使用双极电极通过电点燃杏仁核创建颞叶癫痫小鼠模型

Summary

杏仁核在颞叶癫痫中起关键作用，颞叶癫痫起源于该结构并从该结构传播。本文详细介绍了具有记录和刺激功能的深部脑电极的制造。它介绍了源自杏仁核的内侧颞叶癫痫模型。

Abstract

杏仁核是癫痫发作最常见的起源之一，杏仁核小鼠模型对于说明癫痫至关重要。然而，很少有研究详细描述实验方案。本文通过介绍双极电极的制作方法，阐述了杏仁核电点燃癫痫模型制作的全过程。该电极既可以刺激又可以记录，减少因植入单独的电极进行刺激和记录而引起的脑损伤。对于长期脑电图（EEG）记录目的，使用滑环来消除由电缆缠结和脱落引起的记录中断。

在基底外侧杏仁核（AP：1.67毫米，长：2.7毫米，V：4.9毫米）的周期性刺激（60Hz，每15分钟1秒）19.83±5.742次后，在六只小鼠中观察到完全点燃（定义为诱导三次连续V级发作按拉辛量表分类）。在整个点燃过程中记录颅内脑电图，点燃后观察到杏仁核癫痫放电持续20-70 s。因此，这是模拟源自杏仁核的癫痫的稳健方案，该方法适用于揭示杏仁核在颞叶癫痫中的作用。本研究有助于未来颞叶内侧癫痫的机制和新型抗癫痫药物的研究。

Introduction

颞叶癫痫（TLE）是最普遍的癫痫类型，具有转化为耐药性癫痫的高风险。手术，如选择性杏仁核海马切除术，是治疗TLE的有效方法，该病的癫痫发生和发作^{仍在研究中1，2}。TLE的发病机制已被证明不仅发生在海马体中，而且广泛存在于杏仁核^3，4中。例如，杏仁核硬化和杏仁核增大经常被报道为TLE癫痫发作的起源5^，6。杏仁核的重要性不容低估;杏仁核模型对于癫痫发生研究至关重要，迫切需要对该模型进行清晰的说明。

在动物模型中已经提出了几种诱导癫痫发作的方法。过去，惊厥药物在早期阶段腹膜内注射^7。虽然这种方法很方便，但癫痫病灶的位置尚不确定。随着立体定向技术和详细的动物脑图谱的发展，应用颅内药物注射解决了定位问题⁸。然而，在急性期缺乏对严重癫痫发作的干预导致高死亡率，慢性自发性癫痫发作伴有发作间期不稳定和癫痫^{发作频率不稳定}的问题9^，10。最后，开发了电点火方法;该方法周期性地多次刺激特定的大脑区域，允许在明确控制位置和发病时间的情况下诱导癫痫发作¹¹。

这种方法的一个优点是电极的颅内植入是微创的¹²。此外，癫痫发作的严重程度可以通过刺激的终止来控制，从而降低癫痫发作引起的死亡率。这些变化解决了以前方法的缺点。值得注意的是，该模型可以充分模拟人类癫痫发作，并且特别适合癫痫持续状态（SE）的研究，因为它能够快速诱导^SE13。它还可用于抗癫痫药物筛选¹⁴ 和癫痫机制的研究。最后，众所周知，杏仁核与记忆调节、奖励处理和情绪密切相关¹⁵.癫痫患者经常遇到这些精神功能的障碍，因此，杏仁核癫痫模型可能是研究癫痫情绪问题的更好选择¹⁶。

Protocol

该实验得到了首都医科大学宣武医院实验动物伦理委员会的批准。所有小鼠均在首都医科大学宣武医院动物实验室保存。该协议分为四个部分。前两部分介绍了使用滑环连接电极和脑电图记录/刺激设备的电极和电路的构建方法。第三部分描述了电极植入的操作方法，第四部分介绍了用于杏仁核癫痫模型的脑电记录和刺激参数。

