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In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

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DOI:

10.3791/64104

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6 de julho de 2022

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1Department of Cellular Neurobiology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

Neste artigo

Resumo

Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

Resumo

A microglia, as únicas células imunes residentes no cérebro, participa ativamente na manutenção do circuito neural, modificando as sinapses e a excitabilidade neuronal. Estudos recentes têm revelado a expressão gênica diferencial e a heterogeneidade funcional da micróglia em diferentes regiões cerebrais. As funções únicas da rede neural hipocampal na aprendizagem e memória podem estar associadas aos papéis ativos da microglia no remodelamento das sinapses. No entanto, as respostas inflamatórias induzidas por procedimentos cirúrgicos têm sido problemáticas na análise microscópica de dois fótons da microglia hipocampal. Aqui é apresentado um método que permite a observação crônica da microglia em todas as camadas do CA1 hipocampal através de uma janela de imagem. Este método permite a análise de alterações morfológicas em processos microgliais por mais de 1 mês. Imagens de longo prazo e de alta resolução da micróglia em repouso requerem procedimentos cirúrgicos minimamente invasivos, seleção objetiva apropriada de lentes e técnicas de imagem otimizadas. A resposta inflamatória transitória da micróglia hipocampal pode impedir a obtenção de imagens imediatamente após a cirurgia, mas a micróglia restaura sua morfologia quiescente dentro de algumas semanas. Além disso, a imagem de neurônios simultaneamente com a micróglia nos permite analisar as interações de múltiplos tipos celulares no hipocampo. Esta técnica pode fornecer informações essenciais sobre a função microglial no hipocampo.

Introdução

Microglia são as únicas células imunes e macrófagos de tecido residentes no cérebro. Além de suas funções como células imunes, como resposta rápida à inflamação, elas têm demonstrado desempenhar uma variedade de papéis fisiológicos na manutenção e remodelação de circuitos neurais, como poda sináptica, regulação da plasticidade sináptica e controle da atividade neuronal 1,2,3,4,5 . Interações fisiológicas entre micróglia e neurônios são de crescente interesse tanto no desenvolvimento do circuito neural quanto na neurobiologia da doença. Analisar a fisiologia da micróglia in vivo requer métodos para observar a micróglia sem dano tecidual e respostas inflamatórias. No entanto, as micróglias são sensíveis à inflamação e alteram drasticamente suas formas e funções em resposta ao dano tecidual 6,7.

A imagem in vivo de dois fótons é uma ferramenta ideal para capturar a dinâmica fisiológica da micróglia8. Aplicações iniciais de imagens in vivo de dois fótons revelaram o movimento dinâmico de processos microgliais para vigilância ambiental no córtex de camundongos adultos 9,10. Os estudos de imagem de dois fótons a seguir ampliaram ainda mais o monitoramento in vivo da micróglia para a análise de interações funcionais e estruturais com neurônios 5,11,12,13,14. No entanto, a profundidade de imagem da microscopia convencional de dois fótons tem sido limitada a menos de 1 mm da superfície cerebral15,16. Essa restrição explica a escassez de estudos anteriores relatando o comportamento da micróglia em regiões cerebrais profundas, como o hipocampo.

Estudos recentes de sequenciamento de RNA têm revelado uma considerável heterogeneidade regional da micróglia, levantando a possibilidade de papéis funcionais distintos 17,18,19,20,21. Portanto, é necessário registrar interações microgliais com neurônios em várias regiões cerebrais, mas dificuldades técnicas têm dificultado tais estudos. Em particular, o envolvimento ativo da microglia no remodelamento das sinapses tem sido relatado como crítico no desenvolvimento da rede neural hipocampal e suas funções relacionadas à memória22,23. No entanto, métodos eficazes para observar a microglia hipocampal incontestável in vivo não estão disponíveis.

Este protocolo explica os procedimentos para a observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo dorsal usando técnicas cirúrgicas precisamente controladas. Imagens de dois fótons da área de CA1 em camundongos CX3CR1-GFP (CX3CR1+/GFP), que expressam GFP na micróglia24, permitiram a observação da microglia ramificada em todas as camadas do CA1 com resolução suficiente. O protocolo inclui várias dicas para o sucesso do implante da janela de observação e condições de imagem adequadas. Além disso, a visualização simultânea de neurônios piramidais e microglia no CA1 é apresentada como exemplo de aplicação. As vantagens, limitações e potencialidades dessa técnica também são discutidas.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados e realizados seguindo as políticas do Comitê de Ética Animal e do Comitê de Segurança de Experimentos Genéticos Recombinantes da Universidade de Tóquio. Camundongos CX3CR1-GFP machos e fêmeas, com idade entre 2 e 4 meses, foram utilizados nos experimentos. Para a segurança dos experimentadores e a manutenção das condições estéreis, todos os procedimentos foram realizados com jalecos brancos, máscaras e luvas estéreis. Todos os instrumentais foram esterilizados antes do uso.

