Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez des souris éveillées

Il y a de plus en plus de preuves que l’état interne du corps influence constamment les fonctions cérébrales chez les animaux 1,2,3,4,5. En conséquence, pour mieux comprendre les fonctions cérébrales, il est crucial d’élucider comment les cellules gliales du cerveau surveillent les conditions biologiques à la périphérie et transmettent l’information aux neurones.

Les microglies, cellules immunitaires du cerveau, sont impliquées dans le développement synaptique et la plasticité, qui sculptent les caractéristiques des circuits neuronaux dans le cerveau 6,7,8,9. Par exemple, les travaux pionniers de Wake et al. ont démontré que les processus microgliaux entrent en contact avec les synapses d’une manière dépendante de l’activité neuronale dans le néocortex de la souris et que l’ischémie artificielle induit une perte de synapse après un contact prolongé avec la microglie¹⁰. Tremblay et al. ont constaté que l’altération de l’expérience visuelle modifie la modalité de l’interaction microgliale avec les synapses. Pendant la période critique où le renouvellement de l’épine dendritique dans le cortex visuel primaire (V1) est augmenté par privation binoculaire, l’adaptation à l’obscurité réduit la motilité des processus microgliaux et augmente à la fois leur fréquence de contact avec les fentes synaptiques et le nombre d’inclusions cellulaires dans la microglie¹¹. Ces résultats suggèrent que les processus microgliaux détectent l’activité neuronale et leur environnement environnant pour remodeler les circuits neuronaux. En outre, une étude récente a rapporté que la surveillance microgliale diffère entre les conditions éveillées et anesthésiées, suggérant l’importance des expériences utilisant des souris éveillées pour étudier la communication neurone-microglie dans des conditions physiologiques¹².

L’imagerie calcique in vivo à deux photons est un outil puissant pour l’enregistrement de la dynamique du calcium, reflétant la décharge neuronale en cours, dans des centaines de neurones simultanément chez un animal vivant^13,14,15. L’imagerie calcique dans les neurones nécessite généralement une résolution temporelle de plus de quelques Hz pour suivre les réponses neuronales rapides^16,17. En revanche, des études antérieures sur la dynamique microgliale ont échantillonné des structures microgliales à une résolution temporelle relativement faible de moins de 0,1 Hz^18,19,20. Une étude récente a appliqué l’imagerie simultanée à deux photons pour comprendre la communication neurone-microglie²¹. Cependant, on ne sait toujours pas comment les processus microgliaux dynamiques répondent à l’activité neuronale environnante à une résolution temporelle de plus de quelques Hz chez les souris éveillées. Afin de résoudre ce problème, nous décrivons une méthode d’imagerie simultanée in vivo à deux photons de l’activité neuronale et de la dynamique microgliale avec une résolution temporelle supérieure à 1 Hz chez des souris éveillées. Cette méthode nous permet d’obtenir une imagerie stable chez des souris éveillées à une fréquence d’images plus élevée (maximum, 30 Hz avec une taille d’image en pixels de 512 x 512 pixels) et fournit un moyen plus favorable d’étudier le comportement de surveillance de la microglie ou leur interaction avec l’activité neuronale chez les souris éveillées.

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité d’éthique animale et le Comité de sécurité des expériences génétiques recombinantes de l’École supérieure de médecine et de la Faculté de médecine de l’Université de Tokyo, et réalisées conformément à leurs directives.

1. Préparation

1. Stériliser tous les instruments et appareils nécessaires à la chirurgie à l’aide d’autoclave ou d’éthanol à 70%.
2. Préparation de pipettes en verre.
   1. Fixez fermement un capillaire calibré de 75 μL au support de l’extracteur de micropipettes. Réglez l’extracteur sur le programme avec les paramètres recommandés comme P (pression) = 500, HEAT = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180.
   2. Après avoir terminé le programme (généralement 4,5 à 5 s), le capillaire est divisé en deux pipettes en verre avec des queues effilées. Ensuite, cassez la partie distale de la queue avec une pince à épiler pour maintenir le diamètre de la pointe à 30-50 μm. Pour cela, cassez les queues de 1 cm distale jusqu’à l’extrémité de la partie biseautée.
3. Pour la craniotomie, préparer une fenêtre crânienne en collant un disque de verre extérieur plus grand, de 4 mm de diamètre, 0,15 ± 0,02 mm d’épaisseur, sur un disque de verre intérieur plus petit, de 2 mm de diamètre et de 0,525 ± 0,075 mm d’épaisseur, à l’aide d’un réactif de durcissement à la lumière UV (figure 2A).

