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Artigo de método

Construção de um Modelo de Organ-On-A-Chip de Células Musculares Lisas da Aorta Humana para Recapitulação da Deformação Biomecânica na Parede Aórtica

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DOI:

10.3791/64122

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6 de julho de 2022

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1Department of Cardiac Surgery and Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, 2Institutes of Biomedical Sciences and the Shanghai Key Laboratory of Medical Epigenetics, Shanghai Medical College, Fudan University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, desenvolvemos um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip para replicar a cepa biomecânica in vivo de células musculares lisas na parede da aorta humana.

Resumo

Técnicas convencionais de cultura de células bidimensionais e modelos animais têm sido utilizados no estudo do aneurisma e dissecção da aorta torácica humana (TAAD). No entanto, o TAAD humano às vezes não pode ser caracterizado por modelos animais. Há uma aparente lacuna de espécies entre estudos clínicos em humanos e experimentos com animais que podem dificultar a descoberta de drogas terapêuticas. Em contraste, o modelo convencional de cultura celular é incapaz de simular estímulos biomecânicos in vivo. Para este fim, a microfabricação e as técnicas microfluídicas se desenvolveram muito nos últimos anos, fornecendo novas técnicas para o estabelecimento de modelos de organoides em um chip que replicam o microambiente biomecânico. Neste estudo, um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip (HASMC-OOC) foi desenvolvido para simular os parâmetros fisiopatológicos da biomecânica da aorta, incluindo a amplitude e a frequência da tensão cíclica experimentada pelas células musculares lisas da aorta humana (HASMCs) que desempenham um papel vital no TAAD. Nesse modelo, a morfologia dos CMHHs tornou-se alongada, alinhada perpendicularmente à direção da deformação e apresentou fenótipo mais contrátil em condições de deformação do que em condições convencionais estáticas. Isso foi consistente com a orientação celular e o fenótipo nas paredes aórticas humanas nativas. Além disso, usando TAAD (BAV-TAAD) relacionados à válvula aórtica bicúspide (BAV-TAAD) e HASMCs primários derivados de TAAD (TAV-TAAD) relacionados à válvula aórtica tricúspide, estabelecemos modelos de doença BAV-TAAD e TAV-TAAD, que replicam as características do HASMC no TAAD. O modelo HASMC-OOC fornece uma nova plataforma in vitro que é complementar aos modelos animais para explorar ainda mais a patogênese do TAAD e descobrir alvos terapêuticos.

Introdução

O aneurisma e dissecção da aorta torácica (DAAT) é uma dilatação ou delaminação localizada da parede aórtica associada a alta morbidade e mortalidade1. As células musculares lisas da aorta humana (HASMCs) desempenham um papel vital na patogênese do TAAD. Os HASMCs não são células terminalmente diferenciadas, e os HASMCs retêm alta plasticidade, permitindo que eles mudem fenótipos em resposta a diferentes estímulos2. As CMSAP são submetidas principalmente à tensão de tração rítmica in vivo, sendo este um dos principais fatores reguladores das alterações morfológicas, diferenciação e funções fisiológicas do músculo liso 3,4. Portanto, o papel da cepa cíclica no estudo das CMHS não pode ser ignorado. No entanto, as culturas convencionais de células 2D não podem replicar a estimulação biomecânica da cepa cíclica experimentada pelos HASMCs in vivo. Além disso, a construção de um modelo de TAAD animal não é adequada para alguns tipos de TAAD, como o TAAD relacionado à válvula aórtica bicúspide (BAV). Além disso, a lacuna de espécies entre estudos clínicos em humanos e experimentos com animais não pode ser ignorada. Dificulta a tradução farmacêutica na prática clínica. Assim, há uma necessidade urgente de sistemas mais complexos e fisiológicos para simular o ambiente biomecânico in vivo na pesquisa de doenças da aorta.