1. Preparação de instrumentos e animais

  1. Montar um tubo metálico com fundo de vidro (Figura 1A).
    1. Aplique uma pequena gota de adesivo óptico de cura UV em uma extremidade de um tubo inoxidável feito sob medida (diâmetro externo 3,0 mm, diâmetro interno 2,8 mm, altura 1,7 mm). Espalhe a cola na borda circular do tubo uniformemente.
      NOTA: Uma quantidade suficiente de adesivo deve ser usada para cobrir toda a borda do tubo.
    2. Coloque uma lamínula circular de vidro (3,0 mm de diâmetro, 0,15 ± 0,02 mm de espessura) na extremidade coberta de cola do tubo de metal e pressione levemente a lamínula contra o tubo para que o espaço entre o tubo e o vidro seja preenchido com a cola. Em seguida, ajuste a posição do vidro para caber dentro da borda externa do tubo de metal.
    3. Irradiar o vidro com luz UV por um tempo suficiente para curar o adesivo.
      NOTA: Certifique-se de que o vidro e o tubo estão completamente ligados. Se a adesão for insuficiente, o vidro pode se desprender após a cirurgia, resultando em imagens malsucedidas ou vazamento de líquido cefalorraquidiano (LCR).
    4. Desinfete o tubo metálico com fundo de vidro montado com etanol 70% e lave com soro fisiológico estéril para remover detritos.
  2. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com um esterilizador de calor seco.
  3. Preparar ratos para a cirurgia de implante de janela.
    NOTA: Os ratos devem ter a idade adequada. É preferível que sejam geneticamente modificados para expressar proteínas fluorescentes no CA1 e no giro denteado (GD). Esses pontos são explicados mais detalhadamente na seção Discussão.

2. Anestesia e fixação da cabeça

  1. Anestesiar um camundongo por injeção intraperitoneal de ketamina-xilazina (100 mg/kg de quetamina e 10 mg/kg de xilazina). Administrar meloxicam (2 mg/kg) por injeção subcutânea para analgesia pré-operatória. Confirmar o desaparecimento da resposta a estímulos dolorosos, como o pinçamento da cauda para garantir a profundidade adequada da anestesia. Adicionar meia dose de ketamina-xilazina cada vez que a anestesia se esgotar durante a cirurgia, tipicamente 1 h após a administração inicial e a cada 30 min depois disso. Use uma almofada de aquecimento sob o corpo para fornecer suporte térmico e aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento sob anestesia.
    OBS: A escolha da anestesia para cirurgia é essencial. Este ponto é discutido em detalhes na seção Discussão.
  2. Aplique creme depilatório para remover os cabelos do couro cabeludo. Desinfetar o couro cabeludo várias vezes em movimento circular com esfoliação de iodopovidona seguida de álcool. Coloque o mouse sobre a plataforma cirúrgica preparada com uma almofada impermeável estéril e aplique campos estéreis para fixar o local cirúrgico. Em seguida, corte e remova o couro cabeludo circularmente com bisturi para que os ossos parietal e occipital fiquem totalmente expostos no lado operatório.
  3. Remova o tecido conjuntivo subcutâneo esfregando-o com um cotonete enquanto aplica soro fisiológico estéril para limpar o sangramento. Raspe suavemente a superfície craniana com uma faca miniatura de ponta redonda para remover o periósteo, o que ajuda a reforçar a adesão entre o cimento e o osso (ver passo 2.6).
  4. Aplique material de condicionamento dental em toda a superfície, aguarde dezenas de segundos e enxágue com soro fisiológico estéril suficiente.
  5. Com tinta impermeável, marque a área do osso a ser removida (área circular com diâmetro de 3,0 mm, centrada cerca de 2,5 mm posterior e 2,5 mm lateral ao bregma). Após a marcação, seque bem a superfície do crânio.
    NOTA: A posição da craniotomia depende do tamanho do hipocampo e deve ser otimizada para diferentes idades. Indicadores úteis para a posição da craniotomia serão apresentados a seguir (ver passo 3.4.5, NOTA).
  6. Fixar a placa retangular de alumínio com espessura de 1,0 mm e furo de 5,0 mm de diâmetro no centro do crânio utilizando cimento resinoso dental de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Alinhar cuidadosamente o orifício no centro da placa com a área circular marcada com uma caneta (ver passo 2.5) de modo a que a placa de alumínio fique paralela à superfície marcada do crânio (Figura 1B). Certifique-se de que o cimento sela firmemente todas as lacunas entre a placa e o osso. Aguarde cerca de 5 min para que o cimento esteja suficientemente endurecido.
  7. Coloque o mouse no dispositivo de fixação da cabeça com ajustadores de ângulo através da placa conectada.

3. Implantação da janela de observação

NOTA: Os seguintes procedimentos cirúrgicos devem ser realizados sob um microscópio estéreo.