2. Injection d’AAV

1. Préparation de l’appareil d’injection
   1. Placer une pipette en verre reliée à une seringue Hamilton de 26 G à travers un tube sur un porte-pipette d’un instrument stéréotaxique, puis incliner le porte-pipette de 60° vers l’avant par rapport à l’axe vertical (figure 1A,B).
   2. Remplissez la pipette en verre, la seringue et le tube de raccordement avec de la paraffine liquide. Placez la seringue sur un micro-injecteur.
2. Intervention chirurgicale
   NOTE: La chirurgie suivante a été effectuée dans une cabine stérilisée. Un stéréomicroscope a été utilisé pour la chirurgie si nécessaire.
   1. Anesthésier une souris CX3CR1-EGFP mâle (informations détaillées dans le tableau des matériaux) à l’âge de 7 à 8 semaines (poids corporel 22-26 g) avec 3% d’isoflurane dans une chambre étanche aux gaz. Après 3 min, sortez la souris de la chambre lorsqu’elle perd son mouvement volontaire sauf la respiration, puis passez à une anesthésie continue par un tube nasal contenant 2% d’isoflurane.
      REMARQUE: L’isoflurane est connu pour activer la microglie. Cependant, comme l’imagerie est effectuée 4 semaines après la chirurgie, il n’y a aucun effet de l’isoflurane sur les souris pendant l’imagerie. Bien que l’anesthésie à l’isoflurane soit utilisée pendant quelques minutes lorsque les souris sont placées dans l’instrument stéréotaxique avant l’imagerie (étape 4.2.1), nous avons constaté que l’effet de cette anesthésie courte est négligeable.
   2. Pendant la chirurgie, gardez la souris au chaud avec un coussin chauffant à 37 °C pour prévenir l’hypothermie. Appliquer une pommade oculaire sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse cornéenne et administrer une injection de méloxicam, par voie sous-cutanée (5 mg / kg). Fixez la souris à une barre d’oreille auxiliaire, puis fixez la souris sur l’instrument stéréotaxique avec son côté dorsal vers le haut.
   3. Ajustez la concentration d’isoflurane à un pourcentage approprié (1%-2%) pendant la chirurgie tout en surveillant la respiration et la fréquence cardiaque. Enlevez les cheveux à l’aide d’une crème dépilatoire et désinfectez la tête plusieurs fois dans un mouvement circulaire avec un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine et de l’alcool. Ensuite, injectez 0,1 mL de lidocaïne à 1% par voie sous-cutanée et appliquez des champs stériles pour sécuriser le site chirurgical.
   4. Inciser le cuir chevelu ouvert le long de la ligne médiane avec des ciseaux et faire l’incision d’environ 2 cm de long, pour assurer une bonne exposition du crâne au-dessus du cortex visuel primaire droit. Après l’incision du cuir chevelu, irriguez la tête avec une solution saline tout au long de la procédure pour empêcher le crâne et le cerveau exposés de sécher.
   5. Retirez le périoste sur le crâne exposé à l’aide d’une pince. Percez le crâne sur les coordonnées stéréotaxiques : 3 mm latéralement à la ligne médiane, 0,5 mm en avant de la ligne lambda, pour créer un petit trou d’environ 0,5 mm de diamètre. Rincez le sang et les débris tissulaires du foret, si nécessaire.
   6. Remplir la pipette en verre avec 1 μL de rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 en utilisant la procédure suivante à un titre de 8,3 x 10¹² génomes vectoriels/mL²².
      1. Avancer la seringue pour éjecter 1 μL de paraffine liquide de la pipette en verre. Placez un morceau de film transparent, d’environ 2 cm x 2 cm, sur le crâne exposé de la souris et expulsez une gouttelette de 1 μL de solution AAV sur le film à l’aide d’un pipeteur.
      2. Placez l’embout de la pipette en verre dans la gouttelette de solution AAV sur le film et tirez doucement la seringue pour aspirer la solution AAV. Après l’éjection, tournez le robinet d’arrêt en forme de T pour relâcher la pression à l’intérieur du tube et de la pipette en verre.
   7. Insérez la pipette en verre à une profondeur de 500 μm de la surface du cerveau à travers le trou créé à l’étape 2.2.5, puis injectez 0,5 μL de solution AAV à l’aide du micro-injecteur (Figure 1C). Utiliser le débit volumique d’injection de 2,0 μL/h; une injection de 0,5 μL prend 15 min, puis attend 5 min.
   8. Après l’injection, retirez doucement la pipette en verre et rincez la surface du cerveau avec une solution saline.

3. Implantation de fenêtre crânienne

REMARQUE: L’implantation de la fenêtre crânienne suit l’injection d’AAV le même jour.

1. Marquez un cercle de 2,5 mm de diamètre sur le crâne, centré latéralement à 3 mm du lambda. Créez une rainure circulaire le long de la marque sur le crâne en perçant. Nettoyez les débris car cela pourrait nuire à la visibilité du crâne et appliquez une solution saline pendant le processus de forage pour éviter le chauffage.
2. Pour vérifier si la profondeur de perçage dans la rainure circulaire est suffisante pour enlever le fragment de crâne central, appuyez doucement sur le crâne central avec une pince. S’il se déplace verticalement avec peu de résistance, la profondeur de forage est suffisante.
3. Lorsque la rainure atteint une profondeur suffisante, insérez l’extrémité de la pince dans le bas du fragment de crâne central et soulevez-la doucement et retirez-la pour exposer la surface du cerveau (Figure 1D).
4. À l’aide d’une aiguille de 27 G, piquer et déchirer la dure-mère au bord de la surface exposée du cerveau. Insérez la pointe de la pince à travers le trou fait au bord de la dure-mère. Tenez la dure-mère et décollez-la pour exposer la surface du cerveau.
   REMARQUE: En cas de saignement, rincer la surface du cerveau avec une solution saline jusqu’à ce que le saignement cesse.
5. À l’aide d’une pince, dispersez les fibres hémostatiques une par une dans une solution saline dans une boîte de 3,5 mm, puis placez les fibres hémostatiques le long des marges du trou dans lequel la dure-mère transectée est présente.
6. Placez une fenêtre crânienne préparée à l’étape 1.3 sur la surface exposée du cerveau, puis collez-la au crâne avec de la colle instantanée tout en appuyant doucement sur la fenêtre afin que la fenêtre soit en contact étroit avec le crâne.
7. Ensuite, appliquez de la colle instantanée sur tout le crâne exposé, puis fixez soigneusement une plaque de tête sur le crâne de sorte que la fenêtre se situe au centre du trou carré de la plaque de tête (Figure 2C). Assurez-vous que la surface de la plaque de tête est parallèle à la surface de la fenêtre en verre.
8. Une fois que la colle a suffisamment durci, appliquez du ciment dentaire sur le crâne exposé pour renforcer la fixation entre la tête et la plaque de tête (Figure 2).
   REMARQUE: Si les expériences comprennent la présentation de stimuli visuels à des souris, la lumière parasite vers la zone d’imagerie doit être évitée. Il est conseillé de noircir le ciment en le mélangeant avec le charbon actif pour la réduction de la réflexion de la lumière.
9. Retirez la souris de l’anesthésie après que le ciment a suffisamment durci (environ 20 min). Ensuite, mettez la souris dans une nouvelle cage pour récupérer seule.
10. Après avoir confirmé sa conscience et son mouvement volontaire, indiquant un rétablissement complet, remettez la souris dans la cage familiale. Pendant la récupération, administrer une deuxième dose, ou plus si nécessaire, de méloxicam (une fois toutes les 24 heures pendant 1 à 3 jours) si des comportements évidents indiquant la douleur se produisent.