Experimentos com animais usados em pesquisa biomédica e desenvolvimento de medicamentos são caros, demorados e eticamente questionáveis. Além disso, os resultados de estudos em animais frequentemente não conseguem prever os resultados obtidos em ensaios clínicos em humanos 5,6. A falta de modelos pré-clínicos humanos e a alta taxa de falha em ensaios clínicos têm resultado em poucos medicamentos eficazes para a clínica, o que tem aumentado os custos com a assistência à saúde7. Assim, é urgente encontrar outros modelos experimentais que complementem os modelos animais. As técnicas de microfabricação e microfluídica se desenvolveram muito nos últimos anos, fornecendo novas técnicas para o estabelecimento de modelos de organoides em um chip que corrigem as desvantagens das técnicas tradicionais de cultura de células 2D e estabelecem um modelo in vitro mais realista, de baixo custo e eficiente para estudos fisiológicos e desenvolvimento de medicamentos. Usando dispositivos microfluídicos, os órgãos em chips são estabelecidos para cultivar células vivas em câmaras do tamanho de micrômetros com diferentes estímulos para replicar as principais funções de um tecido ou órgão. O sistema consiste em microcanais microfluídicos únicos ou múltiplos, com um tipo de célula cultivada em uma câmara perfundida replicando funções de um tipo de tecido ou diferentes tipos de células cultivadas em membranas porosas para recriar interfaces entre diferentes tecidos. Os organoides microfluídicos combinados com células derivadas de pacientes têm a vantagem única de preencher a grande diferença de espécies entre os modelos de doenças de camundongos e humanos e superar as desvantagens da cultura tradicional de células 2D para pesquisa de mecanismos de doenças e descoberta de medicamentos. Com o rápido desenvolvimento da microfluídica nos últimos anos, os pesquisadores perceberam a utilidade de modelos in vitro organ-on-a-chip (OOC) replicando parâmetros biológicos complexos in vivo 8. Esses organoides microfluídicos simulam ambientes biomecânicos in vitro, como deformação cíclica, tensão de cisalhamento e pressão líquida, proporcionando um ambiente de cultura celular tridimensional (3D). Até o momento, vários modelos de OCO foram estabelecidos para simular estímulos biomecânicos em órgãos como o pulmão9, rim 10, fígado 11, intestino12 e coração 13, mas estes não têm sido amplamente aplicados ao estudo da doença aórtica humana.

Neste estudo, apresentamos um modelo de célula muscular lisa da aorta humana organ-on-a-chip (HASMC-OOC) que pode controlar as forças mecânicas biomiméticas e os ritmos aplicados aos HASMs primários derivados de pacientes com TAAD. O chip consiste em placas espessas de três camadas de polidimetilsiloxano (PDMS) gravadas com canais e duas membranas PDMS altamente flexíveis comercializadas. Os HASMCs são cultivados nas membranas do PDMS. O canal no meio do chip é preenchido com um meio de cultura para cultura celular. Os canais superior e inferior do chip são conectados a um sistema de fornecimento de pressão de vácuo que pode controlar o ritmo e a frequência da tensão de tração mecânica das membranas PDMS. A deformação rítmica experimentada pelos HASMCs pode ser simulada no HASMC-OOC, replicando o microambiente biomecânico de tecido ou órgão não funcionalmente alcançável com sistemas de cultura 2D convencionais. Com a vantagem de imagens de alta resolução, em tempo real e microambiente biomecânico, as atividades bioquímicas, genéticas e metabólicas das células vivas podem ser estudadas para o desenvolvimento de tecidos, fisiologia de órgãos, etiologia da doença, mecanismos moleculares e identificação de biomarcadores, doenças cardiovasculares e doenças da aorta. Combinado com células específicas de tecidos e pacientes, esse sistema pode ser usado para triagem de drogas, medicina personalizada e testes de toxicidade. Este modelo HASMC-OOC fornece uma nova plataforma in vitro para estudar a patogênese da doença aórtica.

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Protocolo

Espécimes aórticos humanos foram utilizados para isolamento primário do HASMC sob a aprovação do Hospital Zhongshan, Comitê de Ética da Universidade de Fudan (NO. B2020-158). Espécimes de aorta foram coletados de pacientes submetidos à cirurgia de aorta ascendente no Hospital Zhongshan, Universidade de Fudan. O termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de todos os pacientes antes da participação.