  1. Faça um sulco circular no crânio usando um punch dérmico com um diâmetro de 3,0 mm. Alinhe o sulco circular e a área marcada com uma caneta na etapa 2.5. Torça o punch dérmico com pressão suave para que a profundidade do sulco aumente gradualmente. Verifique frequentemente se a profundidade do sulco é constante em toda a circunferência.
  2. Quando o punch dérmico atingir a camada mais interna do crânio, antes de tocar a dura-máter subjacente, levante suavemente a ilha óssea central usando uma agulha de 30 G.
    NOTA: Ligeira fuga de líquido da parte inferior da ranhura indica que a ranhura está próxima da dura-máter.
  3. Remova a dura-máter usando um seletor de dura.
    NOTA: A remoção completa da dura-máter dentro da janela craniana é necessária e exigirá ressecção cuidadosa da dura-máter residual na periferia usando pinça fina.
  4. Aspirar suavemente o tecido para expor o alvéu do hipocampo por agulhas rombas de 23 G ou 25 G conectadas ao aspirador.
    Observação : esta etapa é a mais crítica para o sucesso da imagem. Os principais pontos técnicos para a aspiração tecidual são descritos em detalhes na seção Discussão.
    1. Aspirar a pia e os vasos piais.
    2. Aspirar o tecido cortical da superfície. Manter homogênea a profundidade da superfície do tecido exposto em toda a janela craniana. Aprofundar gradualmente a aspiração até que as fibras da cápsula externa sejam expostas.
    3. Posicionar cuidadosamente a ponta de sucção na cápsula externa, próximo ao ventrículo lateral (VE), localizado na extremidade rostrolateral da janela craniana. Remova a camada superficial da cápsula externa que corre no sentido caudomedial para rostrolateral e, em seguida, a camada interna que corre no sentido médio-lateral.
      NOTA: A cápsula externa perto do LV pode ser facilmente removida da estrutura subjacente.
    4. Confirmar a remoção de toda a cápsula externa verificando a exposição total da superfície do alvéolo e da comissura hipocampal dorsal (CHD).
      NOTA: O DHC cobre a porção caudomedial do CA1. O alvéolo e a DHC podem ser distinguidos da cápsula externa por suas orientações de fibra. Ou seja, as fibras dentro do alvéolo e do CHD correm no sentido rostromedial a caudolateral, e podem ser distinguidas das fibras na cápsula externa. O alvéolo e o DHC estão firmemente ligados ao CA1 e não devem ser danificados. Todos os fragmentos da cápsula externa devem ser removidos, pois os fragmentos remanescentes impedirão o contato direto da tampa de vidro com o alvéolo.
    5. Confirme se o sangramento parou completamente e preencha o orifício com soro fisiológico estéril até o nível da superfície do crânio.
      NOTA: O campo de visão aqui ajuda a julgar se o orifício está na posição apropriada para a idade específica do mouse. Idealmente, o alvéolo e o CA1 subjacente devem ocupar a maior parte da área central. Uma parte da DHC é visível na área caudomedial. A abertura do VE é detectável na borda rostrolateral (Figura 3A).
  5. Introduzir o tubo metálico com fundo de vidro (ver passo 1.1) verticalmente no orifício enquanto aspira o excesso de água que transborda das laterais do tubo até que o fundo de vidro pressione ligeiramente contra o alvéolo e achate parcialmente o CA1 subjacente.
    NOTA: Esta pressão precisa ser ajustada adequadamente. Se for muito forte, o CA1 será danificado. Se for muito fraca, a aberração esférica devido à curvatura do CA1 prejudicará a resolução da imagem em estruturas profundas.
  6. Com o uso de cimento resinoso dental, fixe a parede do tubo inserido ao crânio circundante (Figura 1C). Certifique-se de que toda a circunferência esteja bem fechada e que não haja vazamento de ar ou LCR. Aguarde cerca de 5 min para o cimento endurecer.
    NOTA: Se o cimento é colocado quando sua viscosidade é baixa, ele pode vazar para o parênquima cerebral através do espaço entre o tubo e o crânio e danificar o cérebro. Portanto, o cimento deve ser aplicado após o início da polimerização, o que aumenta a viscosidade e reduz o vazamento através da folga.
  7. Lave toda a placa, o crânio e o interior do tubo com soro fisiológico estéril para remover detritos.

4. Microscopia de dois fótons imediatamente após a cirurgia para verificação da qualidade da cirurgia

  1. Coloque o mouse no dispositivo de retenção da cabeça sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons e no estágio de varredura XY motorizado. Use uma almofada de aquecimento para suporte térmico. Monitore e ajuste a profundidade da anestesia conforme descrito na Etapa 2.1, pois essa verificação de qualidade pode levar até 30 minutos.
    NOTA: Recomenda-se a lente objetiva de imersão em água com uma distância de trabalho (WD) superior a 3 mm e uma abertura numérica elevada (NA). Um colar de correção da lente objetiva pode melhorar a resolução, compensando a incompatibilidade do índice de refração entre o vidro e os biomateriais.
  2. Preencha o espaço entre o vidro e a lente objetiva com água, tomando especial cuidado para evitar bolhas de ar. Se necessário, expanda a área da placa de metal usando um filme plástico, que retém mais água, para cobrir toda a lente frontal da objetiva.
  3. Ligue um laser pulsado de femtossegundo de comprimento de onda de 920 nm para a excitação das sondas fluorescentes expressas no cérebro e inicie o software de aquisição de imagens.
  4. Ajuste o foco para o CA1 com o uso do estágio motorizado e do sistema de foco motorizado. Posicionar a estrutura alvo com a orientação da fluorescência emitida pelo parênquima cerebral e da luz refletida da borda do tubo metálico sob iluminação contínua pelo laser pulsado.
  5. Meça as profundidades do parênquima cerebral tocando o fundo de vidro ajustando o foco com o sistema de foco motorizado. Compare as profundidades em diferentes locais horizontais para julgar o alinhamento do fundo de vidro e do plano de imagem.
    1. Ajuste o ângulo da cabeça do mouse inclinando o dispositivo de fixação da cabeça até que o fundo de vidro esteja definido para ser paralelo ao plano de imagem.
  6. Ajuste o colar de correção do objetivo para alcançar a mais alta resolução na profundidade da estrutura alvo no CA1.
  7. Confirmar que as células fluorescentes na camada molecular (ML) da lâmina superior DG a uma profundidade de 500 μm do fundo de vidro podem ser fotografadas em todo o campo de visão.
    NOTA: Este passo é importante para julgar a qualidade da cirurgia. Se o CA1 estiver danificado, o edema cerebral focal impede a detecção de fluorescência a uma profundidade de mais de 200 μm da superfície. Somente quando não há dano ao CA1 e a curvatura das camadas de CA1 é adequadamente achatada pelo lamínulo sobrejacente, os sinais de GD podem ser detectados imediatamente após a cirurgia (Figura 2A-D). A seção Resultados Representativos fornece uma maneira simples de determinar o limite entre o CA1 e o GD.

