Artigo de método

Um Método Simples de Filtração de Bancada para Isolar Pequenas Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Humanas

DOI:

10.3791/64106

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23 de junho de 2022

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1Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia Medical Centre, 2My CytoHealth Sdn. Bhd., 3School of Biosciences, Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University, 4School of Pharmacy, Monash University Malaysia, 5Haematology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research (IMR), National Institutes of Health (NIH), Ministry of Health Malaysia, 6School of Pharmacy, Faculty of Health & Medical Sciences, Taylor's University, 7Centre for Drug Discovery and Molecular Pharmacology (CDDMP), Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo demonstra como isolar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs) com uma configuração simples de bancada em escala laboratorial. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores de sEVs e morfologia de hUC-MSC-sEVs isolados são caracterizados por análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente.

Resumo

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O processo baseado em ultracentrifugação é considerado o método comum para o isolamento de pequenas vesículas extracelulares (EVs). No entanto, o rendimento desse método de isolamento é relativamente menor, e esses métodos são ineficientes na separação dos subtipos de sEV. Este estudo demonstra um método simples de filtração de bancada para isolar pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs), separadas com sucesso por ultrafiltração do meio condicionado de hUC-MSCs. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores exossômicos (CD9, CD81, TSG101) e morfologia dos hUC-MSC-sEVs isolados foram caracterizados com análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente. O tamanho das hUC-MSC-sEVs isoladas foi de 30-200 nm, com concentração de partículas de 7,75 × 10 10 partículas/mL e concentração proteica de80 μg/mL. Bandas positivas para os marcadores exossômicos CD9, CD81 e TSG101 foram observadas. Este estudo mostrou que hUC-MSC-sEVs foram isolados com sucesso do meio condicionado hUC-MSCs, e a caracterização mostrou que o produto isolado preencheu os critérios mencionados pelo Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Introdução

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De acordo com o MISEV 2018, sEVs são partículas de bicamada lipídica não replicantes sem núcleo funcional presente, com um tamanho de 30-200 nm1. Os sEVs derivados de CTM contêm moléculas sinalizadoras importantes que desempenham papéis importantes na regeneração tecidual, como microRNA, citocinas ou proteínas. Eles têm se tornado cada vez mais um "hotspot" de pesquisa em medicina regenerativa e terapia livre de células. Muitos estudos têm demonstrado que as EVs derivadas das CTM são tão eficazes quanto as CTMs no tratamento de diferentes condições, como imunomodulação2,3,4,5, potencialização da osteogênese6, diabetes mellitus7,8ou regeneração vascular9,10. À medida que os ensaios de fase inicial avançam, três questões-chave principais em relação à tradução clínica das CTMs-EVs têm sido destacadas: o rendimento dos EVs, a pureza dos EVs (livres de restos celulares e outros contaminantes biológicos, como proteínas e citocinas) e a integridade da membrana bicamada fosfolipídica dos EVs após o isolamento.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para isolar os sEVs, explorando a densidade, forma, tamanho e proteína de superfície dos sEVs11. Os dois métodos mais comuns em isolamentos de sEVs são técnicas baseadas em ultracentrifugação e técnicas baseadas em ultrafiltração.

Métodos baseados em ultracentrifugação são considerados métodos padrão-ouro no isolamento de sEVs. Dois tipos de técnicas de ultracentrifugação que são usualmente empregadas são a ultracentrifugação diferencial e a ultracentrifugação por gradiente de densidade. No entanto, os métodos de ultracentrifugação frequentemente resultam em baixo rendimento e requerem equipamentos caros para ultracentrifugação de alta velocidade (100.000-200.000 × g)11. Além disso, as técnicas de ultracentrifugação isoladamente são ineficientes na separação dos subtipos de EV (sEVs e grandes EVs), resultando em uma camada de sedimento impura11. Por fim, a ultracentrifugação por gradiente de densidade também pode ser demorada e exigir precauções adicionais, como a adição de tampão de sacarose para inibir o dano do gradiente durante as etapas de aceleração e desaceleração12. Assim, a ultracentrifugação geralmente leva a um rendimento relativamente baixo e não é capaz de discriminar diferentes populações de EVs13, o que limita sua aplicação para a preparação em larga escala de EV11.

