17140
Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile USA Scientific 1615-5500
Soldering stand Amazon B08Y12QC73 Used to hold capillary tube during tail bleeds
Sunflower seeds Bio-serv S5137-1 Use to increase breeding efficiency
The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set, Bio-rad 171G5007M
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Optional
Tween 20 Bio-rad 23209 Optional

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adams, W., Kendell, R. E., Hare, E. H., Munk-Jørgensen, P. Epidemiological evidence that maternal influenza contributes to the aetiology of schizophrenia. An analysis of Scottish, English, and Danish data. The British Journal of Psychiatry: The Journal of Mental Science. 163 (4), 522-534 (1993).
  2. Brown, A. S., et al. Serologic evidence of prenatal influenza in the etiology of schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 61 (8), 774-780 (2004).
  3. Brown, A. S., Derkits, E. J. Prenatal infection and schizophrenia: a review of epidemiologic and translational studies. The American Journal of Psychiatry. 167 (3), 261-280 (2010).
  4. Patterson, P. H. Immune involvement in schizophrenia and autism: etiology, pathology and animal models. Behavioural Brain Research. 204 (2), 313-321 (2009).
  5. Patterson, P. H. Maternal infection and immune involvement in autism. Trends in Molecular Medicine. 17 (7), 389-394 (2011).
  6. Estes, M. L., McAllister, A. K. Immune mediators in the brain and peripheral tissues in autism spectrum disorder. Nature Reviews. Neuroscience. 16 (8), 469-486 (2015).
  7. Estes, M. L., McAllister, A. K. Maternal immune activation: Implications for neuropsychiatric disorders. Science. 353 (6301), 772-777 (2016).
  8. Estes, M. L., et al. Baseline immunoreactivity before pregnancy and poly(I:C) dose combine to dictate susceptibility and resilience of offspring to maternal immune activation. Brain, Behavior and Immunity. 88, 619-630 (2020).
  9. Kentner, A. C., et al. Maternal immune activation: reporting guidelines to improve the rigor, reproducibility, and transparency of the model. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 245-258 (2019).
  10. Zhou, Y., et al. TLR3 activation efficiency by high or low molecular mass poly I:C. Innate Immunity. 19 (2), 184-192 (2013).
  11. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain, Behavior and Immunity. 25 (4), 604-615 (2011).
  12. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  13. Choi, G. B., et al. The maternal interleukin-17a pathway in mice promotes autism-like phenotypes in offspring. Science. 351 (6276), 933-939 (2016).
  14. Meyer, U. Neurodevelopmental resilience and susceptibility to maternal immune activation. Trends in Neurosciences. 42 (11), 793-806 (2019).
  15. Laroche, J., Gasbarro, L., Herman, J. P., Blaustein, J. D. Reduced behavioral response to gonadal hormones in mice shipped during the peripubertal/adolescent period. Endocrinology. 150 (5), 2351-2358 (2009).
  16. Aguila, H. N., Pakes, S. P., Lai, W. C., Lu, Y. S. The effect of transportation stress on splenic natural killer cell activity in C57BL/6J mice. Laboratory Animal Science. 38 (2), 148-151 (1988).
  17. Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. American Journal of Veterinary Research. 43 (9), 1654-1657 (1982).
  18. Menees, K. B., et al. Sex- and age-dependent alterations of splenic immune cell profile and NK cell phenotypes and function in C57BL/6J mice. Immunity & Ageing. 18 (1), 3 (2021).
  19. Shaw, A. C., Goldstein, D. R., Montgomery, R. R. Age-dependent dysregulation of innate immunity. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 875-887 (2013).
  20. Starr, M. E., Saito, M., Evers, B. M., Saito, H. Age-associated increase in Cytokine production during systemic inflammation-II: the role of IL-1beta in age-dependent IL-6 upregulation in adipose tissue. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 70 (12), 1508-1515 (2015).
  21. Bruce, M., et al. Acute peripheral immune activation alters cytokine expression and glial activation in the early postnatal rat brain. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 200 (2019).