1. Isolamento primário das células musculares lisas da aorta humana

  1. Lavar a região lateral direita da aorta ascendente com PBS estéril, 1x-2x.
  2. Remova as camadas íntima e adventícia do tecido com duas pinças oftálmicas e retenha a camada média para colher as células.
  3. Coloque a camada média sobre um prato de cultura de 10 cm e corte-a em pedaços pequenos (2-3 mm) com uma tesoura. Adicionar 5 mL de meio de cultura de células musculares lisas (SMCM) contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.
  4. Mova o pequeno tecido para o frasco de cultura com um conta-gotas estéril, espalhando o tecido uniformemente. Descarte o meio de cultura o máximo possível e, em seguida, inverta a garrafa de cabeça para baixo.
  5. Adicione 2 mL de SMCM no frasco de cultura invertido e coloque-o na incubadora (5% de CO 2) a 37 °C por 1-2 h, depois vire-o lentamente para o lado direito e adicione mais2 mL de SMCM.
  6. Após 5-7 dias de incubação, troque o SMCM por 4 mL de SMCM fresco. Geralmente, as células musculares lisas esporádicas saem em aproximadamente 2 semanas.
  7. Descarte lentamente o SMCM e adicione-o lentamente ao mudar o meio. Transportar o frasco de cultura lentamente ao se mover para uma estação de microscópio; caso contrário, os tecidos flutuarão e as células crescerão lentamente.
  8. Quando as células atingirem aproximadamente 80% de confluência, lavar com 2 mL de PBS, digerir com 2 mL de tripsina a 0,25% e dividi-las em dois novos frascos de cultura com 4 mL de SMCM fresco.
  9. Identificar as células através de uma análise de imunofluorescência de quatro diferentes marcadores específicos para células musculares lisas (CNN1, SM22)14.

2. Preparação do chip PDMS

  1. Para polimerizar o PDMS, adicionar o agente de cura (componente B) à base (componente A) a uma relação de peso de A: B = 10:1 p/p e misturar o complexo completamente por 5 min; o volume depende da necessidade do estudo.
  2. Coloque o gel PDMS preparado em um tanque de extração a vácuo por 30-60 min e mantenha a pressão abaixo de -0,8 mPa.
    NOTA: A alta pressão levará à extração insuficiente de pequenas bolhas dentro do gel PDMS que afetarão a próxima etapa da fabricação de chips.
  3. Usando o software de design assistido por computador (CAD), projete o molde com uma estrutura de estrutura externa de 100 mm × 40 mm × 8 mm e uma estrutura de estrutura externa de 70 mm × 6 mm × 4 mm.
  4. Personalize os moldes das três camadas usando uma máquina de gravação de controle numérico computadorizado de alta precisão. Esculpir a estrutura dos moldes e os microcanais usando placas de polimetilmetacrilato (PMMA) e, em seguida, colá-los em outra placa de PMMA.
  5. Despeje o gel PDMS preparado em um molde com um × de 100 mm × estrutura externa de 6 mm e 70 mm × canal de 6 mm × 4 mm e, em seguida, reticule a 70 °C por 1-2 h.
  6. Retire as placas PDMS reticuladas do molde e corte as membranas PDMS comercializadas em seções de 100 mm × 40 mm.
  7. Trate as três placas PDMS preparadas e duas membranas PDMS com plasma de oxigênio por 5 min para ativação da superfície PDMS. Aplique as seguintes configurações específicas: ar ambiente como gás de processo; pressão ajustada para -100 kPa; atual definido para 180--200 Ma; tensão ajustada para 200 V; tempo de processo até 5 min.
  8. Faça furos nas três lajes PDMS usando um perfurador de furo de 1 mm para fazer a entrada e saída de ar e microcanais médios no chip PDMS.
  9. Unir três lajes PDMS e duas membranas PDMS juntas na ordem: laje PDMS canal de ar (camada superior) - membrana PDMS - laje PDMS de canal médio (camada média) - membrana PDMS - laje PDMS canal de ar (camada inferior). Execute esta etapa sob um microscópio estereoscópico a 4x para sobrepor totalmente os microcanais de ar com os microcanais médios.
  10. Coloque o chip PDMS montado em uma incubadora de 70 °C por 1 h.
  11. Prepare várias mangueiras de látex de 1 mm de diâmetro interno e 3 cm de comprimento. Insira uma agulha de aço inoxidável de 1 mm de diâmetro externo e 1 cm de comprimento em uma extremidade da mangueira preparada e, em seguida, insira um Luer na outra extremidade da mangueira para criar o tubo conectado ao ar e aos microcanais médios do chip PDMS.
  12. Insira os tubos preparados nas saídas e entradas do ar e microcanais médios no chip PDMS.

