Seleção In Vitro de Aptamers para Diferenciar Vírus Infecciosos de Não-Infecciosos

As infecções por vírus têm enormes impactos econômicos e sociais em todo o mundo, como se tornou cada vez mais evidente a partir da recente pandemia de COVID-19. O diagnóstico oportuno e preciso é fundamental no tratamento de infecções virais, evitando a disseminação de vírus para pessoas saudáveis. Embora muitos métodos de detecção do vírus tenham sido desenvolvidos, como os testes de PCR^1,2 e inmunoassays^3, a maioria dos métodos atualmente utilizados não é capaz de determinar se o vírus detectado é realmente infeccioso ou não. Isso ocorre porque a presença isolada de componentes do vírus, como ácido nucleico ou proteínas virais, não indica a presença do vírus infeccioso intacto, e os níveis desses biomarcadores têm mostrado fraca correlação com a infectividade ^4,5,6. Por exemplo, o RNA viral, comumente usado para os testes COVID-19 baseados em PCR atuais, tem níveis muito baixos nos estágios iniciais da infecção quando o paciente é contagioso, enquanto o nível de RNA geralmente ainda é muito alto quando os pacientes se recuperaram da infecção e não são mais contagiosos ^7,8. Os biomarcadores de proteína ou antígeno viral seguem tendência semelhante, mas tipicamente aparecem ainda mais tarde que o RNA viral e, portanto, são ainda menos preditivos de infectabilidade ^6,9. Para suprir essa limitação, alguns métodos que podem informar sobre o estado de infectividade do vírus têm sido desenvolvidos, mas são baseados em técnicas de microbiologia em cultura celular que requerem um longo tempo (dias ou semanas) para a obtenção dos^{resultados4,10}. Assim, o desenvolvimento de novos sensores que possam informar sobre a infectabilidade de amostras clínicas ou ambientais pode evitar atrasos no tratamento e maior disseminação do vírus. No entanto, muito poucos métodos podem obter moléculas de detecção que possam reconhecer um vírion infeccioso intacto e diferenciá-lo do mesmo vírus que se tornou não infeccioso.

Nesse contexto, os aptâmeros são particularmente adequados como uma ferramenta biomolecular única11,12,13,14. Os aptâmeros são moléculas curtas de DNA ou RNA de fita simples com uma sequência específica de nucleotídeos que lhes permite formar uma conformação 3D específica para reconhecer um alvo com alta afinidade e seletividade^15,16. São obtidos por um processo de seleção combinatória denominado evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX), também conhecido como seleção in vitro, que é realizado em tubos de ensaio com uma grande biblioteca aleatória de amostragem de DNA de 10 14-10¹⁵ sequências^17,18,19. Em cada rodada desse processo iterativo, o pool de DNA é primeiramente submetido a uma pressão de seleção através da incubação com o alvo nas condições desejadas. Quaisquer sequências que não estão ligadas ao alvo são então removidas, deixando para trás apenas as poucas sequências que são capazes de se ligar sob as condições dadas. Finalmente, as sequências selecionadas na etapa anterior são amplificadas por PCR, enriquecendo a população do pool com as sequências funcionais desejadas para a próxima rodada de seleção, e o processo é repetido. Quando a atividade do pool de seleção atinge um platô (normalmente após 8-15 rodadas), a biblioteca é analisada por sequenciamento de DNA para identificar as sequências vencedoras que exibem a maior afinidade.

O SELEX apresenta vantagens únicas que podem ser exploradas para aumentar a seletividade contra outros alvos^{semelhantes20,21,} como o estado de infectividade do vírus ²². Primeiro, uma grande variedade de diferentes tipos de alvos pode ser usada para a seleção, desde pequenas moléculas e proteínas até patógenos inteiros e células¹⁶. Assim, para obter um aptâmero que se liga a um vírus infeccioso, pode-se utilizar como alvo um vírus intacto, em vez de uma proteína de superfície viral¹⁹. O vírus inteiro SELEX permite a seleção de aptâmeros que se ligam especificamente ao estado nativo do vírus, sem a necessidade de interrupção do vírus. Em segundo lugar, o SELEX pode ser feito sob medida para remover alvos concorrentes 21,23, como outros vírus similares ou vírus inativados não infecciosos^, usando etapas de contra-seleção em cada rodada de seleção²². Durante as etapas de seleção do contador, o pool de DNA é exposto a alvos para os quais a ligação não é desejada, e quaisquer sequências que se ligam são descartadas.