1. 电极的制造

1. 准备好以下先前准备好的材料：两根 3 厘米长的特氟龙涂层钨丝（裸直径：76.2 μm）、一根相同长度的银线（裸直径：127 μm）和一组 2 x 2 规格排针。
2. 使用打火机燃烧每根钨丝的一端，以去除 5 毫米的绝缘涂层。
   注意：去除绝缘层的钨丝变黑;钨丝的这一部分被称为上端。
3. 剥下一段超细多股线，从底部到上端缠绕，在那里它开始变黑，继续到顶部。通过捏住一端并轻轻扭转另一端，将这种超细线（具有柔软的质地）与钨丝结合，这使得两种材料可以轻松地缠绕在一起。
4. 轻轻拉动以确保它们被紧紧包裹并切断多余的超细电线。在整个过程中尽量保持钨丝笔直。
5. 将排销固定在焊接台上的夹子上，销的较长一侧朝外。使用注射器针头捡起一些焊膏并将其涂在引脚上。将焊枪加热至320°C;用割炬尖端熔化并涂抹一些无铅锡丝。
6. 将钨丝的上端与排针的一根针重叠，并使用割炬上的焊料将钨丝粘合到引脚上。
   注意：如果没有超细线的帮助，直接将钨丝与引脚焊接是非常困难的。
7. 以相同的方式将另一根钨丝和另一根银线焊接到行销上，使每根线对应于一根针（见 图1，i）。
8. 切割两根比钨丝上端稍长的热缩管。将它们放在两根钨丝的焊点上，确保导电部分完全覆盖在管中，使两根钨丝的电路不串联放置。
   注意：虽然有三根电线，但如果其中两根是绝缘的，三根电线将不会串联;也可以在银线上添加一根管子。
9. 从焊接台夹上取下电极，用大钳子轻轻握住电极，因为在加热热缩管时电极容易变形，使用导热性好的夹具，用力稍大。
10. 打开风管并加热，直到达到 320 °C 的温度。吹气热缩管几秒钟，直到其拧紧（见 图1，ii）。
11. 如果在焊接过程中针头与塑料主体分离，请用热熔胶拼接焊接部件和塑料主体（见 图1，iii）。注意不要将其涂抹在接口上，因为这会影响接口插入。
12. 握住两根钨丝并将它们扭在一起，使它们的两端分开（见 图 1，iv）。将双绞钨丝修剪至约 10 毫米长，使两端的间距不超过 0.5 毫米。
    注意：此步骤也可以在电极植入之前执行，以便灵活调整电极长度。
13. 加热胶枪并将胶水均匀地涂在电极周围。
14. 用万用表检查电极：将万用表的一根棒放在排针的未焊接侧，轻轻地将钨丝或银线的末端接触另一根，检查电路是否光滑。确保线条未串联放置。

2. 滑环连接及电路说明

注意：当小鼠上的电极在自由移动的状态下通过电缆 插入 EEG设备时，随着小鼠的移动和转动，电缆可能会缠结在一起。这会导致电缆变短，最终阻碍小鼠移动或导致电缆从头上掉下来。在这里描述的方法中，引入了一个四通道滑环以防止电缆脱落。四个通道在 图1B中以四种颜色表示。

1. 在两端撕下 5 毫米的绝缘皮，露出里面的金属线。
2. 在每根定子线上添加一段热缩管。
3. 用EEG设备连接器插头焊接每根电线。
4. 用热空气收缩热缩管。
5. 在每根转子线上添加一段热缩管。
6. 将红色和橙色电线的导电部件拧在一起，并将它们焊接到针座中的接头上以适合行销。
7. 将接头上的其他两根电线焊接到每个接头上。
   注意：对应于银线的棕色通道连接到EEG设备以进行接地。红色和橙色通道接收来自同一根钨丝的信号，橙色通道用作EEG设备的参考。红色通道中的信号毫无意义，但它们必须与黑色通道共存才能形成电流刺激。黑色通道中的信号是大脑中的真实电信号。不同的电路可以设计多通道滑环，以适应不同的设备。

