Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Há evidências crescentes de que o estado interno do organismo influencia constantemente as funções cerebrais em animais 1,2,3,4,5. Assim, para obter uma compreensão mais profunda das funções cerebrais, é crucial elucidar como as células gliais no cérebro monitoram as condições biológicas na periferia e transmitem as informações aos neurônios.

As microglias, células imunes do cérebro, estão envolvidas no desenvolvimento sináptico e na plasticidade, que esculpem características dos circuitos neurais no cérebro 6,7,8,9. Por exemplo, o trabalho pioneiro de Wake e col. demonstrou que processos microgliais entram em contato com sinapses de maneira neuronal-dependente no neocórtex de camundongos e que a isquemia artificial induz perda de sinapse após contato prolongado com a micróglia¹⁰. verificaram que a alteração da experiência visual altera a modalidade de interação microglial com as sinapses. Durante o período crítico em que o turnover da coluna dendrítica no córtex visual primário (V1) é aumentado pela privação binocular, a adaptação ao escuro reduz a motilidade dos processos microgliais e aumenta tanto a frequência de contato com as fendas sinápticas quanto o número de inclusões celulares na micróglia¹¹. Estes resultados sugerem que os processos microgliais detectam a atividade neural e seu ambiente circundante para remodelar circuitos neurais. Além disso, um estudo recente relatou que a vigilância microglial difere entre condições acordadas e anestesiadas, sugerindo a importância de experimentos com camundongos acordados para investigar a comunicação neurônio-microglia em condições fisiológicas¹².

A imagem in vivo de cálcio de dois fótons é uma ferramenta poderosa para o registro da dinâmica do cálcio, refletindo o disparo neuronal contínuo, em centenas de neurônios simultaneamente em um animal vivo^13,14,15. A imagem do cálcio em neurônios geralmente requer uma resolução temporal de mais de alguns Hz para rastrear respostas neuronais rápidas^16,17. Em contraste, estudos anteriores rastreando a dinâmica microglial amostraram estruturas microgliais em uma resolução temporal relativamente baixa, inferior a 0,1 Hz^18,19,20. Um estudo recente aplicou imagens simultâneas de dois fótons para entender a comunicação neurônio-microglia²¹. No entanto, ainda não está claro como os processos microgliais dinâmicos respondem à atividade neural circundante em uma resolução temporal de mais de alguns Hz em camundongos acordados. A fim de abordar esta questão, descrevemos um método de imagem simultânea in vivo de dois fótons da atividade neural e dinâmica microglial com uma resolução temporal superior a 1 Hz em camundongos acordados. Este método nos permite obter imagens estáveis em camundongos acordados a uma taxa de quadros mais alta (máximo, 30 Hz com o tamanho de quadro de pixel de 512 x 512 pixels) e fornece uma maneira mais favorável de investigar o comportamento de vigilância da micróglia ou sua interação com a atividade neuronal em camundongos acordados.

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal e pelo Comitê de Segurança de Experimentos Recombinantes Genéticos da Escola de Pós-Graduação em Medicina e Faculdade de Medicina da Universidade de Tóquio e realizados de acordo com suas diretrizes.

1. Preparo

1. Esterilizar todos os instrumentais e equipamentos necessários para a cirurgia em autoclave ou etanol 70%.
2. Preparação de pipeta de vidro.
   1. Fixe firmemente um capilar calibrado de 75 μL no suporte do puxador de micropipetas. Ajuste o extrator para o programa com os parâmetros recomendados como P (pressão) = 500, CALOR = 680, TRAÇÃO = 30, VEL = 60, TEMPO = 180.
   2. Após o término do programa (geralmente 4,5 a 5 s), o capilar é dividido em duas pipetas de vidro com caudas afiladas. Em seguida, quebre a parte distal da cauda com uma pinça para manter o diâmetro da ponta dentro de 30-50 μm. Para isso, quebre as caudas 1 cm distal ao final da parte chanfrada.
3. Para craniotomia, preparar uma janela craniana colando um disco de vidro externo maior, de 4 mm de diâmetro, 0,15 ± 0,02 mm de espessura, em um disco de vidro interno menor, de 2 mm de diâmetro, 0,525 ± 0,075 mm de espessura, usando um reagente fotopolimerizável UV (Figura 2A).