5. Cuidados pós-operatórios

  1. Aspirar a água dentro do tubo e cobri-lo com um selo plástico para evitar a entrada de detritos.
  2. Mantenha o rato aquecido e aguarde a recuperação da anestesia.
  3. Administrar meloxicam (2 mg/kg) por via subcutânea a cada 24 h, desde que o rato apresente comportamento relacionado com a dor.
  4. Levante o rato pós-operatório em alojamento individual durante várias semanas.

6. Imagem crônica in vivo de dois fótons da micróglia usando camundongos CX3CR1-GFP

  1. Após a indução anestésica, lavar o interior do tubo metálico com soro fisiológico estéril para remover os detritos. Certifique-se de que o alvéolo branco do hipocampo seja visível através do vidro (Figura 3A) e que não haja complicações, como sangramento pós-operatório.
  2. Coloque o mouse sob o microscópio de dois fótons seguindo as etapas 4.1 a 4.6.
  3. Verificar a qualidade e intensidade das imagens obtidas pela excitação de dois fótons do hipocampo (Figura 3B). Certifique-se de que as imagens obtidas após a redução do edema pós-operatório sejam comparáveis ou melhores do que as obtidas no dia da cirurgia (Figura 2A, ver passo 4.5).
    NOTA: A deterioração da imagem indica a presença de dano tecidual dentro do cérebro.
  4. Certifique-se de que a micróglia já recuperou sua morfologia ramificada (Figura 3C).
    NOTA: Os dados de imagem da micróglia indicam que pelo menos 3-4 semanas são necessárias para que a micróglia retorne ao seu estado basal.
  5. Realizar imagens in vivo em qualquer camada do CA1 para o propósito específico do experimento.

Resultados

Usando esta técnica, a microglia ramificada e quiescente pode ser cronicamente observada em todas as camadas do CA1 dorsal, incluindo o estrato oriens (SO), estrato piramidal (SP), estrato radiado (SR) e estrato lacunoso-molecular (SLM), especialmente 3-4 semanas após a cirurgia, quando a inflamação diminui. Se a cirurgia for realizada adequadamente, os exames de imagem podem ser realizados até vários meses após a cirurgia. Esta seção contém três tópicos úteis para a avaliação de imagens intravitais. Primeiramente, imagens de amostras imediatamente após a cirurgia e na fase crônica são fornecidas como referência para procedimentos cirúrgicos e de imagem apropriados. Em segundo lugar, a morfologia distinta da micróglia, sua intensidade de fluorescência e a distribuição dos vasos sanguíneos em camadas hipocampais específicas são descritas para ajudar os leitores a estimar a profundidade da imagem que varia do alvéolo ao GD. Em terceiro lugar, é fornecido um exemplo de aplicação que ilustra imagens simultâneas de neurônios e micróglia.

As imagens representativas da microglia em camundongos CX3CR1-GFP imediatamente após a cirurgia são mostradas na Figura 2. Se não houver dano aparente ao CA1 e a curvatura das camadas de CA1 for adequadamente achatada pelo deslizamento de cobertura sobrejacente, as profundidades de imagem de dois fótons da micróglia excedem todas as camadas de CA1 e atingem 500 μm da superfície cirúrgica, onde existe o ML ou a camada de células granulares (GCL) do GD (Figura 2A; ver passo 4.7 e Figura 4E). As microglias são ligeiramente menos ramificadas, especialmente na camada próxima à superfície cirúrgica em comparação com aquelas no hipocampo intacto. Apesar disso, não apresentam ativação proeminente, sugerindo procedimentos cirúrgicos adequados (Figura 2B). Por outro lado, o edema no CA1 induzido por dano tecidual limitará a profundidade da imagem a 200 μm (Figura 2C). O dano tecidual também induz ativação microglial anormal, como acúmulo de processos de abaulamento em direção à superfície livre do tecido (Figura 2D; compare com a imagem superior da Figura 2B). Estes são sinais de cirurgia inadequada.

