Combinando o Atuador de Força Magnética 3D e a Imagem de Fluorescência Multifuncional para Estudar a Mecanologia do Núcleo

Miao Huang; Heyang Wang; Alfredo A. Delgado; Tyler A. Reid; Julian Long; Shu Wang; Hayley Sussman; Juan Guan; Hitomi Yamaguchi; Xin Tang

doi:10.3791/64098

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Artigo de método

Combinando o Atuador de Força Magnética 3D e a Imagem de Fluorescência Multifuncional para Estudar a Mecanologia do Núcleo

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DOI:

10.3791/64098

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5 de julho de 2022

Miao Huang¹^,⁵ , Heyang Wang¹^,⁵ , Alfredo A. Delgado¹ , Tyler A. Reid¹ , Julian Long² , Shu Wang³^,⁵ , Hayley Sussman⁴ , Juan Guan⁵^,⁶^,⁷ , Hitomi Yamaguchi¹ , Xin Tang¹^,⁵^,⁸^,⁹

¹Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, ²Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, ³Department of Biostatistics, University of Florida, ⁴Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), ⁵UF Health Cancer Center, University of Florida, ⁶Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, ⁷Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, ⁸J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, ⁹Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta um novo protocolo para aplicar diretamente força mecânica no núcleo celular através de microesferas magnéticas entregues no citoplasma e para realizar imagens fluorescentes simultâneas de células vivas.

Resumo

Uma questão fundamental na mecanobiologia é como as células vivas sentem estímulos mecânicos extracelulares no contexto da fisiologia e patologia celular. Acredita-se que a sensação mecano-celular de estímulos mecânicos extracelulares seja através dos receptores de membrana, do complexo proteico associado e do citoesqueleto. Avanços recentes na mecanobiologia demonstram que o núcleo celular no próprio citoplasma pode sentir independentemente estímulos mecânicos simultaneamente. No entanto, falta uma compreensão mecanicista de como o núcleo celular detecta, transduz e responde a estímulos mecânicos, principalmente por causa dos desafios técnicos no acesso e quantificação da mecânica do núcleo por ferramentas convencionais. Este artigo descreve o projeto, fabricação e implementação de um novo atuador de força magnética que aplica estímulos mecânicos 3D precisos e não invasivos para deformar diretamente o núcleo celular. Usando células modificadas por CRISPR/Cas9, este estudo demonstra que esta ferramenta, combinada com imagens fluorescentes confocais de alta resolução, permite a revelação da dinâmica em tempo real de uma proteína associada ao sim (YAP) mecanósquia em células individuais em função da deformação do núcleo. Este método simples tem o potencial de preencher a lacuna tecnológica atual na comunidade de mecanobiologia e fornecer respostas para a lacuna de conhecimento que existe na relação entre a mecanotransdução do núcleo e a função celular.

Introdução

Este estudo tem como objetivo desenvolver e aplicar uma nova técnica para elucidar a mecanobiologia do núcleo, combinando os atuadores magnéticos que aplicam força mecânica diretamente no núcleo celular e a microscopia de fluorescência confocal que simultaneamente visualiza as alterações estruturais e funcionais subcelulares. As células detectam sinais biofísicos extracelulares, incluindo rigidez tecidual 1,2,3,4, pressão do fluido intersticial e tensão de cisalhamento 5,6,7, topologia/geometria da superfície