O segundo método de isolamento de EV é via ultrafiltração, que é baseada na filtração de tamanho. A ultrafiltração é relativamente eficaz em termos de tempo e custo em comparação com a ultracentrifugação, pois não envolve equipamentos caros ou longos tempos de processamento14. Assim, a ultrafiltração parece ser uma técnica de isolamento mais eficaz do que os dois métodos de ultracentrifugação já mencionados. Os produtos isolados podem ser mais específicos com base no tamanho dos poros e maior rendimento15. No entanto, a força adicional incorrida durante o processo de filtração pode resultar na deformação ou erupção dos EVs16.

O presente artigo propôs um protocolo de bancada custo-efetivo e tempo-efetivo para isolar sEVs derivadas de CTM para análise a jusante e fins terapêuticos. O método descrito neste artigo combinou um método de filtração simples com centrifugação de bancada para isolar EVs de alto rendimento e boa qualidade de hUC-MSCs para análise a jusante, incluindo análise de tamanho de partículas, ensaio de biomarcadores e imagens por microscopia eletrônica.

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Protocolo

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NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos e software usados neste protocolo.

1. Células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano e cultura

  1. Cultivar as CTMs-hUC na densidade de semeadura de 5 × 103/cm2 em DMEM, suplementada com 8% de lisado plaquetário humano e 1% de caneta-Strep. Incubar as células a 37 °C em 5% de CO2. Substitua o meio de cultura celular a cada 3 dias para garantir o crescimento celular adequado.
  2. Expandir as células para a passagem 5 em frascos T175 para isolamento de sEV.
    NOTA: Muitos frascos são necessários para colher um alto rendimento de sEVs (o rendimento aumenta com o número de células).

2. Isolamento de pequenas vesículas extracelulares de hUC - CTMs

  1. Substituir o meio de cultura por DMEM fresco livre de fenol isento de suplementação com Pen-Strep [meio condicionado (MC)] a 1% quando a cultura atingir 70%-80% de confluência na passagem 5.
    CUIDADO: Use apenas meios basais; evitar FBS e suplemento de lisado de plaquetas humanas para evitar a contaminação por sEVs externos.
  2. Após 24 h, centrifugar o CM a 200 × g por 5 min a 4 °C para remover restos celulares. Recolher e filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm para remover partículas maiores que 220 nm.
  3. Encher a unidade filtrante centrífuga com 30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) filtrada através de um filtro de 0,2 μm. Centrifugar a unidade filtrante centrífuga a 3.500 × g durante 5 min a 4 °C.
  4. Encha o CM filtrado na unidade de filtro centrífugo (o volume máximo de cada unidade é de 70 mL). Centrifugar o CM a 3.500 × g a 4 °C.
    NOTA: A duração da centrifugação deve ser monitorizada de tempos a tempos até que a solução tenha atingido a superfície do filtro.
  5. Eliminar a solução no copo da solução filtrada. Centrifugar o copo do filtro de amostra com o copo de recolha de concentrado a 1.000 x g a 4 °C durante 2 minutos.
  6. Transfira o CM concentrado de volta para a unidade de filtro centrífugo. Adicionar 30 ml de PBS filtrado à unidade filtrante centrífuga e centrifugar a unidade a 3.500 × g a 4 °C.
  7. Eliminar a solução no copo da solução filtrada. Instale um copo coletor de concentrado na unidade filtrante e centrífuga reversa a 1.000 × g por 2 min a 4 °C para obter os sEVs purificados.
  8. Filtre os sEVs através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
  9. Transfira as amostras para novos tubos e armazene-as a -80 °C para análise posterior.