Neste trabalho, nós fornecemos um protocolo que pode ser geralmente aplicado para selecionar aptâmeros que se ligam a um vírus infeccioso, mas não ao mesmo vírus que foi tornado não-infeccioso por um método de desinfecção particular ou a outro vírus relacionado. Este método permite a obtenção de agentes de reconhecimento com base em diferenças funcionais da superfície do vírus, que não precisam ser conhecidas com antecedência, e assim oferece uma vantagem adicional para a detecção de patógenos recém-emergidos ou para doenças pouco estudadas.

1. Preparação de reagentes e tampões

1. Preparar 10x Tris-borato EDTA (10x TBE) adicionando 0,9 M Tris-base, 0,9 M ácido bórico, 20 mM EDTA (sal dissódico) e água deionizada a um volume final de 1 L. Misture até que todos os componentes estejam dissolvidos.
2. Prepare uma solução-mãe de poliacrilamida desnaturante a 10% da seguinte forma. Em um frasco de vidro de 250 mL, adicionar 120 g de ureia (8 M), 25 mL de TBE 10x, 62,5 mL de solução de acrilamida/bisacrilamida a 40% (29:1) e água destilada suficiente para atingir o volume final de 250 mL. Misture até que todos os componentes estejam dissolvidos.
3. Prepare o buffer de carregamento de 2x da seguinte maneira. Em um tubo de 50 mL, adicionar 21,636 g de ureia (8 M), 1,675 g de EDTA (1 mM) e 4,5 mL de 10x TBE. Encha até 45 mL com água destilada e misture até que todos os componentes estejam dissolvidos.
4. Preparar o tampão de extracção adicionando 100 mM de acetato de sódio e 1 mM de EDTA (sal dissódico). Ajuste o pH final para 5.
5. Prepare soluções de precipitação de etanol da seguinte forma. Preparar acetato de sódio 3 M, ajustar ao pH 5,2 e conservar a 4 °C. Preparar etanol 70% v/v e armazenar a -20 °C. Preparar 100% etanol e armazenar a -20 °C.
6. Preparar 500 mL de tampão SELEX contendo 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2 e 0,5 mM CaCl₂. Ajuste para pH 7,4. Preparar 100 mL de tampão SELEX com ureia 8 M adicionando 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl₂ e 8 M ureia. Ajuste para pH 7,4.
   NOTA: A escolha do tampão SELEX é fundamental para garantir que o aptâmero selecionado funcione na amostra final onde o aptâmero será aplicado. Por exemplo, aptâmeros específicos para SARS-CoV-2 serão usados em amostras biológicas (por exemplo, swabs de saliva ou nasofaringes). Assim, é importante escolher concentrações de íons, pH e tampão que mimetizem essas condições nas amostras biológicas pretendidas.
7. Prepare o tampão de ligação e lavagem da seguinte maneira. Em um tubo de 50 mL, preparar Tris 5 mM, EDTA 0,5 mM (sal dissódico) e NaCl 2 M. Ajuste para pH 7,5.