  22. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  23. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
  24. Hutchinson, E., Avery, A., VandeWoude, S. Environmental enrichment for laboratory rodents. ILAR Journal. 46 (2), 148-161 (2005).
  25. Bayne, K. Environmental enrichment and mouse models: Current perspectives. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (2), 82-90 (2018).
  26. Toth, L. A., Kregel, K., Leon, L., Musch, T. I. Environmental enrichment of laboratory rodents: the answer depends on the question. Comparative Medicine. 61 (4), 314-321 (2011).
  27. Sparling, J. E., Barbeau, K., Boileau, K., Konkle, A. T. M. Environmental enrichment and its influence on rodent offspring and maternal behaviours, a scoping style review of indices of depression and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 197, 172997 (2020).
  28. Xiao, R., Ali, S., Caligiuri, M. A., Cao, L. Enhancing effects of environmental enrichment on the functions of natural killer cells in mice. Frontiers in Immunology. 12, 695859 (2021).
  29. Girbovan, C., Plamondon, H. Environmental enrichment in female rodents: considerations in the effects on behavior and biochemical markers. Behavioural Brain Research. 253, 178-190 (2013).
  30. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  31. Mueller, F. S., et al. neuroanatomical, and molecular correlates of resilience and susceptibility to maternal immune activation. Molecular Psychiatry. 26 (2), 396-410 (2021).
  32. Nyffeler, M., Meyer, U., Yee, B. K., Feldon, J., Knuesel, I. Maternal immune activation during pregnancy increases limbic GABAA receptor immunoreactivity in the adult offspring: implications for schizophrenia. Neuroscience. 143 (1), 51-62 (2006).
  33. Babri, S., Doosti, M. H., Salari, A. A. Strain-dependent effects of prenatal maternal immune activation on anxiety- and depression-like behaviors in offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 164-176 (2014).
  34. Vigli, D., et al. Maternal immune activation in mice only partially recapitulates the autism spectrum disorders symptomatology. Neuroscience. 445, 109-119 (2020).
  35. Malkova, N. V., Yu, C. Z., Hsiao, E. Y., Moore, M. J., Patterson, P. H. Maternal immune activation yields offspring displaying mouse versions of the three core symptoms of autism. Brain, Behavior, and Immunity. 26 (4), 607-616 (2012).
  36. Shin Yim, Y., et al. Reversing behavioural abnormalities in mice exposed to maternal inflammation. Nature. 549 (7673), 482-487 (2017).
  37. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 930-941 (2010).
  38. Zuckerman, L., Weiner, I. Maternal immune activation leads to behavioral and pharmacological changes in the adult offspring. Journal of Psychiatric Research. 39 (3), 311-323 (2005).
  39. Mueller, F. S., Polesel, M., Richetto, J., Meyer, U., Weber-Stadlbauer, U. Mouse models of maternal immune activation: Mind your caging system. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 643-660 (2018).
  40. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biological Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  41. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neuroscience. 14, 37 (2013).
  42. Spencer, S. J., Meyer, U. Perinatal programming by inflammation. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 1-7 (2017).
  43. Mouihate, A., Kalakh, S. Maternal Interleukin-6 hampers hippocampal neurogenesis in adult rat offspring in a sex-dependent manner. Developmental Neuroscience. 43 (2), 106-115 (2021).
  44. Zhang, Z., van Praag, H. Maternal immune activation differentially impacts mature and adult-born hippocampal neurons in male mice. Brain, Behavior, and Immunity. 45, 60-70 (2015).

Tags

Nevrovitenskap utgave 186
Generere en reproduserbar modell av midtsvangerskaps mors immunaktivering ved bruk av poly (I: C) for å studere følsomhet og motstandskraft hos avkom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prendergast, K., McAllister, A. K.… More

Prendergast, K., McAllister, A. K. Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using Poly(I:C) to Study Susceptibility and Resilience in Offspring. J. Vis. Exp. (186), e64095, doi:10.3791/64095 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter