Imagem por Tomografia por Emissão de Pósitrons do Tráfico Celular: Um Método de Radiomarcação Celular

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo para radiomarcar células com um radioisótopo de tomografia por emissão de pósitrons (PET), 89 Zr (t_1/2 78,4 h), usando um sintetizador de radiomarcação pronto para uso, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([⁸⁹Zr]Zr-DBN). A radiomarcação de células com [⁸⁹Zr]Zr-DBN permite rastreamento não invasivo e imagens de células radiomarcadas administradas no corpo com PET por até 7 dias após a administração.

Resumo

Terapias com células-tronco e receptores de antígenos quiméricos (CAR) estão emergindo como terapêuticas promissoras para regeneração de órgãos e como imunoterapia para vários tipos de câncer. Apesar de avanços significativos nessas áreas, ainda há muito a ser aprendido para melhor compreender a farmacocinética e farmacodinâmica das células terapêuticas administradas no sistema vivo. Para rastreamento in vivo não invasivo de células com tomografia por emissão de pósitrons (PET), um novo método de radiomarcação celular mediado por [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89 Zr]Zr-DBN) foi desenvolvido utilizando ⁸⁹Zr (t_1/2 78,4 h). O presente protocolo descreve um sintetizador radiomarcador mediado por [⁸⁹Zr]Zr-DBN, pronto para uso, para marcação direta de uma variedade de células, incluindo células-tronco mesenquimais, células-tronco cardiopoéticas guiadas por linhagem, hepatócitos em regeneração hepática, glóbulos brancos, células de melanoma e células dendríticas. A metodologia desenvolvida permite imagens PET não invasivas do tráfego celular por até 7 dias após a administração sem afetar a natureza ou a função das células radiomarcadas. Além disso, este protocolo descreve um método passo a passo para a radiossíntese de [89 Zr]Zr-DBN, formulação biocompatível de [89 Zr]Zr-DBN, preparação de células para radiomarcação e, finalmente, a radiomarcação de células com [⁸⁹Zr]Zr-DBN, incluindo todos os detalhes intrincados necessários para o sucesso da radiomarcação de células.

Introdução

As terapias com células-tronco e receptores de antígenos quiméricos (CAR) estão ganhando popularidade e estão sob investigação ativa para o tratamento de várias doenças, como insuficiência miocárdica^1,2, degeneração retiniana 2, degeneração macular 2, diabetes ², infarto do miocárdio 3,4,5 e cânceres 6,7,8,9^,....

Protocolo

Células dendríticas e células de melanoma foram obtidas comercialmente¹⁸. Hepatócitos foram isolados do fígado de suínos após hepatectomia parcial laparoscópica^22,24. Células-tronco foram isoladas de aspirados de medula óssea^18,19,26. As células-tronco derivadas do tecido adiposo foram obtidas do Laboratório de Terapia Celular Humana, Mayo Clinic Rochester²³. Os leucócitos humanos foram isolados do sangue coletado recebido da Divisão de Medicina Transfusional da Mayo Cli....

Resultados

Os resultados representativos apresentados neste manuscrito foram compilados dos estudos prévios de síntese de [⁸⁹Zr]Zr-DBN e radiomarcação celular 18,19,22,23,24,25. Em resumo, ⁸⁹Zr podem ser complexados com sucesso com DFO-Bn-NCS em ~30-60 min a 25-37 °C usando 7,5-15 μg de DFO-Bn-NCS (Tabela 2.......

Discussão

A seguir estão etapas críticas no protocolo que precisam de otimização para uma marcação radiográfica celular eficaz. Nas etapas 1.2 e 1.3 do protocolo, dependendo do volume de [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ ou [⁸⁹Zr]ZrCl₄ empregado, um volume apropriado (microlitros) de base deve ser usado; A solução 1,0 M K2 CO 3 deve ser usada para a neutralização da solução de [89 Zr]Zr(HPO 4)2 e 1,0 M Na₂ CO₃ para a neutralização de [

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acetonitrila	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA	A996-4
Meio Mínimo Essencial Alfa	Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA	12571063
Coluna de troca de ânions	Macherey-Nagel, Inc., Dü ren, Alemanha	731876	Chromafix 30-PS-HCO3  Cartucho SPE 45 mg
Tubos de centrífuga cônicos (15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, EUA	352096	Falcon Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno (PP) de alta clareza de 15 mL
Células dendríticas	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, EUA	B-705	p-SCN-Bn-Deferoxamina
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
Calibrador de Dose	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, EUA	5130-3234	CRC -55tR Calibrador de Dose
Dulbecco' s Águia modificada' s médio	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS)	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	14025092	H-HBSS
(grau de base de metal traço)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA	A508P212
Células de melanoma	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA	CRL-6475
Metanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
Tubo de microcentrífuga	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha	30108442	Tubo de microcentrífuga Protein LoBind
Murine GM-CSF	R& D Systems, Inc., Minneapolis, MN EUA	415-ML-010
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA	15140-122
Solução salina tamponada com fosfato sem Ca2+ e Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA	10010023	Para lavar células
Solução salina	Covidien LLC, Mansfield, MA, EUA	1020	Agitador de Solução Salina Estéril 0.9%
	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha	T1317	Thermomixer
Silica gel-rad-TLC folha de papel	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EUA	SGI0001	iTLC-SG

Para preparação de ácido clorídrico