2. Projeto e síntese de biblioteca de DNA e primers

1. Projete a biblioteca inicial de ssDNA e os primers com os seguintes critérios (veja a Tabela 1 para um exemplo de biblioteca de ssDNA e conjunto de primers, onde N indica uma posição aleatória de nucleotídeos).
   1. Certifique-se de que a biblioteca contenha uma região aleatória central de 35 a 60 nucleotídeos flanqueados por duas sequências constantes nas extremidades 3' e 5' que atuam como regiões de primer para amplificação. Um comprimento típico de biblioteca é de 45 nucleotídeos aleatórios.
   2. Certifique-se de que o primer reverso contenha uma modificação de biotina para separar o ssDNA dos produtos amplificados de PCR de fita dupla usando esferas revestidas com estreptavidina durante o processo de seleção in vitro .
2. Compre os oligos de DNA de fontes comerciais com purificação de dessalinização padrão. Purificar a biblioteca e os primers do ssDNA por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante a 10% (dPAGE), seguida de precipitação de etanol de acordo com procedimentos padrão²⁴.
   CUIDADO: Monômero de acrilamida e brometo de etídio são produtos químicos perigosos (carcinógenos humanos), portanto, use equipamentos de proteção individual apropriados (jalecos, luvas e proteção ocular) durante a execução do PAGE. Quando possível, evite o uso de brometo de etídio e substitua-o por um corante mais seguro.
   NOTA: É possível encomendar os oligos com purificação por HPLC para evitar a realização desta etapa de purificação, embora isso não remova oligonucleotídeos curtos com a mesma eficácia.
3. Adicionar água livre de nucleases para ressuspender o ssDNA após a precipitação do etanol até a concentração desejada (100 μM). Determinar a concentração da biblioteca de ssDNA e dos primers por absorção UV em λ = 260 nm. Conservar a -20 °C.
4. Adquira um primer reverso não modificado para usar na preparação da biblioteca de sequenciamento de alto rendimento e na quantificação de qPCR.

3. Amostras de vírus infecciosos e não infecciosos

CUIDADO: As amostras de vírus infecciosos e não infecciosos são amostras de nível de biossegurança 2 (BSL2) que requerem cuidados extras para manuseio seguro e adequado. Todas as etapas do procedimento que incluem essas amostras devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança, ou a solução do vírus deve estar em um recipiente selado (por exemplo, tubos de plástico tampados).

1. Obter uma solução estoque de vírus infecciosos ou prepará-los, seguindo o protocolo correspondente para cada vírus. Os pseudovírus SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 e H5N1 usados aqui foram fornecidos pelo laboratório do Prof. Lijun Rong (UIC) no tampão PBS, e foram preparados seguindo os protocolos relatados^22,25,26.
   NOTA: Para vírus que exigem instalações de nível de biossegurança 3 para lidar com o vírus infeccioso intacto, é possível trabalhar com pseudovírus. Um vírus pseudotipado é gerado a partir de um lentivírus (HIV) que exibe as proteínas de superfície do vírus dentro do envelope viral e, portanto, imita de perto a superfície e o mecanismo de entrada do vírus, mas é defeituoso na replicação viral contínua.
2. Obter uma solução de estoque de vírus não infecciosa ou prepará-la seguindo o procedimento de desinfecção. O estoque do pseudovirus SARS-CoV-2 do SARS-CoV-2 do UV-inactivado (p-SARS-CoV-2) usado aqui foi fornecido pelo laboratório do Prof. Rong (UIC) no tampão PBS, e o protocolo relatado previamente foi usado para a inactivação UV²².
   NOTA: Se possível, execute um ensaio para testar a infectividade do vírus para garantir que o vírus foi completamente inativado.
3. Quantificar os estoques de vírus
   1. Quantificar o vírus utilizando um ensaio de placa de acordo com procedimentos padrão^27,28,29. Este ensaio não só permite a quantificação do vírus, mas também indica o estado de infecciosidade do vírus, confirmando a concentração do vírus infeccioso.
   2. Para pseudovírus ou vírus onde um ensaio de placa não está disponível, quantificar o vírus usando um kit ELISA de lentivírus quantitativo disponível comercialmente.
   3. Preparar 1 x 10⁸ cópias/mL de solução estoque para p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 e p-H5N1. Separar cada solução-mãe em alíquotas contendo 50 μL cada e conservar a -80 °C. Descongele uma nova alíquota antes de cada experimento.

4. Seleção in vitro ou processo SELEX: rodada inicial

Observação : para todas as etapas usando o vírus infeccioso, trabalhar em um gabinete BSL2.