2. Injeção de AAV

1. Preparação do aparelho de injecção
   1. Coloque uma pipeta de vidro conectada a uma seringa Hamilton 26 G através de um tubo sobre um suporte de pipeta de um instrumento estereotáxico e, em seguida, incline o suporte de pipeta 60° anteriormente a partir do eixo vertical (Figura 1A,B).
   2. Encha a pipeta de vidro, a seringa e o tubo de ligação com parafina líquida. Coloque a seringa em um microinjetor.
2. Procedimento cirúrgico
   OBS: A seguinte cirurgia foi realizada em cabina esterilizada. Um estereomicroscópio foi usado para a cirurgia, se necessário.
   1. Anestesiar um camundongo CX3CR1-EGFP macho (informações detalhadas na Tabela de Materiais) com 7 a 8 semanas de idade (peso corporal 22-26 g) com isoflurano a 3% em uma câmara estanque ao gás. Após 3 min, retirar o camundongo da câmara quando ele perder o movimento voluntário, exceto a respiração, e então mudar para anestesia contínua por um tubo nasal com isoflurano a 2%.
      NOTA: O isoflurano é conhecido por ativar a micróglia. No entanto, como os exames de imagem são realizados 4 semanas após a cirurgia, não há efeito do isoflurano nos camundongos durante os exames de imagem. Embora a anestesia com isoflurano seja usada por alguns minutos quando camundongos são colocados no instrumento estereotáxico antes da aquisição de imagens (passo 4.2.1), descobrimos que o efeito dessa anestesia curta é desprezível.
   2. Durante a cirurgia, mantenha o rato aquecido com uma almofada de aquecimento a 37 °C para evitar a hipotermia. Aplicar pomada ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea e administrar uma injeção de meloxicam, por via subcutânea (5 mg/kg). Conecte o mouse a uma barra de ouvido auxiliar e, em seguida, fixe o mouse no instrumento estereotáxico com seu lado dorsal para cima.
   3. Ajustar a concentração de isoflurano para uma porcentagem adequada (1%-2%) durante a cirurgia enquanto monitora a respiração e a frequência cardíaca. Retire os pelos usando creme depilatório e desinfete a cabeça várias vezes em movimento circular com um esfoliante à base de iodo ou clorexidina e álcool. Em seguida, injetar 0,1 mL de lidocaína a 1% por via subcutânea e aplicar campos estéreis para fixar o sítio cirúrgico.
   4. Incise o couro cabeludo aberto ao longo da linha média com tesoura e faça a incisão com cerca de 2 cm de comprimento, para garantir uma boa exposição do crânio acima do córtex visual primário direito. Após a incisão do couro cabeludo, irrige a cabeça com soro fisiológico durante todo o procedimento para evitar que o crânio e o cérebro expostos sequem.
   5. Remova o periósteo do crânio exposto com pinças. Perfurar o crânio nas coordenadas estereotáxicas: 3 mm lateral à linha média, 0,5 mm anterior à linha lambda, para criar um pequeno orifício com aproximadamente 0,5 mm de diâmetro. Enxágue o sangue e os restos de tecido da broca, se necessário.
   6. Encher a pipeta de vidro com 1 μL de rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 utilizando o seguinte procedimento a um título de 8,3 x^{10 12} genomas vectoriais/ml²².
      1. Avançar a seringa para ejetar 1 μL de parafina líquida da pipeta de vidro. Coloque um pedaço de filme transparente, aproximadamente 2 cm x 2cm, sobre o crânio exposto do rato e expulse uma gota de 1 μL de solução de AAV sobre o filme utilizando um pipetador.
      2. Coloque a ponta da pipeta de vidro na gota da solução de AAV sobre o filme e puxe suavemente a seringa para aspirar a solução de AAV. Após a ejeção, gire a torneira em forma de T para liberar a pressão dentro do tubo e da pipeta de vidro.
   7. Introduzir a pipeta de vidro a uma profundidade de 500 μm a partir da superfície cerebral através do orifício criado no passo 2.2.5 e, em seguida, injectar 0,5 μL de solução de AAV utilizando o microinjector (Figura 1C). Utilizar o fluxo volumétrico de injeção de 2,0 μL/h; uma injeção de 0,5 μL leva 15 minutos e, em seguida, espera 5 min.
   8. Após a injeção, retire suavemente a pipeta de vidro e lave a superfície cerebral com soro fisiológico.

3. Implante de janela craniana

NOTA: O implante de janela craniana segue a injeção de AAV no mesmo dia.