3. Caracterização de hUC-MSC-sEVs

  1. Análise de rastreamento de nanopartículas
    1. Diluir os hUC-MSC-sEVs isolados em PBS filtrado para 20-100 partículas/quadro.
    2. Introduzir 1 ml da amostra diluída na câmara NTA utilizando seringas descartáveis de 1 ml.
    3. Defina as configurações de medição de acordo: ajuste o nível da câmera para o nível 14, determine o limite de detecção para incluir o maior número possível de partículas com a restrição de que 10-100 cruzes vermelhas são contadas, e a contagem de cruzes azuis é limitada a cinco.
    4. Para cada medição, grave cinco vídeos de 1 min e analise-os usando o Software NanoSight com um limiar de detecção de cinco.
    5. Fazer medições em triplicata para cada amostra.
  2. Análise de Western blotting
    1. Lisar os hUC-MSC-sEVs com tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação gelado (RIPA), incubar por 30 min a 4 °C e centrifugar a 200 × g por 5 min a 4 °C. Colete o sobrenadante.
    2. Quantifique a proteína usando um Kit de Ensaio de Proteína de Ácido Biconínico (BCA). Monte a eletroforese em gel ajustada de acordo e realize a eletroforese em gel a 90 V até que a proteína atinja o final do gel de empilhamento. Mude a tensão para 200 V para separar as proteínas até o final do gel de resolução.
    3. Realizar transferência semi-seca para transferir as proteínas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) a 15 V por 1 h.
    4. Bloquear a membrana de PVDF com albumina de soro bovino a 3% (BSA)/solução salina tamponada com Tris-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) por 1 h em um agitador à temperatura ambiente. Incubar a membrana de PVDF com anticorpos primários da seguinte forma: anticorpo monoclonal anti-CD 9 de camundongo (1:500), anticorpo monoclonal anti-CD 81 de camundongo (1:500), anticorpo monoclonal anti-GRP 94 de camundongo anti-TSG 101 de camundongo (1:500) a 4 °C durante a noite com agitação constante.
    5. No dia seguinte, lavar a membrana de PVDF 5 x 5 min com TBS-T e incubar com um anticorpo secundário: proteína ligadora IgG kappa conjugada à horseradish peroxidase de camundongo (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000) por 1 h com agitação à temperatura ambiente.
    6. Novamente, lave a membrana de PVDF com TBS-T cinco vezes e visualize a membrana em um imageador de carga acoplada (CCD) usando um reagente de detecção por quimioluminescência. Analise o nível de expressão das proteínas utilizando o software ImageJ. Primeiro, abra o arquivo de imagem no ImageJ (Arquivo | Aberto...). Melhorar a qualidade da imagem ajustando o brilho e o contraste (Imagem | Ajustar | Brilho/Contraste). Ajuste a imagem até que as manchas estejam claramente visíveis, clique no botão Aplicar e, em seguida, salve as imagens no formato TIFF (Arquivo | Salvar como | TIFF...).
  3. Microscópio eletrônico de transmissão
    1. Diluir uma parte da amostra de hUC-MSC-sEVs com quatro partes de PBS filtrado para um volume total de 10 μL e incubar em uma grade de cobre revestida de carbono por 15 min.
    2. Retire o excesso de amostra usando um lenço de laboratório e deixe secar ao ar por 3 min.
    3. Incubar 10 μL de solução de ácido fosfotúngstico (PTA) a 1% para manchar a amostra durante 3 minutos.
    4. Retire o excesso de solução de PTA a 1% com um lenço de laboratório e deixe secar ao ar por 3 min.
    5. Use a amostra para imagens de microscópio eletrônico de transmissão.
      NOTA: Consulte a Figura 1 para obter as etapas resumidas do experimento esquemático.

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Resultados

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A Figura 2 mostra que hUC-MSC-sEVs têm um modo de tamanho de partícula em 53 nm, enquanto outros picos significativos de tamanho de partícula foram 96 e 115 nm. A concentração de hUC-MSC-sEVs medida por NTA foi de 7,75 × 1010 partículas/mL. A concentração proteica de hUC-MSC-sEVs medida com o ensaio de BCA foi de aproximadamente 80 μg/mL.

Na análise de western blotting, hUC-MSC-sEVs demonstraram bandas positivas para os marcadores exossômicos CD9, CD81 ...