1. Desnaturar a biblioteca ssDNA. Tomar 10 μL de 100 μM da biblioteca ssDNA (1 nmol) e misturar com 240 μL de tampão SELEX. Aqueça a 95 °C por 15 min em banho seco e, em seguida, coloque o tubo no gelo por 15 min.
2. Incubar a biblioteca ssDNA com o vírus infeccioso (etapa de seleção positiva) da seguinte maneira. Misturar 250 μL da biblioteca de ssDNA em tampão SELEX a partir do passo 4.1 com 50 μL de vírus infeccioso (1 x 10⁸ cópias/mL). Incubar durante 2 h à temperatura ambiente.
3. Bloqueie os locais inespecíficos em filtros de centrífuga da seguinte maneira. Enquanto aguarda a etapa 4.2, prepare os filtros da centrífuga para as próximas etapas.
   1. Adicionar 400 μL da sequência T20 de 1 mM (Tabela 1) a cada filtro centrífugo de 0,5 mL que será utilizado, sendo um filtro centrífugo com ponto de corte de 100 kDa e outro com ponto de corte de 10 kDa.
   2. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente e centrifugar a 14.000 x g durante 10 min para remover a solução T20 no filtro. Lave 3x com tampão SELEX para remover o excesso de sequências T20.
4. Lave as sequências não acopladas da seguinte maneira. Adicionar a mistura incubada na etapa 4.2 ao filtro de centrífuga de 100 kDa bloqueado e centrifugar a 14.000 x g por 10 min. Lavar 3x, adicionando 400 μL de tampão SELEX e centrifugando a 14.000 x g durante 10 min. Mantenha a fração no filtro e descarte o fluxo.
5. Sequências de eluição conforme descrito abaixo.
   1. Trocar o tubo de recolha do filtro de centrifugação e adicionar 300 μL de tampão SELEX contendo 8 M de ureia ao filtro de centrifugação no passo 4.4. Aqueça o filtro centrífugo a 95 °C por 15 min em banho seco e, em seguida, centrifugue a 14.000 x g por 10 min.
   2. Coletar a fração que fluiu através do filtro contendo as sequências eluídas. Repita mais três vezes. Trabalhe em um armário BSL2 e lave todos os materiais com 10% de água sanitária para inativar o vírus antes de descartar os materiais.
6. Concentre e dessalgue da seguinte forma. Adicionar a solução recolhida em 4.5 a um filtro centrífugo bloqueado de 10 kDa. Centrifugar a 14.000 x g por 15 min. Descarte a fração que fluiu pelo filtro.
   NOTA: Como os vírus são retidos e inativados com ureia 8 M no filtro na etapa anterior, esta e as etapas seguintes não precisam ser realizadas no gabinete de biossegurança. Este procedimento deve ser repetido se for utilizado um tubo de centrífuga de 0,5 ml até que toda a solução seja recolhida, como no passo 4.5, 1,2 ml flui através do filtro.
7. Lavar 3x com 300 μL de tampão SELEX para remover a ureia centrifugando a 14.000 x g durante 15 min. Descarte a fração que fluiu pelo filtro. Recupere a solução no filtro virando-a de cabeça para baixo em um tubo de coleta limpo e centrifugando por 5 min.
8. Medir o volume final da solução recuperada a partir de 4,7 utilizando uma pipeta num tubo de plástico. Esta solução é denominada R ia, onde i corresponde ao número redondo. Tipicamente, são obtidos volumes entre 30 μL e 50 μL. Tome 1 μL do ssDNA eluído para quantificar a quantidade de DNA por qPCR.
   NOTA: Este é um possível ponto de pausa, onde o R₁de uma amostra pode ser mantido a -20 °C para continuar em outro momento.
9. Realize a amplificação por PCR conforme descrito abaixo.
   1. Na primeira rodada, pegue 90% do R₁uma amostra como modelo de PCR. Nas rodadas seguintes, pegue 60% do volume total na etapa 4.8 para realizar a PCR e armazene a outra fração a -20 °C.