4. Imagerie in vivo à deux photons de la microglie et de la dynamique calcique neuronale

1. Habituation des souris à l’appareil de microscope
   1. Trois semaines après la chirurgie, induisez une anesthésie chez la souris avec 3% d’isoflurane et placez la souris sous la lentille de l’objectif 25x d’un microscope à deux photons à l’aide d’un instrument stéréotaxique sur mesure (Figure 3C). Pour la configuration ici, la souris est placée sur le dessus d’un tapis roulant et autorisée à fonctionner librement.
   2. Environ 10 minutes plus tard, retirez la souris de l’étape du microscope et ramenez-la dans la cage de la maison. Répétez l’accoutumance au moins 3 fois tous les deux jours avant l’acquisition d’images à deux photons.
2. Acquisition d’images à deux photons
   REMARQUE: Nous recommandons d’effectuer l’acquisition d’image plus de 4 semaines après la chirurgie, car l’activation microgliale revient progressivement au niveau basal.
   1. Comme à l’étape 4.1, induire une anesthésie chez la souris avec 3% d’isoflurane et placer la souris sous la lentille objective du microscope à deux photons à l’aide d’un instrument stéréotaxique sur mesure.
   2. Installez le dispositif d’ombrage sur mesure et un moniteur LCD pour la stimulation visuelle comme décrit ci-dessous (Figure 3D).
      1. Positionnez la lentille pour qu’elle fasse la mise au point sur la surface du cerveau, puis définissez cette position de lentille sur la position Z d’origine. Gardez les coordonnées x-y constantes et élevez l’objectif de l’objectif; Retirez la souris et l’instrument stéréotaxique de l’objectif et du tapis roulant.
      2. Fixez un dispositif d’ombrage sur le dessus de la plaque de tête en utilisant du silicone, qui est noirci en mélangeant avec de la poudre de charbon de bois, et assurez-vous que l’espace entre la plaque de tête et le dispositif d’ombrage est bien scellé.
      3. Remplissez le dispositif d’ombrage avec de l’eau distillée, puis fixez à nouveau la souris et le cadre stéréotaxique sous l’objectif et sur le tapis roulant. Réinitialisez soigneusement le plan focal à la surface du cerveau, en vérifiant la profondeur de la lentille de l’objectif.
         REMARQUE: Pour éviter le risque d’endommager l’objectif de l’objectif, définissez d’abord les coordonnées xyz, puis appliquez le dispositif d’ombrage de l’objectif d’objectif. Il est également raisonnable d’installer d’abord le couvercle, puis d’ajuster les coordonnées, mais une manipulation prudente est nécessaire pour cette option.
      4. Recouvrez la lentille de l’objectif avec une feuille d’aluminium noire pour éviter la contamination lumineuse du moniteur LCD utilisé pour la stimulation visuelle à travers la lentille de l’objectif (Figure 3D). Réglez un moniteur LCD de 10 pouces à 12,5 cm devant les yeux de la souris pour présenter des stimuli visuels (Figure 3D).
   3. Configurez les filtres de collecte des émissions de fluorescence sur la fluorescence EGFP (filtre d’émission 525/50 nm) et la fluorescence R-CaMP (filtre d’émission 593/46 nm) et la longueur d’onde d’excitation sur 1 000 nm. Acquérir des images avec une résolution spatiale de 0,25 μm/pixel à l’aide d’un objectif 25x 1,1 NA et de PMT GaAsP.
   4. Trouvez la région d’imagerie dans laquelle les neurones R-CaMP(+) et la microglie EGFP(+) peuvent être imagés simultanément dans la couche 2/3. Pour cette configuration, les données obtenues dans la figure 4 et la vidéo 1 étaient à une profondeur de 100 μm de la surface piale, en utilisant un aperçu d’image en direct. Maintenez la puissance du laser d’excitation aussi faible que possible pour éviter le photoblanchiment et les dommages causés par l’augmentation de la température locale dans la région d’imagerie.
   5. Acquérir des images à la fréquence d’images de 30 Hz. Simultanément à l’acquisition d’image, présenter un stimulus visuel à dérive-réseau à 100% de contraste, 1,5 Hz, 0,04 cycles par degré dans 12 directions à 6 orientations de 0° à 150° par pas de 30° à la souris¹⁷.
   6. Après l’acquisition de l’image, retirez la souris de l’étage du microscope, détachez le dispositif d’ombrage et l’instrument stéréotaxique de la souris et remettez la souris dans sa cage d’origine.
3. Enregistrement des données
   1. Convertissez et enregistrez les données d’image acquises (format nd2 dans ce cas) sous forme de fichiers d’image tiff pour chaque canal de couleur, en utilisant Fiji ou le logiciel fourni avec le microscope.
   2. Appliquez Turboreg, un plugin des Fidji, pour effectuer l’enregistrement avec mode = traduction. Utilisez l’image moyennée comme image de référence avec les fichiers image tiff du canal EGFP.
   3. Effectuez le traitement suivant pour chaque image à l’aide de MATLAB.
      REMARQUE: Bien que MATLAB soit utilisé dans le traitement suivant, la description se concentre principalement sur l’intention de chaque étape afin que les données puissent être analysées par d’autres logiciels de programmation tels que Python.
      1. Utilisez la fonction imread pour lire deux images tiff EGFP avant et après l’enregistrement de la même image, respectivement. Utilisez la fonction imread pour lire l’image tiff R-CaMP de la même image.
      2. Utilisez la fonction normcorr2 pour calculer la fonction de corrélation entre les variables vectorisées des deux images GFP lues à l’étape 4.3.3.1.
      3. Utilisez la fonction max pour détecter l’index linéaire avec la corrélation croisée la plus élevée de la fonction de corrélation, puis utilisez la fonction ind2sub pour calculer la position de mouvement de l’image enregistrée à partir de son image d’origine.
      4. Utilisez la fonction imwarp pour traduire l’image R-CaMP à la position calculée à l’étape 4.3.3.3, puis utilisez la fonction imwrite pour enregistrer l’image enregistrée de R-CaMP.
4. Génération de traces de calcium
   1. Effectuez le traitement suivant à l’aide de MATLAB. Utilisez la fonction imread pour lire toutes les images tiff R-CaMP enregistrées générées à l’étape 4.3.3.4. Si les images enregistrées ont déjà été chargées en tant que variable dans l’espace de travail, omettez cette étape.
   2. Utilisez la fonction moyenne pour générer une image de projection temporelle. Utilisez la fonction imshow pour afficher l’image moyennée sous forme de figure; utiliser la fonction roipoly pour générer un masque ROI binaire de la structure cible (colonne vertébrale dendritique dans ces données).
   3. En utilisant la fonction moyenne avec les images obtenues en multipliant le masque binaire par des images de chaque image comme variables d’entrée, calculez l’intensité de fluorescence moyenne dans le ROI pour chaque image.
   4. Comme décrit précédemment¹⁷, à la variable obtenue à l’étape 4.4.3, appliquer le filtre de fréquence de valeur du beurre à la coupure = 1,6 s, pour couper le bruit à haute fréquence, puis appliquer le filtre médian coulissant à la fenêtre de temps = 200 s, pour couper le bruit à basse fréquence.

Nous avons effectué l’injection d’AAV et l’implantation de la fenêtre crânienne dans V1 d’une souris transgénique CX3XR1-EGFP âgée de 8 semaines, comme décrit dans ce protocole. Quatre semaines après la chirurgie, nous avons réalisé simultanément une imagerie in vivo à deux photons de l’activité neuronale basée sur R-CaMP et de la dynamique microgliale dans la couche 2/3 de V1 (Figure 4 et Vidéo 1). Pendant l’imagerie, la souris a été placée sur un tapis roulant et autorisée à courir librement. Les images ont été acquises à la fréquence d’images de 30 Hz avec une résolution spatiale de 0,25 μm/pixel en utilisant un objectif 25x, 1,1 NA et des PMT GaAsP. EGFP et R-CaMP ont été excités à une longueur d’onde de 1 000 nm, et la fluorescence EGFP (filtre d’émission 525/50 nm) et la fluorescence R-CaMP (filtre d’émission 593/46 nm) ont été collectées simultanément. Après l’enregistrement des données acquises pour minimiser les artefacts de mouvement, toutes les quatre images ont été moyennées en une seule image pour réduire le bruit de fond. Des stimuli visuels râpés ont été présentés à la souris, et les réponses visuelles des neurones et des épines dendritiques individuelles ont été analysées (Figure 4D). Les processus microgliaux ont montré une dynamique rapide et ont changé leur morphologie en 10 s (Figure 4E et Vidéo 1). Comme détaillé dans la section Discussion, lorsque l’injection AAV a échoué, l’expression de R-CaMP n’a pas pu être détectée. Si la chirurgie n’a pas réussi, les signaux de l’EGFP et du R-CaMP n’ont pas pu être observés.