3. 植入手术

1. 动物
   1. 使用8周龄的C57BL / 6野生型雄性小鼠，重24-26g，进行手术。
   2. 将它们安置在温度受控环境（22±1°C）中12小时明暗循环（光照时间：8：00-20：00），并 随意提供水和饲料。
   3. 在手术过程中使用额外的加热垫来保持动物温暖。
   4. 手术后，皮下注射美洛昔康（10mg / kg）作为镇痛药的第一次给药。然后，将动物放在单独的笼子中以优化恢复。手术后第一周将美洛昔康添加到动物的饮食中。
   5. 实验结束后，在麻醉下向小鼠的左心室注入4%多聚甲醛，并收集脑组织以对电极靶标进行组织学验证。
2. 称量小鼠并通过腹膜内注射1%戊巴比妥溶液麻醉。通过高压灭菌对所有要使用的手术器械和耗材进行消毒，包括钻头、电极、牙科水泥等。
3. 当鼠标完全麻醉后，用剃须刀将头发从眼睛剃到耳朵区域。
4. 将鼠标固定在立体定位框架上。将前上牙放入门牙杆，并将两个耳杆均匀地深深插入耳朵。将红霉素眼膏涂抹在眼睛上，以防止手术过程中因强光而引起的干燥和失明。
5. 用三支碘伏和75%酒精的交替拭子以圆周运动对手术区域进行消毒。然后，从该切口的中间向前做一个矢状切口，并切掉切口两侧的皮肤以创建一个三角形窗口。
6. 将一小块棉花卷成球状，用3%的过氧化氢润湿。用小棉球轻轻摩擦暴露区域，直到清晰地看到前囟门和后囟门，以去除附着在颅骨上的软组织。
7. 调整前后高度，使前囟门和后囟处于水平位置。将前囟门的位置视为轴的原点。
8. 将不锈钢螺钉固定在左小脑头骨上，使用钻头形成平坦的表面。确保螺钉突出颅骨一半。
9. 确保杏仁核点燃的坐标距后侧 −1.67 毫米、横向坐标和距前侧点 −4.9 毫米腹侧坐标。调整立体定位装置以定位该点并标记它。
10. 用直径为0.5毫米的颅骨钻在标记点上钻一个孔。
11. 将电极固定在立体定位装置的定位杆上，将电极垂直放置在孔上方，然后将位置缓慢降至 −4.9 mm。将银线缠绕在螺钉上三次，注意在操作过程中不要晃动电极体。
12. 混合牙科水泥并将其轻轻涂抹在电极和颅骨表面。当牙科水泥硬化时，修改外部，直到包围固定电极的水泥变成锥体。
13. 当水泥硬化后，将电极从立体定位装置中释放出来。皮下给予美洛昔康10mg/kg，以缓解动物疼痛引起的不适。在手术后第一周将美洛昔康施用于动物性食物以产生镇痛作用。取出鼠标并将其放回笼子中，将其与其他小鼠分开。

4. 电火

1. 在点燃之前，让小鼠在手术后休息至少 1 周，以便术后恢复并让炎症消退。
   注意：一般来说，没有充分恢复的老鼠对点燃反应不佳。
2. 将鼠标放入定制的盒子中，滑环电缆连接鼠标头上的电极和脑电图设备。将电缆穿过盒子盖上的一个孔，并调整盒子中剩余的长度，让鼠标自由移动。
3. 打开脑电图设备并检查其是否正常工作。将刺激器设置为在 1 秒的列车持续时间内以 60 Hz 提供 1 ms 单相方波脉冲。
4. 第一次刺激的电流强度为50μA;监测出院后的脑电图，其特征是高频尖峰。如果没有观察到放电后，则向下一个刺激物添加25μA，并每10分钟继续此过程，直到观察到放电后并持续5秒。
   注意：如果实验不需要放电，则可以跳过步骤4.4;300 μA 的强度足以点燃。
5. 每15分钟用步骤4.3中确定的电流强度刺激小鼠，每天不超过20次。
6. 监测对刺激的行为反应。
   注意：连续三次V级发作的发生被认为是完全点燃的，结合拉辛等级标准¹⁷。

Representative Results

电极和电路能够记录脑电图并起到刺激作用（图1）;这种设置避免了分别植入记录和刺激电极的复杂性，并最大限度地减少了对脑组织的损害。滑环的应用允许电极与所有类型的设备连接。

我们对6只健康的成年雄性C57BL / 6小鼠进行了电极植入手术，并在手术后2周进行了电刺激。行为癫痫发作水平随着刺激次数的增加而逐渐增加，分级基于拉辛量表：1 =口腔或面部自动;2 = 两个或更少的肌阵挛性抽搐;3 = 三个或更多肌阵挛抽搐和/或前肢阵挛;4 = 强直阵挛前肢和背部伸展;5 = 强直阵挛性前肢和背部伸展，伴有抬起和塌陷;6 = 强直阵挛性前肢和背部伸展伴狂奔或跳跃¹⁴.记录完全点火所需的刺激次数（表1）。