As imagens representativas da micróglia na fase crônica com mais de 3 semanas de pós-operatório são mostradas na Figura 3. A microglia pode ser fotografada novamente além do CA1 para as camadas mais profundas do GD com maior intensidade e resolução fluorescentes e com distribuição mais homogênea (ver passo 6.3, Figura 3B). A qualidade da imagem é melhor do que a imediatamente após a cirurgia (Figura 2A). Essa diferença pode ser explicada pela redução do edema e da inflamação. As microglias em todas as camadas já restauraram sua morfologia ramificada (Figura 3C), diferente de sua aparência pós-operatória (Figura 2B). Imagens em time-lapse da microglia no CA1 revelam corpos celulares imóveis e processos altamente móveis para vigilância (Vídeo 1-2). Seu comportamento móvel é semelhante ao relato anterior da dinâmica do processo microglial no córtex9.

É simples especificar as camadas hipocampais imageadas com base na distribuição e profundidade dos corpos celulares neuronais, utilizando camundongos expressando sondas fluorescentes nos neurônios hipocampais25,26,27. Sem o auxílio das informações posicionais sobre os corpos celulares dos neurônios, os sinais da microglia fluorescente por si só fornecem algumas pistas para a identificação das camadas hipocampais (Figura 3B). As microglias no alvéolo apresentam corpos celulares alongados e processos que tendem a se estender ao longo dos tratos axonais (Figura 4A). Microglia em outras camadas pode ser distinguida por seus corpos celulares redondos e processos que irradiam sem direções preferenciais. Microglia em SP estão entre os neurônios piramidais densamente compactados e podem ser distinguidos pela menor densidade de processos microgliais. As camadas acima e abaixo do PE são identificadas como SO e SR, respectivamente (Figura 4B). É impossível distinguir entre SR e SLM com base apenas nas propriedades microgliais. A borda entre o CA1 e o GD é reconhecida por vasos sanguíneos espessos que correm ao longo da fronteira (Figura 4C). Esses vasos podem ser mais bem reconhecidos pela marcação dos vasos com corantes como a sulforrodamina 101 (SR101; 5 mM, 4 μL/g de peso corporal) injetados intraperitonealmente (Figura 4D). O sinal de fluorescência da micróglia cai acentuadamente no GD em comparação com o CA1 sobrejacente, provavelmente devido à diferença no índice de refração dessas estruturas. Essa diferença na intensidade da fluorescência também pode ajudar a especificar a fronteira entre o GD e o CA1. Como exemplo de aplicação, imagens simultâneas de microglia positiva para GFP e neurônios piramidais marcados com tdTomato são mostradas (Figura 4E). Neste experimento, camundongos CX3CR1-GFP receberam uma injeção de vírus adenoassociado (AAV) para a expressão de tdTomato nos neurônios piramidais do hipocampo. A marcação neuronal ajudará a entender as estruturas exatas da camada do CA1.

