Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Abstract

Uma vez que as funções cerebrais estão sob a influência contínua dos sinais derivados dos tecidos periféricos, é fundamental elucidar como as células gliais no cérebro percebem várias condições biológicas na periferia e transmitem os sinais aos neurônios. Microglia, células imunes no cérebro, estão envolvidas no desenvolvimento sináptico e plasticidade. Portanto, a contribuição da microglia para a construção de circuitos neurais em resposta ao estado interno do corpo deve ser testada criticamente por imagens intravitais da relação entre a dinâmica da microglia e a atividade neuronal.

Aqui, descrevemos uma técnica para a obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e da atividade neuronal em camundongos acordados. O vírus adenoassociado que codifica o R-CaMP, um indicador de cálcio codificado por genes da proteína de fluorescência vermelha, foi injetado na camada 2/3 do córtex visual primário em camundongos transgênicos CX3CR1-EGFP expressando EGFP na micróglia. Após a injeção viral, uma janela craniana foi instalada na superfície cerebral da região injetada. Imagens in vivo de dois fótons em camundongos acordados 4 semanas após a cirurgia demonstraram que a atividade neural e a dinâmica microglial podem ser registradas simultaneamente na resolução temporal de sub-segundo. Essa técnica pode revelar a coordenação entre a dinâmica microglial e a atividade neuronal, com a primeira respondendo a estados imunológicos periféricos e a segunda codificando os estados cerebrais internos.

Introduction

Há evidências crescentes de que o estado interno do organismo influencia constantemente as funções cerebrais em animais 1,2,3,4,5. Assim, para obter uma compreensão mais profunda das funções cerebrais, é crucial elucidar como as células gliais no cérebro monitoram as condições biológicas na periferia e transmitem as informações aos neurônios.

As microglias, células imunes do cérebro, estão envolvidas no desenvolvimento sináptico e na plasticidade, que esculpem características dos circuitos neurais no cérebro 6,7,8,9. Por exemplo, o trabalho pioneiro de Wake e col. demonstrou que processos microgliais entram em contato com sinapses de maneira neuronal-dependente no neocórtex de camundongos e que a isquemia artificial induz perda de sinapse após contato prolongado com a micróglia¹⁰. verificaram que a alteração da experiência visual altera a modalidade de interação microglial com as sinapses. Durante o período crítico em que o turnover da coluna dendrítica no córtex visual primário (V1) é aumentado pela privação binocular, a adaptação ao escuro reduz a motilidade dos processos microgliais e aumenta tanto a frequência de contato com as fendas sinápticas quanto o número de inclusões celulares na micróglia¹¹. Estes resultados sugerem que os processos microgliais detectam a atividade neural e seu ambiente circundante para remodelar circuitos neurais. Além disso, um estudo recente relatou que a vigilância microglial difere entre condições acordadas e anestesiadas, sugerindo a importância de experimentos com camundongos acordados para investigar a comunicação neurônio-microglia em condições fisiológicas¹².

A imagem in vivo de cálcio de dois fótons é uma ferramenta poderosa para o registro da dinâmica do cálcio, refletindo o disparo neuronal contínuo, em centenas de neurônios simultaneamente em um animal vivo^13,14,15. A imagem do cálcio em neurônios geralmente requer uma resolução temporal de mais de alguns Hz para rastrear respostas neuronais rápidas^16,17. Em contraste, estudos anteriores rastreando a dinâmica microglial amostraram estruturas microgliais em uma resolução temporal relativamente baixa, inferior a 0,1 Hz^18,19,20. Um estudo recente aplicou imagens simultâneas de dois fótons para entender a comunicação neurônio-microglia²¹. No entanto, ainda não está claro como os processos microgliais dinâmicos respondem à atividade neural circundante em uma resolução temporal de mais de alguns Hz em camundongos acordados. A fim de abordar esta questão, descrevemos um método de imagem simultânea in vivo de dois fótons da atividade neural e dinâmica microglial com uma resolução temporal superior a 1 Hz em camundongos acordados. Este método nos permite obter imagens estáveis em camundongos acordados a uma taxa de quadros mais alta (máximo, 30 Hz com o tamanho de quadro de pixel de 512 x 512 pixels) e fornece uma maneira mais favorável de investigar o comportamento de vigilância da micróglia ou sua interação com a atividade neuronal em camundongos acordados.

Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal e pelo Comitê de Segurança de Experimentos Recombinantes Genéticos da Escola de Pós-Graduação em Medicina e Faculdade de Medicina da Universidade de Tóquio e realizados de acordo com suas diretrizes.

1. Preparo

1. Esterilizar todos os instrumentais e equipamentos necessários para a cirurgia em autoclave ou etanol 70%.
2. Preparação de pipeta de vidro.
   1. Fixe firmemente um capilar calibrado de 75 μL no suporte do puxador de micropipetas. Ajuste o extrator para o programa com os parâmetros recomendados como P (pressão) = 500, CALOR = 680, TRAÇÃO = 30, VEL = 60, TEMPO = 180.
   2. Após o término do programa (geralmente 4,5 a 5 s), o capilar é dividido em duas pipetas de vidro com caudas afiladas. Em seguida, quebre a parte distal da cauda com uma pinça para manter o diâmetro da ponta dentro de 30-50 μm. Para isso, quebre as caudas 1 cm distal ao final da parte chanfrada.
3. Para craniotomia, preparar uma janela craniana colando um disco de vidro externo maior, de 4 mm de diâmetro, 0,15 ± 0,02 mm de espessura, em um disco de vidro interno menor, de 2 mm de diâmetro, 0,525 ± 0,075 mm de espessura, usando um reagente fotopolimerizável UV (Figura 2A).