3. Tratamento de superfície de cavaco PDMS e esterilização

  1. Infundir 2 ml de colagénio de rato de 80 mg/ml no microcanal médio do chip PDMS utilizando uma seringa de 2 ml e incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
  2. Após a incubação, retire o colágeno do canal e recupere com uma seringa de 2 mL. Coloque os cavacos PDMS revestidos de colagénio numa incubadora a 60 °C durante a noite.
  3. Coloque os chips PDMS em um esterilizador UV por mais de 1 h. Coloque os chips PDMS esterilizados em uma bancada ultralimpa em preparação para o experimento celular.

4. Semeadura de células no chip PDMS e processo de alongamento de células

  1. Cultura 4 x 10 5 células musculares lisas humanas primárias (HASMCs) de pacientes usando meio de células musculares lisas (SMCM) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina em uma incubadora de CO2 a5% a 37 °C.
  2. Quando a densidade do CMASA atingir 80%, descarte o SMCM e lave as células com 2 mL de PBS.
  3. Digerir as células usando 1 mL de tripsina a 0,25% por 2 min e centrifugar a 100 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de SMCM fresco. Use 8 mL de SMCM para cultivar as células em um prato de cultura de 10 cm.
  4. Calcule o número de células usando um citômetro e use as células em uma concentração final de 2 x 105 células/mL.
  5. Despeje lentamente 2 mL de PBS no microcanal médio do chip PDMS revestido de colágeno e esterilizado e descarte posteriormente usando uma seringa de 2 mL.
  6. Despeje lentamente um total de 2 mL de 2 x 105 células/mL de suspensão HASMC no microcanal médio do chip PDMS usando uma seringa de 2 mL. Em seguida, feche o Luer na entrada e saída do chip PDMS. Colocar o chip PDMS numa incubadora (5% CO2) a 37 °C durante 1 dia.
  7. Depois que as células estiverem conectadas à membrana PDMS no chip PDMS, quase após 24 h, conecte a saída do microcanal de ar no chip PDMS ao sistema controlador de vácuo. Quando a célula está ligada, uma forma celular alongada e normal pode ser vista sob o microscópio, contrastando com as células redondas suspensas.
  8. Ligue a válvula solenoide e a bomba de vácuo. Abra o regulador de vácuo e ajuste o nível de pressão para 10 kPa para 7,18 ± deformação de 0,44% e 15 kPa para 17,28 ± deformação de 0,91%.
  9. Após a definição dos parâmetros do sistema de controle, coloque os cavacos PDMS em uma incubadora (5% CO2) a 37 °C e estique por 24 h.

5. Preparação do sistema de controlo mecânico

  1. Prepare várias válvulas solenoides, filtros de vácuo, reguladores de vácuo, uma bomba de vácuo, uma bomba peristáltica e um controlador lógico programável (PLC) que controle a válvula solenoide.
  2. Programe o controlador PLC e defina o intervalo de tempo liga/desliga para 1 Hz. Conecte as válvulas solenoides ao controlador programado.
  3. Conecte a entrada da bomba de vácuo aos filtros de vácuo e, em seguida, conecte a saída dos filtros de vácuo aos reguladores de vácuo. Conecte a saída dos reguladores de vácuo às válvulas solenoides e, finalmente, conecte a saída das válvulas solenoides às saídas dos microcanais de ar dos chips PDMS.
  4. Conecte a saída da bomba peristáltica à entrada do microcanal médio do chip PDMS e a entrada da bomba peristáltica à saída do chip PDMS de microcanal médio para substituição do meio de cultura e manuseio de medicamentos.
  5. Ajuste a amplitude da deformação pelo regulador e a frequência da deformação pelo microcontrolador.