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Figura 1: Desenhos esquemáticos para implantação da janela de observação . (A) Vista transversal do tubo metálico com fundo de vidro montado. Uma tampa de vidro circular adere à extremidade do tubo cilíndrico de inox. (B) Vista transversal da placa de alumínio fixada ao crânio. A placa deve estar paralela à superfície marcada do crânio para não interferir com a lente objetiva, posicionada próxima à placa para focalização. (C) Visão transversal do tubo implantado. O fundo de vidro deve estar intimamente ligado ao alvéolo do hipocampo para pressionar e achatar suavemente a superfície do CA1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagem in vivo da micróglia em camundongos CX3CR1-GFP imediatamente após a cirurgia. (A) Reconstrução 3D representativa da imagem CA1 in vivo de um camundongo CX3CR1-GFP no dia pós-operatório (POD) 0 (largura: 511 μm, altura: 511 μm, profundidade: 550 μm). A microglia fluorescente no ML do DG a uma profundidade de 500 μm do fundo de vidro pode ser fotografada através de todo o CA1. (B) Microglias típicas preenchidas com GFP obtidas em (A) são mostradas como as projeções de intensidade máxima (MIPs) de pilhas de imagens com 20 μm de espessura a profundidades de 100, 300 e 520 μm do fundo de vidro. A morfologia microglial é detectável desde o CA1 superficial até o ML do GD, porém com aparente deterioração da imagem no GD. As micróglias, especialmente na camada próxima à superfície cirúrgica, são menos ramificadas, mas não exibem ativação óbvia. Barras de escala, 50 μm. (C) Reconstrução de imagem 3D representativa do CA1 cirurgicamente danificado. Os dados foram adquiridos de um camundongo CX3CR1-GFP no POD 0 (largura: 399 μm, altura: 399 μm, profundidade: 450 μm). A fluorescência microglial é detectável apenas até a profundidade de 200 μm, em contraste com a CA1 (A) não danificada com microglia fluorescente detectada a uma profundidade de 500 μm. (D) A imagem típica de micróglia anormalmente ativada em (C). A PImáx de pilhas de imagens de GFP com 20 μm de espessura a uma profundidade de 60 μm mostra processos de abaulamento microglial estendendo-se em direção à superfície do tecido exposto cirurgicamente. A morfologia geral da microglia é diferente da imagem mostrada em (B). Barra de escala, 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Imagem in vivo da micróglia em camundongos CX3CR1-GFP na fase crônica. (A) O aspecto representativo da janela implantada no CA1 dorsal direito na fase crônica. Através do fundo de vidro, as fibras brancas do alvéolo são claramente observadas sem sangramento pós-operatório. A CHD e o VE são parcialmente visíveis na região caudomedial e na borda rostrolateral, respectivamente. Barra de escala, 1 mm. (B) Reconstrução 3D representativa da imagem crônica in vivo de CA1 de um camundongo CX3CR1-GFP no POD 24 (largura: 511 μm, altura: 511 μm, profundidade: 670 μm). Em comparação com as imagens imediatamente após a cirurgia (Figura 2A), a micróglia apresenta distribuição mais homogênea e pode ser observada mais claramente nas camadas mais profundas do GD devido à redução do edema e da inflamação. (C) Imagens típicas de micróglia de (B) com morfologia ramificada totalmente restaurada são mostradas como MIPs de pilhas de imagens GFP com 20 μm de espessura a profundidades de 100, 280 e 500 μm da superfície cirúrgica. Barras de escala, 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Pistas para identificar cada camada do hipocampo durante a obtenção de imagens in vivo e um exemplo de aplicação deste método. (A) Imagem típica de microglia no alvéolo de camundongos CX3CR1-GFP na fase crônica. Corpos celulares microgliais e processos que se estendem ao longo dos tratos axonais são mostrados na MIP de pilhas de imagens GFP com 10 μm de espessura a uma profundidade de 15 μm. Barra de escala, 50 μm. (B) Imagens representativas da micróglia em SO, SP e SR na fase crônica mostradas como a PImáx de pilhas de imagens GFP com 5 μm de espessura. A densidade local dos processos microgliais é menor em SP do que em SO ou SR circundantes devido aos neurônios piramidais densamente empacotados em SP. Barras de escala, 100 μm. (C) Os vasos sanguíneos espessos que correm ao longo da fronteira entre o CA1 e o GD podem ser reconhecidos apenas pela fluorescência microglial. A projeção de intensidade média de pilhas de imagens de GFP lado a lado com 90 μm de espessura na fase crônica a uma profundidade de cerca de 500 μm é mostrada. O vazio do sinal GFP corresponde aos vasos espessos. Barra de escala, 500 μm. (D) (Superior) Imagem do mesmo campo de visão de C após injeção intraperitoneal de SR101. Barra de escala, 500 μm. (Inferior) Reconstrução 3D das imagens de ladrilhos após injeção SR101 (largura: 2,60 mm, altura: 1,73 mm, profundidade: 0,69 mm). Os vasos espessos que correm ao longo da borda entre o CA1 e o GD podem ser facilmente reconhecidos pela fluorescência SR101 intravascular. (E) (Esquerda) reconstrução 3D do CA1 e do GD (largura: 255 μm, altura: 255 μm, profundidade: 730 μm) e (direita) a PImáx de fluorescência GFP e tdTomato em SP feita a partir de pilhas de imagens com 20 μm de espessura. 1 semana antes da cirurgia, 1,5 μL de uma mistura de AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5,0 x10 12 vg/mL) e AAV1-hSyn-Cre (1,0 x 109 vg/mL) foi injetado no hipocampo de um camundongo CX3CR1-GFP para marcar os neurônios esparsamente. Os exames de imagem foram realizados no POD 0. SP e GCL são facilmente reconhecidas pela posição dos corpos celulares neuronais. Barra de escala, 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Imagem em time-lapse da microglia SO na fase crônica. O MIP de GFP pilhas de imagem com 20 μm de espessura na imagem de lapso de tempo da microglia SO, animado de modo que 28 min jogar em 1 seg. Barra de escala, 50 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Imagem em time-lapse da microglia SR na fase crônica. A MIP de GFP pilhas de imagem com 20 μm de espessura na imagem de lapso de tempo da microglia SR, animada de modo que 28 min seja reproduzida em 1 seg. Barra de escala, 50 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

Este método contém procedimentos cirúrgicos elaborados, mas pode fornecer imagens de alta resolução durante todo o CA1 por um período prolongado se preparado adequadamente. Experimentos com vários camundongos confirmaram que a qualidade da imagem na fase pós-operatória crônica é melhor do que a imagem aguda pós-operatória. A melhor qualidade de imagem foi mantida por mais de 2 meses. A causa mais comum de falha é o dano não intencional ao CA1 durante a cirurgia, que é identificado na verificação de qualidade pós-operatória (ver passo 4). Isso pode ser devido à lesão direta por aspiração, ressecamento do cérebro, pressão excessiva pelo vidro ou toxicidade do cimento dentário na etapa final. Outra causa de falha é o sangramento pós-operatório, que pode ser confirmado através da janela com fundo de vidro dentro de 1 semana após a cirurgia (ver passo 6.1). Leia o protocolo com atenção e tome todas as precauções para evitar tais problemas.