2. Injeção de AAV

1. Preparação do aparelho de injecção
   1. Coloque uma pipeta de vidro conectada a uma seringa Hamilton 26 G através de um tubo sobre um suporte de pipeta de um instrumento estereotáxico e, em seguida, incline o suporte de pipeta 60° anteriormente a partir do eixo vertical (Figura 1A,B).
   2. Encha a pipeta de vidro, a seringa e o tubo de ligação com parafina líquida. Coloque a seringa em um microinjetor.
2. Procedimento cirúrgico
   OBS: A seguinte cirurgia foi realizada em cabina esterilizada. Um estereomicroscópio foi usado para a cirurgia, se necessário.
   1. Anestesiar um camundongo CX3CR1-EGFP macho (informações detalhadas na Tabela de Materiais) com 7 a 8 semanas de idade (peso corporal 22-26 g) com isoflurano a 3% em uma câmara estanque ao gás. Após 3 min, retirar o camundongo da câmara quando ele perder o movimento voluntário, exceto a respiração, e então mudar para anestesia contínua por um tubo nasal com isoflurano a 2%.
      NOTA: O isoflurano é conhecido por ativar a micróglia. No entanto, como os exames de imagem são realizados 4 semanas após a cirurgia, não há efeito do isoflurano nos camundongos durante os exames de imagem. Embora a anestesia com isoflurano seja usada por alguns minutos quando camundongos são colocados no instrumento estereotáxico antes da aquisição de imagens (passo 4.2.1), descobrimos que o efeito dessa anestesia curta é desprezível.
   2. Durante a cirurgia, mantenha o rato aquecido com uma almofada de aquecimento a 37 °C para evitar a hipotermia. Aplicar pomada ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea e administrar uma injeção de meloxicam, por via subcutânea (5 mg/kg). Conecte o mouse a uma barra de ouvido auxiliar e, em seguida, fixe o mouse no instrumento estereotáxico com seu lado dorsal para cima.
   3. Ajustar a concentração de isoflurano para uma porcentagem adequada (1%-2%) durante a cirurgia enquanto monitora a respiração e a frequência cardíaca. Retire os pelos usando creme depilatório e desinfete a cabeça várias vezes em movimento circular com um esfoliante à base de iodo ou clorexidina e álcool. Em seguida, injetar 0,1 mL de lidocaína a 1% por via subcutânea e aplicar campos estéreis para fixar o sítio cirúrgico.
   4. Incise o couro cabeludo aberto ao longo da linha média com tesoura e faça a incisão com cerca de 2 cm de comprimento, para garantir uma boa exposição do crânio acima do córtex visual primário direito. Após a incisão do couro cabeludo, irrige a cabeça com soro fisiológico durante todo o procedimento para evitar que o crânio e o cérebro expostos sequem.
   5. Remova o periósteo do crânio exposto com pinças. Perfurar o crânio nas coordenadas estereotáxicas: 3 mm lateral à linha média, 0,5 mm anterior à linha lambda, para criar um pequeno orifício com aproximadamente 0,5 mm de diâmetro. Enxágue o sangue e os restos de tecido da broca, se necessário.
   6. Encher a pipeta de vidro com 1 μL de rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 utilizando o seguinte procedimento a um título de 8,3 x^{10 12} genomas vectoriais/ml²².
      1. Avançar a seringa para ejetar 1 μL de parafina líquida da pipeta de vidro. Coloque um pedaço de filme transparente, aproximadamente 2 cm x 2cm, sobre o crânio exposto do rato e expulse uma gota de 1 μL de solução de AAV sobre o filme utilizando um pipetador.
      2. Coloque a ponta da pipeta de vidro na gota da solução de AAV sobre o filme e puxe suavemente a seringa para aspirar a solução de AAV. Após a ejeção, gire a torneira em forma de T para liberar a pressão dentro do tubo e da pipeta de vidro.
   7. Introduzir a pipeta de vidro a uma profundidade de 500 μm a partir da superfície cerebral através do orifício criado no passo 2.2.5 e, em seguida, injectar 0,5 μL de solução de AAV utilizando o microinjector (Figura 1C). Utilizar o fluxo volumétrico de injeção de 2,0 μL/h; uma injeção de 0,5 μL leva 15 minutos e, em seguida, espera 5 min.
   8. Após a injeção, retire suavemente a pipeta de vidro e lave a superfície cerebral com soro fisiológico.

3. Implante de janela craniana

NOTA: O implante de janela craniana segue a injeção de AAV no mesmo dia.