Figure 1 : Injection d’AAV. (A) Une pipette en verre a été connectée à une seringue Hamilton de 26 G à l’aide d’un tube en silicium. (B) La mise en place pour l’injection d’AAV. (C) La solution AAV a été injectée à l’aide de la pipette en verre inclinée de 60° vers l’avant par rapport à l’axe vertical. (D) Schéma de principe de la procédure du crâne ouvert (décrit à l’étape 3.3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Fenêtre crânienne et plaque de tête. (A) Schéma de principe de l’implantation de la fenêtre crânienne. B) Des plaques de tête sur mesure ont été utilisées. Pour l’imagerie dans l’hémisphère droit, le bras le plus court doit être utilisé du côté droit. (C) Vue dorsale d’une souris avec une fenêtre crânienne et une plaque de tête implantée. (D) Vue à fort grossissement de la fenêtre crânienne illustrée à la figure 2C. E) Vue dorsale d’une souris fixée à l’aide de l’instrument stéréotaxique fait sur mesure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Mise en place de l’imagerie in vivo à deux photons. A) Vue dorsale du dispositif d’ombrage. (B) Vue latérale du dispositif d’ombrage. (C) Vue d’une souris avec le dispositif d’ombrage sur la plaque de tête sous la lentille de l’objectif. La souris est placée sur le tapis roulant. (D) Vue au microscope d’excitation à deux photons. Un moniteur présentant des stimuli visuels est placé sur le côté droit de la figure. La lentille de l’objectif est recouverte du dispositif d’ombrage et d’une feuille d’aluminium noire pour éviter la lumière du moniteur à la lentille de l’objectif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Dynamique microgliale et réponses visuelles dans une colonne vertébrale dendritique. (A-C) Images moyennées dans le temps de la microglie EGFP(+) et des neurones R-CaMP(+) dans la couche 2/3 de V1 chez une souris transgénique CX3XR1-EGFP âgée de 12 semaines. L’intensité du signal dans chaque canal a été normalisée indépendamment. (D) Réponses visuelles dans une colonne vertébrale dendritique. Les diagrammes de bandes avec des flèches noires indiquent la direction des stimuli de réseau présentés dans le timing indiqué par des colonnes grises. Dans les traces de calcium, les lignes grises indiquent les réponses individuelles et une ligne noire indique leur moyenne. Dans l’encart de droite, une pointe de flèche jaune indique l’épine dendritique dans laquelle la région d’intérêt (ROI) a été générée pour acquérir les traces de calcium. (E) Le processus microglial (pointe de flèche cyan) a montré une rétraction rapide en 10 s. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Imagerie biphotonique de l’activité neuronale et de la dynamique microgliale. Données d’imagerie de la microglie EGFP(+) et des neurones R-CaMP(+) dans la couche 2/3 de V1 chez une souris transgénique CX3XR1-EGFP âgée de 12 semaines. Sur le côté gauche du film, le magenta indique R-CaMP dans les neurones et le vert indique EGFP dans la microglie. Le centre du film correspond au signal EGFP et le côté droit correspond au signal R-CaMP. L’intensité du signal dans chaque canal a été normalisée indépendamment. La fréquence d’images du film est 40 fois plus rapide que la fréquence réelle. Barre d’échelle = 10 μm Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.