Mesmo com a configuração atual do microscópio de dois fótons com detectores de GaAsP em laboratório, a tentativa de obter imagens do CA1 dorsal através do córtex resulta em uma perda significativa de resolução devido ao espalhamento não desprezível da luz. Portanto, para obter resolução suficiente para observar o movimento de processos microgliais ou a formação de espinhas dendríticas de neurônios no CA1, a remoção de uma parte do córtex sobrejacente é inevitável, como no presente método. A única maneira alternativa de reduzir a extensão da remoção cortical, mantendo a alta resolução da imagem, é incorporar uma lente de relé, como uma lente de índice de refração gradiente (GRIN). Nessa abordagem, uma lente GRIN foi colocada dentro de um tubo guia implantado diretamente acima do CA1 para obtenção de imagens crônicas com CA128,29. O diâmetro externo do tubo guia foi de 1,8 mm, que é menor que os 3,0 mm do dispositivo deste trabalho, produzindo alta resolução (NA; 0,82) comparável ao sistema aqui (NA efetivo; 0,88). No entanto, a abordagem usando uma lente GRIN tem um campo de visão estreito para observação de alta resolução e uma curta profundidade de imagem limitada pela WD da lente GRIN. Portanto, a obtenção de imagens de todas as camadas hipocampais em um amplo campo de visão com alta resolução é uma vantagem específica do método neste trabalho.

Uma limitação deste procedimento é que a remoção parcial do córtex e a inflamação podem ter alguns efeitos prejudiciais sobre o hipocampo. No entanto, como o córtex removido não tem entrada direta para o hipocampo, o córtex entorrinal não é danificado e o hipocampo em si não é diretamente lesado, a avaliação geral é que o comprometimento funcional do hipocampo não é significativo. Vários estudos prévios confirmaram que as funções hipocampais, incluindo aprendizagem e memória, estão preservadas após o implante da janela hipocampal 25,26,27,30,31,32,33,34. Portanto, espera-se que a abordagem de imagem aqui descrita relate fielmente as funções hipocampais após um período pós-operatório suficiente.

Direções futuras de sujeitos de pesquisa baseadas nessa técnica de imagem podem incluir poda sináptica detectada por imagens simultâneas de microglia e neurônios5, interação microglial relacionada ao aprendizado com sinapses35, motilidade microglial regulada pela atividade neural hipocampal36 e respostas microgliais à inflamação periférica ou dano tecidual7. Este método também ajudará a elucidar a progressão das doenças neurodegenerativas. Por exemplo, na doença de Alzheimer (DA), as proteínas β amiloide e tau se acumulam em paralelo com a morte de células neuronais e atrofia hipocampal, levando à disfunção cognitiva; Há relatos de que a microglia está envolvida nesse processo37,38. Imagens crônicas in vivo de micróglia e neurônios usando os modelos de camundongos AD nos permitirão monitorar a correlação entre funções microgliais e patologia neuronal no hipocampo dos modelos de camundongos AD.

Este trabalho se concentra na imagem microglial, mas o mesmo procedimento de imagem é aplicável aos outros tipos de células neuronais e gliais no CA1. Além disso, o protocolo é limitado à imagem de camundongos anestesiados, mas a técnica também pode ser estendida ao monitoramento da microglia hipocampal em camundongos acordados. Os artefatos de movimento induzidos pela respiração, batimentos cardíacos e movimentos do corpo, especialmente nas camadas profundas do hipocampo longe da janela de vidro, podem existir em experimentos com camundongos acordados. Portanto, um sistema de correção de movimento apropriado pode ser necessário para capturar a morfologia e a dinâmica da microglia.

Discussão relacionada ao Protocolo
É aconselhável seleccionar ratinhos com idade e modificações genéticas adequadas para a expressão de sondas fluorescentes com especificidade temporal e espacial (ver passo 1.3). Camundongos com 1 mês de idade podem ser usados para experimentos, mas camundongos com mais de 2 meses são mais fáceis de manusear, com seu maior tamanho corporal e resistência ao estresse cirúrgico. Além disso, a cápsula externa e o alvéus do hipocampo são mais difíceis de separar em camundongos mais jovens. Portanto, a remoção da cápsula externa em camundongos jovens requer habilidades cirúrgicas (ver passos 3.4.3-4). A avaliação da cirurgia e das imagens subsequentes será mais simples com ratinhos a expressarem proteínas fluorescentes de forma reprodutível e uniforme no CA1 e no GD (ver passo 4.7). Assim, nos ensaios iniciais da cirurgia, é aconselhável o uso de camundongos transgênicos com neurônios esparsamente marcados, como camundongos Thy1-YFP ou Thy1-GFP39, ou camundongos com microglia marcada, como camundongos CX3CR1-GFP24.

Para uma cirurgia bem sucedida, a escolha da anestesia é importante (ver passo 2.1). Diferentes tipos de anestesia podem causar vários graus de edema cerebral intraoperatório, que afetam a dificuldade da cirurgia, a posição relativa do tubo metálico implantado e a extensão da compressão cerebral pela janela de vidro. Esses fatores também podem influenciar a sobrevida dos neurônios do hipocampo após a cirurgia.

No processo de aspiração para expor o hipocampo (ver passo 3.4), os seguintes pontos devem ser observados para minimizar os danos ao cérebro e garantir imagens bem-sucedidas. Forneça constantemente soro fisiológico estéril na superfície do tecido posicionando uma saída ao lado da janela craniana. Evitar que a superfície do tecido seja exposta ao ar durante a aspiração. O princípio básico da aspiração tecidual é a remoção da superfície do tecido por um fluxo de líquido para a ponta de sucção. O contato direto da ponta de sucção com o tecido deve ser evitado. Ajuste a pressão negativa aplicada ao tubo de sucção para ser mínima. Aspirar o tecido passo a passo e confirmar se o sangramento está controlado em cada etapa. Quando o sangramento for prolongado, aguarde até que o sangramento pare espontaneamente. Mantenha a aspiração a uma curta distância do local de sangramento com um fluxo constante de soro fisiológico estéril. Aspirar o tecido para criar um espaço cilíndrico com o seu tamanho ajustado ao tubo metálico com fundo de vidro (ver passo 1.1). Escolha agulhas 23 G para aspirar vasos piais espessos ou grandes fragmentos de tecido e agulhas 25 G para sugar pequenos detritos de tecido.