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Discussão

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Os EVs são um dos subgrupos importantes do secretoma nas CTMs que desempenham um papel crucial durante processos normais e patológicos. No entanto, os sEVs, com uma faixa de tamanho entre 30 e 200 nm, surgiram como uma ferramenta potencial para terapia livre de células na última década. Várias técnicas foram desenvolvidas para isolar sEVs de CTMs. Entretanto, ultracentrifugação diferencial, ultrafiltração, precipitação à base de polímero, captura de imunoafinidade e precipitação baseada em microfluídica possuem diferente...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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A publicação deste vídeo foi apoiada por My CytoHealth Sdn. Bhd.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
40% de acrilamidaNacalai Tesque06121-95Western blot
95% etanolNacalai Tesque14710-25Desinfetantes
Metanol AbsolutoChemiz45081Para ativar a membrana PVDF (Western blot)
AccutaseSTEMCELL Technologies7920Enzima de dissociação celular
persulfato de amônioChemiz14475catalisar a polimerização em gel (Eletroforese em gel
anti-CD 81 (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-166029Anticorpo para marcador de sEVs
anti-TSG 101 (C-2)Santa Cruz Biotechnologysc-7964Anticorpo para marcador de sEVs
Albumina de soro bovinoNacalai Tesque00653-31PVDF bloqueio de membrana
azul de bromofenolNacalai Tesque05808-61marcador de cor eletroforético
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)MilliporeUFC710008isolamento sEVs
ChemiLumi One LNacalai Tesque7880reagente de detecção de quimioluminescência
CryoStor Mídia de congelamentoSigma-AldrichC3124-100MLCriopreservação celular
Dulbecco' s Águia modificada' s mediumNacalai Tesque08458-45Meios de cultura celular
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein MarkerSMOBIOPM2610Marcadores de peso molecular de proteína
Papel absorvente extra grossoATTOtampão reservior (Western blot)
GlycerolMerckG5516Produtos químicos para western blot
Glycine1st BaseBIO-2085-500gProdutos químicos para tampão (Western Blot)
proteína de ligação de kappa de camundongo conjugada com peroxidase de rábano (m-IgGκ BP-HRP)Santa Cruz Biotechnologysc-516102Anticorpo secundário (Western Blot)
Human Wharton' s Células-tronco mesenquimais derivadas de geléia (MSCs)Centro de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa, Faculdade de Medicina, Universidade Nacional da Malásia
anticorpos de camundongo anti-CD 9 (C-4)Santa Cruz Biotechnology  sc-13118Anticorpo para marcador sEVs
Nanosight NS300 equipado com uma câmera CMOS, uma lente objetiva de 20 &vezes, um módulo de laser azul (488  nm) e software NTA v3.2Malvern Panalytical, UK
paraformaldeídoNacalai Tesque02890-45Fixação de amostra durante
TEM penicilina– estreptomicinaNacalai Tesque26253-84Antibiótico para
meio fluoreto de fenilmetilsulfonilNacalai Tesque27327-81Inibir proteases nas amostras de sEVs após adição de tampão de lise
salina tamponada com fosfatoGibco10010023fluoreto
de polivinilideno (PVDF) de diluição da amostra com
tamanho de poro de 0,45 mm		ATTOPara reter a proteína durante a transferência de proteínas (Western blot)
coquetel de inibidores de proteaseNacalai Tesque25955-11Inibir proteases nas amostras de sEVs após adicionar tampão de lise
Kit de Ensaio de Proteína BicinchoninatoNacalai Tesque06385-00de medição de proteína
com 2-MENacalai Tesque30566-22Agente redutor para sódio western blot
cloretoNacalai Tesque15266-64Produtos químicos para western blot
dodecil sulfato de sódioNacalai Tesque31606-62surfactante iônico durante eletroforese em gel
Tecnai G2 F20 S-TWIN microscópio eletrônico de transmissãoFEI, EUA
tetrametiletilenodiaminaNacalai Tesque33401-72produtos químicos para preparar
gel tris-base1ª BaseBIO-1400-500gProdutos químicos para tampão (Western Blot)
  Tween 20GeneTexGTX30962Chemicals para western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imagerCCD imager para detecção de sinal western blot
solução Lavagem, membrana de Solução tampão de amostra

Referências

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  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
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  3. Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
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Etiquetas

Ultrafiltration MethodConditioned MediumNanoparticle TrackingBCA Protein AssayWestern BlotTransmission Electron MicroscopeExosomal Markers

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