1. Marcar um círculo de 2,5 mm de diâmetro no crânio, centrado 3 mm lateralmente da lambda. Crie um sulco circular ao longo da marca no crânio perfurando. Limpe os detritos, pois pode afetar negativamente a visibilidade do crânio e aplique soro fisiológico durante o processo de perfuração para evitar o aquecimento.
2. Para verificar se a profundidade de perfuração no sulco circular é suficiente para remover o fragmento central do crânio, pressione suavemente o crânio central com pinças. Se ele se move verticalmente com pouca resistência, a profundidade de perfuração é suficiente.
3. Quando o sulco atingir profundidade suficiente, insira a ponta da pinça na parte inferior do fragmento central do crânio e levante-o e remova-o suavemente para expor a superfície cerebral (Figura 1D).
4. Usando uma agulha de 27 G, pice e rasgue a dura-máter na borda da superfície cerebral exposta. Insira a ponta da pinça através do orifício feito na borda da dura-máter. Segure a dura-máter e descasque-a para expor a superfície cerebral.
   NOTA: Se ocorrer sangramento, lave a superfície do cérebro com soro fisiológico até que o sangramento pare.
5. Com o uso de pinças, dispersar as fibras hemostáticas, uma a uma, em solução salina, em uma placa de 3,5 mm e, em seguida, colocar as fibras hemostáticas ao longo das margens do orifício em que a dura-máter transeccionada está presente.
6. Coloque uma janela craniana preparada no passo 1.3 na superfície exposta do cérebro e, em seguida, cole-a ao crânio com cola instantânea enquanto pressiona suavemente a janela para que a janela fique em contato próximo com o crânio.
7. Em seguida, aplique cola instantânea em todo o crânio exposto e, em seguida, fixe cuidadosamente uma placa de cabeça no crânio para que a janela se localize no centro do orifício quadrado da placa da cabeça (Figura 2C). Certifique-se de que a superfície da placa principal esteja paralela à superfície da janela de vidro.
8. Após a cola endurecer o suficiente, aplicar cimento dentário no crânio exposto para reforçar a fixação entre a cabeça e a placa-cabeça (Figura 2).
   NOTA: Se os experimentos incluírem a apresentação de estímulos visuais para camundongos, a luz perdida para a área de imagem deve ser evitada. É aconselhável escurecer o cimento misturando-o com o carvão ativado para a redução da reflexão da luz.
9. Retire o rato da anestesia depois de o cimento ter endurecido suficientemente (cerca de 20 min). Em seguida, coloque o rato em uma nova gaiola para se recuperar sozinho.
10. Depois de confirmar sua consciência e movimento voluntário, indicando recuperação completa, coloque o camundongo de volta na gaiola de casa. Durante a recuperação, administrar uma segunda dose, ou mais, se necessário, de meloxicam (uma vez a cada 24 horas durante 1-3 dias) se ocorrerem comportamentos indicativos de dor óbvios.