1. Marcar um círculo de 2,5 mm de diâmetro no crânio, centrado 3 mm lateralmente da lambda. Crie um sulco circular ao longo da marca no crânio perfurando. Limpe os detritos, pois pode afetar negativamente a visibilidade do crânio e aplique soro fisiológico durante o processo de perfuração para evitar o aquecimento.
2. Para verificar se a profundidade de perfuração no sulco circular é suficiente para remover o fragmento central do crânio, pressione suavemente o crânio central com pinças. Se ele se move verticalmente com pouca resistência, a profundidade de perfuração é suficiente.
3. Quando o sulco atingir profundidade suficiente, insira a ponta da pinça na parte inferior do fragmento central do crânio e levante-o e remova-o suavemente para expor a superfície cerebral (Figura 1D).
4. Usando uma agulha de 27 G, pice e rasgue a dura-máter na borda da superfície cerebral exposta. Insira a ponta da pinça através do orifício feito na borda da dura-máter. Segure a dura-máter e descasque-a para expor a superfície cerebral.
   NOTA: Se ocorrer sangramento, lave a superfície do cérebro com soro fisiológico até que o sangramento pare.
5. Com o uso de pinças, dispersar as fibras hemostáticas, uma a uma, em solução salina, em uma placa de 3,5 mm e, em seguida, colocar as fibras hemostáticas ao longo das margens do orifício em que a dura-máter transeccionada está presente.
6. Coloque uma janela craniana preparada no passo 1.3 na superfície exposta do cérebro e, em seguida, cole-a ao crânio com cola instantânea enquanto pressiona suavemente a janela para que a janela fique em contato próximo com o crânio.
7. Em seguida, aplique cola instantânea em todo o crânio exposto e, em seguida, fixe cuidadosamente uma placa de cabeça no crânio para que a janela se localize no centro do orifício quadrado da placa da cabeça (Figura 2C). Certifique-se de que a superfície da placa principal esteja paralela à superfície da janela de vidro.
8. Após a cola endurecer o suficiente, aplicar cimento dentário no crânio exposto para reforçar a fixação entre a cabeça e a placa-cabeça (Figura 2).
   NOTA: Se os experimentos incluírem a apresentação de estímulos visuais para camundongos, a luz perdida para a área de imagem deve ser evitada. É aconselhável escurecer o cimento misturando-o com o carvão ativado para a redução da reflexão da luz.
9. Retire o rato da anestesia depois de o cimento ter endurecido suficientemente (cerca de 20 min). Em seguida, coloque o rato em uma nova gaiola para se recuperar sozinho.
10. Depois de confirmar sua consciência e movimento voluntário, indicando recuperação completa, coloque o camundongo de volta na gaiola de casa. Durante a recuperação, administrar uma segunda dose, ou mais, se necessário, de meloxicam (uma vez a cada 24 horas durante 1-3 dias) se ocorrerem comportamentos indicativos de dor óbvios.