完全点燃后用于刺激的脑电图的代表性结果如图 2所示。后放电持续5-15秒;然后，颅内自发分泌物加剧，行为症状开始。癫痫发作持续时间通常小于1分钟，这降低了导致呼吸暂停的严重抽搐导致的死亡风险。

完全点燃后2小时通过免疫组织化学检测脑组织中c-Fos的表达（图3）;使用c-Fos抗体和Alexa Fluor 488偶联的驴抗兔IgG。结果表明，c-Fos在同侧杏仁核中的表达显著增加，验证了该模型的可行性。

所有动物在实验结束时都进行了组织学验证，以确保刺激目标准确，电极路径如图 4所示。

图 1：电极制造的关键步骤。 （A） 不同步骤电极的外观;相应的步骤在图表上标记。（B）滑环连接到接口插头;母头电路显示在插图中（右上角）。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处查看此图的大图。

图2：脑电图的代表性结果。 请点击此处查看此图的大图。

图3：杏仁核中的c-Fos表达。 杏仁核神经元中的c-Fos（绿色）;DAPI（蓝色）标记细胞核;比例尺 = 100 μm。 （A）同侧杏仁核中的c-Fos;（B）对侧杏仁核中的c-Fos。缩写：DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯吲哚。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：电极路径的组织学验证。 红色箭头指向电极轨迹，白色虚线椭圆形是杏仁核。 请点击此处查看此图的大图。

	1	2	3	4	5	6
刺激次数	24	12	18	21	16	28
	平均： 19.83 标准差： 5.742

表1：六只小鼠中每只完全点燃所需的刺激次数。

Discussion

癫痫是一组表现多样、病因多样的疾病¹⁸;应该注意的是，没有单一的模型可以用于所有类型的癫痫，研究人员必须为他们的特定研究选择合适的模型。本研究介绍了一种最容易获得的电极制造方法。该方法的各个部分可以进行调整以适应不同的实验条件。

该方法利用具有刺激和记录功能的电极，减少了植入单独的电极进行刺激和脑电图记录对动物大脑造成的伤害。在制造电极时，可以选择不同尺寸的行销。巨型排针可以最牢固地连接到滑环。但是，可能需要在动物的头部植入多个物体;在这种情况下，可以选择小排引脚，因为它们占用的空间更小，更易于操作，并且可以使用多通道滑环来连接所有植入的电极。滑环可以焊接不同类型的接口，以满足不同实验室脑电设备的需求。此外，它们允许动物自由移动而不会缠绕电缆。

为了确保电极不会长时间脱落，有必要在头骨完全干燥后应用牙科水泥。提前在头骨表面进行一些水平和垂直切割也可以增加硬度。手术后，动物必须恢复至少一周才能让炎症消退，并且可以酌情使用抗炎药来帮助恢复。不建议在本周进行其他实验。

尽管这种方法有其优点，但该方法有几个局限性。由于小鼠大脑的体积小，在立体定向手术¹³期间，电极可能无法准确地嵌入目标位置。与其他建模方法相比，该方法要求动物长时间携带植入物;这不可避免地会对动物产生影响。例如，我们发现动物经常因为不舒服而挠头。

该方法可与多种技术结合使用，如电生理学¹⁹、膜片钳²⁰ 和光遗传学技术;然而，它不适用于使用闭环刺激的实验²¹。使用相同的刺激参数的方法可能不代表自然自发性癫痫发作，这意味着它们不适合机器学习。综上所述，这种电点火方法排除了药物代谢对实验的影响，可及、稳定、可靠，广泛适用于许多研究。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	invitrogen	A-21206
c-Fos antibody		ab222699
Cranial drill	SANS	SA302
dental cement	NISSIN
EEG recording and stimulation equipment	Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd	NSHHFS-210803
lead-free tin wire	BAKON
Pin header/Female header	XIANMISI		spacing of 1.27 mm
Silver wire	A-M systems	786000
Slip ring	Senring Electronics Co.,Ltd	SNM008-04
Tungsten wire	A-M systems	796000
ultrafine multi-stand wire	Shenzhen Chengxing wire and cable	UL10064-FEP
welding equipment	BAKON	BK881