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Resultados

O modelo HASMC-OOC consiste em um sistema de controle de vácuo, um sistema circulante e chips PDMS, e o projeto esquemático do modelo HASMC-OOC (Figura 1). O sistema de controle de vácuo consiste em uma bomba de vácuo, válvulas solenoides e um controlador PLC. Para atuar como o sistema circulante, uma bomba peristáltica foi usada para refrescar o meio de cultura celular e adicionar drogas. O chip PDMS foi composto por duas câmaras de vácuo e uma câmara média preenchida com SMCM para crescime...

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Discussão

Com o rápido desenvolvimento da tecnologia microfluídica, modelos OOC que podem replicar a função biológica e a estrutura de um ou mais órgãos in vitro surgiram nos últimos anos para aplicações em biologia, medicina e farmacologia15. A OCO pode simular funções-chave do microambiente fisiológico humano, essenciais para explorar os mecanismos da doença e promover a tradução pré-clínica de medicamentos 8,16. Embora o OOC ainda esteja...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem que este trabalho foi apoiado por doações da Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (20ZR1411700), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81771971) e do Programa de Vela de Xangai (22YF1406600).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4% de paraformaldeídoBeyotimeP0099-100mlUsado para imobilização celular
Alexa Fluor 350-marcado com Goat Anti-Rabbit IgGBeyotimeA0408Anticorpos usados para imunocoloração de
albumina de soro bovinoBeyotimeST025-20g
Cálcio AM/PIInvitrogenL3224
Frasco de cultura de células Corning430639
CNN1Abcam Ab46794
Membrana PDMS flexível comercial
Hangzhou Bald Advanced MaterialsKYQ-200
F-actinInvitrogenR415
FBSSigmaM8318
MangueirasRunze Fluid964101 mm de diâmetro interno; 3 mm de diâmetro externo; 1 mm de espessura da parede; Endereço do site oficial: https://www.runzefluidsystem.com
Linha de células musculares lisas da aorta humana
CRL1999		ATCC:70019189
Imagem JImagej.net/fiji/downloadsDownload grátis: https://fiji.scPlataforma de imagem usada para identificar a intensidade da fluorescência
IncubadoraThermo Fisher ScientificGarante que a temperatura, a umidade
e a exposição à luz sejam
exatamente as mesmas durante todo o experimento
.
LuerRunze FluidRH-M016Endereço do site oficial: https://www.runzefluidsystem.com.
MicroscópioOlympus
mouse colágenoSigmaC7661
Plasma de oxigênio Pipeta de Pasteur do instrumentoHM-Plasma5L
Biologix30-0138A1
PBSBeyotimeC0221A
Pen-StrepSigmaP4458-100mlAntibiódicos usados para impedir a contaminação bacteriana
das pilhas durante a cultura.
bomba peristálticaKamoerF01A-STP-B046
Placa de PetriCorning430167
Controlador PLCZhejiang Jun Teng (BenT) Fábrica CNCBR010-11T8X2MA configuração detalhada do programa pode ser encontrada em suplementar. Endereço do site oficial: files.http://www.btcnc.net
polidimetilsiloxano (PDMS)Dow CorningSylgard 184
SM22Abcam ab14106
SMCMScienCellCat 1101
solenóideSMC (China)VQZ300
SeringaBecton, Dickinson and Company300841
Triton-X 100BeyotimeST795Para penetrar nas membranas celulares
TrizolInvitrogen10296010usado para extração de RNA
tripsinaFiltrode vácuo Sigma 15400054
SMC (China)ZFC5-6Endereço do site oficial: bomba de
vácuoKamoerKVP15-KL-S
regulador de vácuoAirTACGVR-200-06
< strong>Primers< / strong>
Primer NomeForward (5 'a 3')Reverso (5' a 3')
SM22CCGTGGAGATCCCAACTGGCCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1CTCCATTGACTCGAACGACTCCAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA
Número do lote de Changzhou Hongming válvula https://www.smc.com.cn

Referências

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