4. Imagem in vivo de dois fótons da microglia e dinâmica neuronal do cálcio

1. Habituação de camundongos ao aparelho microscópico
   1. Três semanas após a cirurgia, induzir anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e colocá-lo sob a lente objetiva de 25x de um microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico feito sob medida (Figura 3C). Para a configuração aqui, o mouse é colocado na parte superior de uma esteira e permitido correr livremente.
   2. Aproximadamente 10 minutos depois, remova o camundongo do estágio do microscópio e devolva-o à gaiola doméstica. Repetir a habituação pelo menos 3 vezes a cada dia alternado antes da aquisição da imagem de dois fótons.
2. Aquisição de imagens de dois fótons
   OBS: Recomendamos realizar a aquisição das imagens mais de 4 semanas após a cirurgia, pois a ativação microglial retorna gradualmente ao nível basal.
   1. Como no passo 4.1, induzir anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e colocá-lo sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico personalizado.
   2. Instale o dispositivo de sombreamento personalizado e um monitor LCD para estimulação visual, conforme descrito abaixo (Figura 3D).
      1. Posicione a lente para focar na superfície do cérebro e, em seguida, defina essa posição da lente como a posição Z original. Mantenha as coordenadas x-y constantes e eleve a lente objetiva; Remova o mouse e o instrumento estereotáxico da lente objetiva e da esteira.
      2. Fixe um dispositivo de sombreamento na parte superior da placa da cabeça usando silicone, que é escurecido pela mistura com pó de carvão, e certifique-se de que o espaço entre a placa da cabeça e o dispositivo de sombreamento esteja bem vedado.
      3. Encha o dispositivo de sombreamento com água destilada e, em seguida, fixe o mouse e o quadro estereotáxico novamente sob a objetiva e na esteira. Redefina cuidadosamente o plano focal na superfície do cérebro, verificando a profundidade da lente objetiva.
         NOTA: Para evitar o risco de danificar a lente objetiva, defina as coordenadas xyz primeiro e, em seguida, aplique o dispositivo de sombreamento da lente objetiva. Também é razoável instalar a tampa primeiro e, em seguida, ajustar as coordenadas, mas o manuseio cauteloso é necessário para essa opção.
      4. Cubra a lente objetiva com papel alumínio preto para evitar a contaminação luminosa do monitor LCD utilizado para estimulação visual através da lente objetiva (Figura 3D). Ajuste um monitor LCD de 10 polegadas a 12,5 cm à frente dos olhos do mouse para apresentar estímulos visuais (Figura 3D).
   3. Configure os filtros de coleta de emissão de fluorescência para fluorescência EGFP (filtro de emissão de 525/50 nm) e fluorescência R-CaMP (filtro de emissão de 593/46 nm) e o comprimento de onda de excitação para 1.000 nm. Adquira imagens com resolução espacial de 0,25 μm/pixel utilizando objetiva 25x 1,1 NA e PMTs GaAsP.
   4. Encontre a região de imagem na qual os neurônios R-CaMP(+) e a microglia EGFP(+) podem ser fotografados simultaneamente na camada 2/3. Para esta configuração, os dados obtidos na Figura 4 e no Vídeo 1 estavam a uma profundidade de 100 μm da superfície pial, usando uma visualização de imagem ao vivo. Mantenha a potência do laser de excitação o mais baixa possível para evitar o fotoclareamento e os danos causados pelo aumento da temperatura local na região da imagem.
   5. Adquira imagens na taxa de quadros de 30 Hz. Simultaneamente com a aquisição da imagem, apresente um estímulo visual de grade de deriva a 100% de contraste, 1,5 Hz, 0,04 ciclos por grau em 12 direções em 6 orientações de 0° a 150° em passos de 30° para o mouse¹⁷.
   6. Após a aquisição da imagem, remova o mouse do estágio do microscópio, retire o dispositivo de sombreamento e o instrumento estereotáxico do mouse e devolva o mouse à sua gaiola inicial.
3. Cadastro de dados
   1. Converta e salve os dados de imagem adquiridos (formato nd2 neste caso) como uma série de arquivos de imagem tiff para cada canal de cor, usando Fiji ou o software fornecido com o microscópio.
   2. Aplique o Turboreg, um plugin de Fiji, para realizar o registro com mode = translation. Use a imagem média como a imagem de referência com os arquivos de imagem tiff do canal EGFP.
   3. Execute o processamento a seguir para cada quadro usando o MATLAB.
      NOTA: Embora o MATLAB seja usado no processamento a seguir, a descrição se concentra principalmente na intenção de cada etapa para que os dados possam ser analisados por outros softwares de programação, como o Python.
      1. Use a função imread para ler duas imagens tiff EGFP antes e depois do registro do mesmo quadro, respectivamente. Use a função imread para ler a imagem tiff R-CaMP do mesmo quadro.
      2. Use a função normcorr2 para calcular a função de correlação entre as variáveis vetorizadas das duas imagens de GFP lidas na etapa 4.3.3.1.
      3. Use a função max para detectar o índice linear com a maior correlação cruzada da função de correlação e, em seguida, use a função ind2sub para calcular a posição de movimento da imagem registrada a partir de sua imagem original.
      4. Use a função imwarp para traduzir a imagem R-CaMP para a posição calculada na etapa 4.3.3.3 e, em seguida, use a função imwrite para salvar a imagem registrada do R-CaMP.
4. Geração de traços de cálcio
   1. Execute o processamento a seguir usando o MATLAB. Use a função imread para ler todas as imagens tiff R-CaMP registradas geradas na etapa 4.3.3.4. Se as imagens registradas já tiverem sido carregadas como uma variável no espaço de trabalho, omita esta etapa.
   2. Use a função mean para gerar uma imagem de projeção de tempo. Use a função imshow para mostrar a imagem média como uma figura; use a função roipoly para gerar uma máscara de ROI binária da estrutura alvo (coluna dendrítica nesses dados).
   3. Usando a função média com as imagens obtidas multiplicando a máscara binária com imagens de cada quadro como variáveis de entrada, calcule a intensidade média de fluorescência dentro da ROI para cada quadro.
   4. Como descrito anteriormente¹⁷, para a variável obtida no passo 4.4.3, aplicar o filtro de frequência de manteiga no ponto de corte = 1,6 s, para cortar ruído de alta frequência, e em seguida aplicar o filtro de mediana deslizante na janela de tempo = 200 s, para cortar ruído de baixa frequência.