Divulgações

Nenhum dos autores tem conflitos de interesse.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a M. Kondo e M. Matsuzaki por nos emprestarem a lente objetiva XLPLN25XSVMP. Este trabalho foi financiado pela Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) por Grant-in-Aid for JSPS Research Fellow (18J21331 para R.K.) e Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 para S.O.), pela Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 e JP17gm5010003 para S.O.), e pela Japan Science and Technology Agency pela Moonshot R&D (JPMJMS2024 para H.M.).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulhas rombas 23 GNIPRO02-166Pontas de sucção para aspiração.
Agulhas rombas de 25 GNIPRO02-167Pontas de sucção para aspiração.
Punções dérmicas de 3 mm (DermaPunch)Maruho213001610Ferramentas para craniotomia.
Agulhas de 30 GDentronicsAgulha descartável nº 30Ferramentas para craniotomia.
Um laser pulsado de femtossegundoSpectra-PhysicsMaiTai Deep SeeUm laser Ti:Sapphire usado no comprimento de onda de 920 nm.
Um microscópio de dois fótonsNikonA1R MP+Microscópio para a imagem CA1.
AAV1-CAG-FLEX-tdTomatoPenn Vector CoreAAV para marcação neuronal.
AAV1-hSyn-CrePenn Vector CoreAAV para marcação neuronal.
Uma lente objetiva para imagens de dois fótonsOlympusXLPLN25XSVMPobjetiva de 25 vezes; com uma longa distância de trabalho, uma alta abertura numérica e um colar de correção
AspiradoresShin-ei IndustriesKS-500Ferramentas para aspiração.
Placas de alumínioNarishigeCP-1Placas feitas de alumínio para fixação da cabeça.
Creme depilatório químicoYANAGIYACreme para depilação ao redor do local cirúrgico.
Lamínulas de vidro circularesMatsunami Glass3φ Nº 1Lamínulas coladas a tubos de aço inoxidável.
Camundongos CX3CR1-GFPO Laboratório Jackson 008451camundongos transgênicos para imagens microgliais.
Tubos cilíndricos de aço inoxidávelMORISHITAfeitos sob medidapara serem implantados. Diâmetro externo 3,0 mm, diâmetro interno 2,8 mm, altura 1,7 mm.
Material de gravação dentáriaSun Medical204610461Usado para gravar os ossos do crânio.
Cimento de resina dentária (Super-Bond C& B)Sun Medical204610555Cimento dentário.
Raspadores de Dura (Micro Pontos)Ferramentas de Ciência Fina10063-15Ferramentas para remoção de dura.
Pinça fina (Dumont #5)Ferramentas de Belas Ciências11252-20Ferramentas cirúrgicas.
de Pesquisa Biológicacom FórcepsPRI13-3374Usado para desinfetar o local da cirurgia.
Dispositivo de fixação da cabeçaNarishigeMAG-2O dispositivo de fixação da cabeça de ratos com ajustadores de ângulo
Almofada de aquecimentoBio Research CenterBWT-100A e HB-10Ferramentas para fornecer suporte térmico para o rato durante a cirurgia.
Almofada de aquecimentoALA ScientificHEATINGPAD-1 e Hot-1Ferramentas para fornecer suporte térmico para o mouse no dispositivo de fixação da cabeça.
Cetamina (Ketalar)Daiichi Sankyo CompanyS9-001665Anestesia durante a cirurgia.
MeloxicamTokyo Chemical IndustryM1959Analgesia durante a cirurgia.
Pomada oftálmicaSato PharmaceuticalUsado para prevenir o ressecamento dos olhos durante a cirurgia.
Solução de esfoliação de iodopovidonaMeiji Seika Pharma2612701Q1137Usado para desinfetar o local da cirurgia.
Facas em miniatura de ponta redondaSurgistar4769Ferramentas cirúrgicas.
BisturiMURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS450-098-67Ferramenta cirúrgica descartável.
Microscópios estereoscópicosLeica MicrosystemsS8 APOMicroscópios para cirurgia.
Solução salina estérilOtsuka Pharmaceutical Factory3311401A2026Solução de lavagem durante a cirurgia.
Almofada impermeável estérilAS ONE8-5945-01Plataforma cirúrgica.
Sulforrodamina 101Sigma-AldrichS7635Um corante para imagens de vasos in vivo.
Campo cirúrgicoMedline IndustriesMP-0606F6TCampo cirúrgico perfurado para cirurgia.
Luz UVToshibaGL15Usado para curar os adesivos.
Adesivos ópticos de cura UVThorlabsNOA81Adesivos para colagem de lamínulas em tubos de aço inoxidável.
Xilazina (Celactal 2%)Anestesia Bayer durante acirurgia.
Tubos metálicos Centro

Referências

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