4. Imagem in vivo de dois fótons da microglia e dinâmica neuronal do cálcio

1. Habituação de camundongos ao aparelho microscópico
   1. Três semanas após a cirurgia, induzir anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e colocá-lo sob a lente objetiva de 25x de um microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico feito sob medida (Figura 3C). Para a configuração aqui, o mouse é colocado na parte superior de uma esteira e permitido correr livremente.
   2. Aproximadamente 10 minutos depois, remova o camundongo do estágio do microscópio e devolva-o à gaiola doméstica. Repetir a habituação pelo menos 3 vezes a cada dia alternado antes da aquisição da imagem de dois fótons.
2. Aquisição de imagens de dois fótons
   OBS: Recomendamos realizar a aquisição das imagens mais de 4 semanas após a cirurgia, pois a ativação microglial retorna gradualmente ao nível basal.
   1. Como no passo 4.1, induzir anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e colocá-lo sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico personalizado.
   2. Instale o dispositivo de sombreamento personalizado e um monitor LCD para estimulação visual, conforme descrito abaixo (Figura 3D).
      1. Posicione a lente para focar na superfície do cérebro e, em seguida, defina essa posição da lente como a posição Z original. Mantenha as coordenadas x-y constantes e eleve a lente objetiva; Remova o mouse e o instrumento estereotáxico da lente objetiva e da esteira.
      2. Fixe um dispositivo de sombreamento na parte superior da placa da cabeça usando silicone, que é escurecido pela mistura com pó de carvão, e certifique-se de que o espaço entre a placa da cabeça e o dispositivo de sombreamento esteja bem vedado.
      3. Encha o dispositivo de sombreamento com água destilada e, em seguida, fixe o mouse e o quadro estereotáxico novamente sob a objetiva e na esteira. Redefina cuidadosamente o plano focal na superfície do cérebro, verificando a profundidade da lente objetiva.
         NOTA: Para evitar o risco de danificar a lente objetiva, defina as coordenadas xyz primeiro e, em seguida, aplique o dispositivo de sombreamento da lente objetiva. Também é razoável instalar a tampa primeiro e, em seguida, ajustar as coordenadas, mas o manuseio cauteloso é necessário para essa opção.
      4. Cubra a lente objetiva com papel alumínio preto para evitar a contaminação luminosa do monitor LCD utilizado para estimulação visual através da lente objetiva (Figura 3D). Ajuste um monitor LCD de 10 polegadas a 12,5 cm à frente dos olhos do mouse para apresentar estímulos visuais (Figura 3D).
   3. Configure os filtros de coleta de emissão de fluorescência para fluorescência EGFP (filtro de emissão de 525/50 nm) e fluorescência R-CaMP (filtro de emissão de 593/46 nm) e o comprimento de onda de excitação para 1.000 nm. Adquira imagens com resolução espacial de 0,25 μm/pixel utilizando objetiva 25x 1,1 NA e PMTs GaAsP.
   4. Encontre a região de imagem na qual os neurônios R-CaMP(+) e a microglia EGFP(+) podem ser fotografados simultaneamente na camada 2/3. Para esta configuração, os dados obtidos na Figura 4 e no Vídeo 1 estavam a uma profundidade de 100 μm da superfície pial, usando uma visualização de imagem ao vivo. Mantenha a potência do laser de excitação o mais baixa possível para evitar o fotoclareamento e os danos causados pelo aumento da temperatura local na região da imagem.
   5. Adquira imagens na taxa de quadros de 30 Hz. Simultaneamente com a aquisição da imagem, apresente um estímulo visual de grade de deriva a 100% de contraste, 1,5 Hz, 0,04 ciclos por grau em 12 direções em 6 orientações de 0° a 150° em passos de 30° para o mouse¹⁷.
   6. Após a aquisição da imagem, remova o mouse do estágio do microscópio, retire o dispositivo de sombreamento e o instrumento estereotáxico do mouse e devolva o mouse à sua gaiola inicial.
3. Cadastro de dados
   1. Converta e salve os dados de imagem adquiridos (formato nd2 neste caso) como uma série de arquivos de imagem tiff para cada canal de cor, usando Fiji ou o software fornecido com o microscópio.
   2. Aplique o Turboreg, um plugin de Fiji, para realizar o registro com mode = translation. Use a imagem média como a imagem de referência com os arquivos de imagem tiff do canal EGFP.
   3. Execute o processamento a seguir para cada quadro usando o MATLAB.
      NOTA: Embora o MATLAB seja usado no processamento a seguir, a descrição se concentra principalmente na intenção de cada etapa para que os dados possam ser analisados por outros softwares de programação, como o Python.
      1. Use a função imread para ler duas imagens tiff EGFP antes e depois do registro do mesmo quadro, respectivamente. Use a função imread para ler a imagem tiff R-CaMP do mesmo quadro.
      2. Use a função normcorr2 para calcular a função de correlação entre as variáveis vetorizadas das duas imagens de GFP lidas na etapa 4.3.3.1.
      3. Use a função max para detectar o índice linear com a maior correlação cruzada da função de correlação e, em seguida, use a função ind2sub para calcular a posição de movimento da imagem registrada a partir de sua imagem original.
      4. Use a função imwarp para traduzir a imagem R-CaMP para a posição calculada na etapa 4.3.3.3 e, em seguida, use a função imwrite para salvar a imagem registrada do R-CaMP.
4. Geração de traços de cálcio
   1. Execute o processamento a seguir usando o MATLAB. Use a função imread para ler todas as imagens tiff R-CaMP registradas geradas na etapa 4.3.3.4. Se as imagens registradas já tiverem sido carregadas como uma variável no espaço de trabalho, omita esta etapa.
   2. Use a função mean para gerar uma imagem de projeção de tempo. Use a função imshow para mostrar a imagem média como uma figura; use a função roipoly para gerar uma máscara de ROI binária da estrutura alvo (coluna dendrítica nesses dados).
   3. Usando a função média com as imagens obtidas multiplicando a máscara binária com imagens de cada quadro como variáveis de entrada, calcule a intensidade média de fluorescência dentro da ROI para cada quadro.
   4. Como descrito anteriormente¹⁷, para a variável obtida no passo 4.4.3, aplicar o filtro de frequência de manteiga no ponto de corte = 1,6 s, para cortar ruído de alta frequência, e em seguida aplicar o filtro de mediana deslizante na janela de tempo = 200 s, para cortar ruído de baixa frequência.