Results

Realizamos a injeção de AAV e o implante de janela craniana em V1 de um camundongo transgênico CX3XR1-EGFP com 8 semanas de idade, conforme descrito neste protocolo. Quatro semanas após a cirurgia, realizamos imagens simultâneas in vivo de dois fótons da atividade neural baseada em R-CaMP e dinâmica microglial na camada 2/3 de V1 (Figura 4 e Vídeo 1). Durante a realização das imagens, o camundongo foi colocado em uma esteira e deixado correr livremente. As imagens foram adquiridas na taxa de quadros de 30 Hz com resolução espacial de 0,25 μm/pixel, utilizando-se objetiva de 25x, 1,1 NA e PMTs GaAsP. Tanto o EGFP quanto o R-CaMP foram excitados em um comprimento de onda de 1.000 nm, e a fluorescência EGFP (filtro de emissão de 525/50 nm) e a fluorescência do R-CaMP (filtro de emissão de 593/46 nm) foram coletadas simultaneamente. Após o registro dos dados adquiridos para minimizar os artefatos de movimento, a cada quatro quadros foi calculada a média em um quadro para reduzir o ruído de fundo. Estímulos visuais gradeados foram apresentados ao camundongo, e as respostas visuais dos neurônios e espinhos dendríticos individuais foram analisadas (Figura 4D). Os processos microgliais apresentaram dinâmica rápida e mudaram sua morfologia em 10 s (Figura 4E e Vídeo 1). Conforme detalhado na seção Discussão, quando a injeção de AAV falhou, a expressão de R-CaMP não pôde ser detectada. Se a cirurgia não fosse bem sucedida, os sinais de EGFP e R-CaMP não poderiam ser observados.

Figura 1: Injeção de AAV . (A) Uma pipeta de vidro foi conectada a uma seringa Hamilton 26 G usando um tubo de silicone. (B) A configuração para a injeção de AAV. (C) A solução de AAV foi injetada através da pipeta de vidro inclinada 60° anteriormente em relação ao eixo vertical. (D) Diagrama esquemático do procedimento de crânio aberto (descrito no passo 3.3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Janela craniana e placa cefálica . (A) Diagrama esquemático do implante da janela craniana. (B) Foram utilizadas placas de cabeça sob medida. Para exames de imagem no hemisfério direito, o braço mais curto deve ser usado no lado direito. (C) Vista dorsal de um camundongo com janela craniana e placa cefálica implantada. (D) Vista de grande magnificação da janela craniana mostrada na Figura 2C. (E) Vista dorsal de um mouse fixada com o instrumento estereotáxico personalizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Configuração para imagens in vivo de dois fótons. (A) Vista dorsal do dispositivo de sombreamento. (B) Vista lateral do dispositivo de sombreamento. (C) Vista de um mouse com o dispositivo de sombreamento na placa da cabeça sob a lente objetiva. O mouse é colocado na esteira. (D) Visão sob microscópio de excitação de dois fótons. Um monitor apresentando estímulos visuais é colocado no lado direito da figura. A lente objetiva é coberta com o dispositivo de sombreamento e folha de alumínio preta para evitar a luz do monitor para a lente objetiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Dinâmica microglial e respostas visuais em uma coluna dendrítica. (A-C) Imagens de tempo médio dos neurônios EGFP(+) microglia e R-CaMP(+) na camada 2/3 de V1 em um camundongo transgênico CX3XR1-EGFP de 12 semanas de idade. A intensidade do sinal em cada canal foi normalizada independentemente. (D) Respostas visuais em uma coluna dendrítica. Diagramas de listras com setas pretas indicam a direção dos estímulos de grade apresentados no tempo indicado pelas colunas cinzas. Nos traços de cálcio, linhas cinzas indicam respostas individuais, e uma linha preta indica sua média. No inset direito, uma seta amarela indica a espinha dendrítica na qual a região de interesse (ROI) foi gerada para adquirir os traços de cálcio. (E) O processo microglial (cabeça de seta ciano) mostrou rápida retração em 10 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Imagem de dois fótons da atividade neuronal e dinâmica microglial. Dados de imagem dos neurônios EGFP(+) microglia e R-CaMP(+) na camada 2/3 de V1 em um camundongo transgênico CX3XR1-EGFP de 12 semanas de idade. No lado esquerdo do filme, magenta indica R-CaMP em neurônios, e verde indica EGFP em microglia. O centro do filme corresponde ao sinal EGFP e o lado direito corresponde ao sinal R-CaMP. A intensidade do sinal em cada canal foi normalizada independentemente. A taxa de quadros do filme é 40 vezes mais rápida do que a taxa real. Barra de escala = 10 μm Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussion

Descrevemos o protocolo de injeção de AAV e craniotomia para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados, bem como processamento de dados. Esta técnica pode descobrir a coordenação entre a dinâmica microglial e a atividade neuronal em escalas de tempo que variam de sub-segundo a dezenas de segundos.

O protocolo cirúrgico envolve várias etapas tecnicamente exigentes. A injeção de AAV é uma das etapas críticas. A injeção malsucedida de AAV pode causar uma redução significativa na expressão de R-CaMP. Existem duas razões principais: pipetas de vidro entupidas e danos nos tecidos. O entupimento das pipetas de vidro reduz ou bloqueia completamente a ejeção da solução de AAV. Esta situação pode ser evitada colorindo-se a solução de AAV com um corante como verde rápido e confirmando visualmente o sucesso da injeção. O dano tecidual causado pela injeção de AAV impede a expressão gênica exógena perto do centro do local da injeção. É provável que o dano induzido pela injeção de AAV seja causado por um aumento súbito do efluxo da ponta da pipeta de vidro após o acúmulo da pressão no interior da pipeta. Portanto, a saída da solução de AAV da pipeta de vidro deve ser constante durante a injeção. Selecionar pipetas de vidro com um diâmetro um pouco maior em suas pontas resolveria esse problema. No implante de janela craniana, a velocidade da cirurgia é crítica. Se a cirurgia demorar muito, o tecido cerebral pode ser gravemente danificado. Assim, a prática repetida é necessária para garantir a rapidez e a suavidade da cirurgia. Além disso, durante as 4 semanas entre a cirurgia e os exames de imagem, a qualidade da imagem pode ser reduzida pela regeneração tecidual entre a janela craniana e o tecido cerebral pelo método^{convencional17}. O método aqui supera essa questão aplicando vidros espessos para o disco de vidro interno das janelas cranianas para inibir a regeneração do tecido e manter a janela limpa. No sistema aqui descrito, esse efeito foi evidente com o uso de um disco de vidro interno com espessura de 0,525 ± 0,075 μm.

O método pode ser aplicado com sucesso em camundongos com mais de 4 semanas, mas a aplicação em camundongos mais jovens pode ser problemática. Em camundongos juvenis, o crânio apresenta crescimento rápido e proeminente, o que induz a um descompasso entre o osso craniano e a janela de vidro.

Em alguns estudos de ponta, imagens in vivo de dois fótons foram usadas para estudar interações microglia-neurônio 12,21,23. Especialmente no trabalho pioneiro de Merlini e col., eles realizaram imagens simultâneas in vivo da dinâmica microglial e da atividade neural dentro dos corpos^celulares21. Neste método, usando vidros internos mais espessos para janelas cranianas, pudemos suprimir artefatos de movimento na orientação de profundidade e obter a medida estável da atividade neuronal em microestruturas, como espinhos dendríticos. Este método ajudaria a investigar as interações sinapse-processo microglial em camundongos acordados.