Realizamos a injeção de AAV e o implante de janela craniana em V1 de um camundongo transgênico CX3XR1-EGFP com 8 semanas de idade, conforme descrito neste protocolo. Quatro semanas após a cirurgia, realizamos imagens simultâneas in vivo de dois fótons da atividade neural baseada em R-CaMP e dinâmica microglial na camada 2/3 de V1 (Figura 4 e Vídeo 1). Durante a realização das imagens, o camundongo foi colocado em uma esteira e deixado correr livremente. As imagens foram adquiridas na taxa de quadros de 30 Hz com resolução espacial de 0,25 μm/pixel, utilizando-se objetiva de 25x, 1,1 NA e PMTs GaAsP. Tanto o EGFP quanto o R-CaMP foram excitados em um comprimento de onda de 1.000 nm, e a fluorescência EGFP (filtro de emissão de 525/50 nm) e a fluorescência do R-CaMP (filtro de emissão de 593/46 nm) foram coletadas simultaneamente. Após o registro dos dados adquiridos para minimizar os artefatos de movimento, a cada quatro quadros foi calculada a média em um quadro para reduzir o ruído de fundo. Estímulos visuais gradeados foram apresentados ao camundongo, e as respostas visuais dos neurônios e espinhos dendríticos individuais foram analisadas (Figura 4D). Os processos microgliais apresentaram dinâmica rápida e mudaram sua morfologia em 10 s (Figura 4E e Vídeo 1). Conforme detalhado na seção Discussão, quando a injeção de AAV falhou, a expressão de R-CaMP não pôde ser detectada. Se a cirurgia não fosse bem sucedida, os sinais de EGFP e R-CaMP não poderiam ser observados.

Figura 1: Injeção de AAV . (A) Uma pipeta de vidro foi conectada a uma seringa Hamilton 26 G usando um tubo de silicone. (B) A configuração para a injeção de AAV. (C) A solução de AAV foi injetada através da pipeta de vidro inclinada 60° anteriormente em relação ao eixo vertical. (D) Diagrama esquemático do procedimento de crânio aberto (descrito no passo 3.3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Janela craniana e placa cefálica . (A) Diagrama esquemático do implante da janela craniana. (B) Foram utilizadas placas de cabeça sob medida. Para exames de imagem no hemisfério direito, o braço mais curto deve ser usado no lado direito. (C) Vista dorsal de um camundongo com janela craniana e placa cefálica implantada. (D) Vista de grande magnificação da janela craniana mostrada na Figura 2C. (E) Vista dorsal de um mouse fixada com o instrumento estereotáxico personalizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Configuração para imagens in vivo de dois fótons. (A) Vista dorsal do dispositivo de sombreamento. (B) Vista lateral do dispositivo de sombreamento. (C) Vista de um mouse com o dispositivo de sombreamento na placa da cabeça sob a lente objetiva. O mouse é colocado na esteira. (D) Visão sob microscópio de excitação de dois fótons. Um monitor apresentando estímulos visuais é colocado no lado direito da figura. A lente objetiva é coberta com o dispositivo de sombreamento e folha de alumínio preta para evitar a luz do monitor para a lente objetiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Dinâmica microglial e respostas visuais em uma coluna dendrítica. (A-C) Imagens de tempo médio dos neurônios EGFP(+) microglia e R-CaMP(+) na camada 2/3 de V1 em um camundongo transgênico CX3XR1-EGFP de 12 semanas de idade. A intensidade do sinal em cada canal foi normalizada independentemente. (D) Respostas visuais em uma coluna dendrítica. Diagramas de listras com setas pretas indicam a direção dos estímulos de grade apresentados no tempo indicado pelas colunas cinzas. Nos traços de cálcio, linhas cinzas indicam respostas individuais, e uma linha preta indica sua média. No inset direito, uma seta amarela indica a espinha dendrítica na qual a região de interesse (ROI) foi gerada para adquirir os traços de cálcio. (E) O processo microglial (cabeça de seta ciano) mostrou rápida retração em 10 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Imagem de dois fótons da atividade neuronal e dinâmica microglial. Dados de imagem dos neurônios EGFP(+) microglia e R-CaMP(+) na camada 2/3 de V1 em um camundongo transgênico CX3XR1-EGFP de 12 semanas de idade. No lado esquerdo do filme, magenta indica R-CaMP em neurônios, e verde indica EGFP em microglia. O centro do filme corresponde ao sinal EGFP e o lado direito corresponde ao sinal R-CaMP. A intensidade do sinal em cada canal foi normalizada independentemente. A taxa de quadros do filme é 40 vezes mais rápida do que a taxa real. Barra de escala = 10 μm Clique aqui para baixar este vídeo.

Os autores não têm nada a revelar.