Recentemente, estudos in vitro demonstraram que processos microgliais filopódios finos têm motilidade mais rápida do que processos espessos, sugerindo a importância de sua motilidade mais rápida na vigilância¹⁹. O sistema aqui pode rastrear a motilidade de processos microgliais finos com uma resolução temporal de um sub-segundo a algumas dezenas de segundos. Esta propriedade ajuda a elucidar o significado funcional de sua motilidade para vigilância in vivo.

No futuro, a combinação dessa técnica de imagem com intervenções, como optogenética24 ou^{quimiogenética25}, aplicadas a circuitos neurais locais ou conexões neurais inter-regionais, lançaria luz sobre novas funções microgliais no desenvolvimento sináptico e plasticidade que esculpem características de circuitos neurais. Além disso, uma maior integração de tarefas de imagem, intervenção e comportamentais contribuiria para revelar a coordenação da microglia e dos neurônios subjacentes a comportamentos específicos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Monitor LCD de 10 polegadas	EIZO	DuraVision FDX1003	Para apresentar estímulos visuais irritantes
Seringa Hamilton 26G	Agulha Hamilton	701N
27G	Terumo	NN-2719S
AAV-hSyn-R-CAMP1.07	N/A	N/A	Gentilmente presenteado do laboratório do Prof. Matsuzaki
Pó de carvão ativado	Nacalai tesque	07909-65
Folha de alumínio preta	THORLABS	BKF12
CX3CR1-EGFP camundongo	Jackson laboratório	IMSR_JAX: 005582	CX3CR-1EGFP/+ camundongos knock-in/knock-out expressando EGFP na microglia no cérebro sob o controle do Cx3cr1 endógeno locus.
DENT SILICONE-V	Shofu Inc	N/A	Para a fixação de um dispositivo de sombreamento a uma placa de cabeça
Cimento dentário (resina rápida, líquido)	Shofu	Inc N/A
AB Cimento dentário(resina rápida, pó)	Shofu Inc	N/A	B Broca Cor 3
	Toyo Associates	HP-200
Pipeta capilar de vidro	Drummond Scientific Company	2-000-075
Disco de vidro (grande)	Matsunami	N/A	4mm de diâmetro, 0.15± 0.02mm de espessura
Disco de vidro (pequeno)	Matsunami	N/A	2mm de diâmetro, 0.525± 0,075 mm de espessura
Placa de cabeça	Personalizada N	/ A	Material: SUS304, espessura: 0,5 mm, consulte a Figura 2B para a forma
Fibra hemostática	Davol Inc	1010090
ImageJ Fiji software		Software livre	Para registro de dados
Cola instantânea (Aron alfa)	Daiichi Sankyo	N / A
Isoflurano	Pfizer	N / A
Lidocaína	Astrazeneca	N/A
MATLAB 2017b	MathWorks	N/A	Para registro e processamento de dados
Meloxicam	Tokyo Chemical Industry	M1959
Microinjetor	KD Scientific	KDS-100
Extrator de micropipeta	Sutter Instrument Company	P-97
Microscópio de excitação multifóton	NIKON	N/A	O nome comercial é "A1MP+".
Lente objetiva	NIKON	N/A	O nome comercial é "CFI75 apocromático 25xC W".
tesque	26132-35		Psychtoolbox
			para apresentar o dispositivo de raspagem da proteção dos estímulos visuais
	Instrumento
SR-611	Narishige	instrumento
	M165 FC de Leica M165 FC
Instrumento estereotáxico	Personalizado	N/A	Para fixar ratos sob o microscópio de dois fotões
Torneira	ISIS	VXB1079
Seda cirúrgica	Esteira Ethicon	K881H
	Personalizado	N/A
Agente de fotopolimerização UV	Norland Products Inc	NOA 65
Vaporizador	Penlon	Sigma Delta	Máquina anestésica