   2. Estabelecer uma reação de PCR de 50 μL com a seguinte concentração final especificada: 1x tampão de reação de PCR, 200 μM dNTPs, 10 μL de molde de DNA (R 1uma amostra), 200 nM cada primer e 1,25 U polimerase (2,5 U/μL de estoque).
   3. Otimize as condições de PCR, incluindo o número de ciclos e a temperatura de recozimento para cada conjunto de primers e biblioteca de ssDNA. Evite usar muitos ciclos, que produzirão subprodutos de PCR indesejados, como primers-dímeros. Teste diferentes temperaturas de recozimento com base na temperatura de fusão dos primers.
   4. Executar a PCR usando condições otimizadas a 95 °C por 5 min, seguido por 18 ciclos de 1 min a 95 °C, 30 s a 52 °C e 1 min a 72 °C, com uma etapa final de extensão a 72 °C por 10 min, para obter o pool de dsDNA.
      NOTA: Este é outro possível ponto de pausa, onde o produto PCR pode ser mantido a -20 °C para continuar em outro momento.
10. Recupere ssDNA usando esferas magnéticas modificadas com estreptavidina.
    1. Tome 80% do produto PCR. Conservar a fracção restante a -20 °C.
    2. Dividir o produto da PCR em alíquotas de 50 μL e adicioná-las a tubos de microfuga contendo 50 μL de esferas magnéticas modificadas com estreptavidina (MB). Incubar durante 30 minutos com agitação ligeira (por exemplo, utilizar um agitador rotativo) à temperatura ambiente. Em seguida, coloque o tubo de microfuga no rack magnético para isolar o MB e remover o sobrenadante por pipetagem (deve ser uma solução clara).
    3. Lavar adicionando 200 μL de tampão de ligação e de lavagem ao tubo. Retire o tubo do rack magnético, toque no tubo e ressuspenda o MB para uma solução homogênea por pipetagem. Coloque o tubo de microfuga de volta no rack magnético para isolar o MB e remover o sobrenadante por pipetagem. Repita esta etapa de lavagem duas vezes.
    4. Uma vez concluída a lavagem, ressuspenda o MB num total de 100 μL de tampão SELEX e aqueça a solução a 95 °C durante 10 minutos. Coloque imediatamente o tubo no rack magnético antes que o tubo esfrie e pegue o sobrenadante que contém o pool de ssDNA. Repita esta etapa de recuperação, adicionando 50 μL de tampão SELEX.
11. Medir o volume final da fracção recuperada a partir de 4,10 utilizando uma pipeta. Essa fração é denominada R i x, onde i corresponde ao número redondo. Em geral, obtêm-se volumes entre 140 e 150 μL. Tome 1 μL de R₁x para quantificar a quantidade de DNA por qPCR.

5. Fases de selecção subsequentes

1. Desnaturar o pool de ssDNA. Tomar 60% da amostra R₁x e misturar com 50 μL de tampão SELEX. Aqueça a 95 °C por 15 min em banho seco. Coloque o tubo no gelo por 15 min.
2. Incubar o pool de ssDNA com o vírus não infeccioso e outros vírus potencialmente interferentes (etapa de contra-seleção). Misturar o pool de ssDNA desnaturado no tampão SELEX de 5,1 com 50 μL de cada vírus (5 x 10⁹ cópias/mL; por exemplo, p-SARS-CoV-2 não infeccioso, p-SARS-CoV-1 e p-H5N1). Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
3. Bloqueie locais inespecíficos em filtros centrífugos. Enquanto aguarda a etapa 5.2., prepare os filtros da centrífuga para as próximas etapas. Normalmente, use dois filtros de centrífuga, um com um ponto de corte de 100 kDa e outro com um ponto de corte de 10 kDa. Siga o mesmo procedimento do ponto 4.3.
4. Lave as sequências ligadas a vírus não alvo. Adicionar a mistura incubada no passo 5.2 a um filtro centrífugo bloqueado de 100 kDa. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min e recuperar a fração que flui através do filtro centrífugo. Lavar 2x, adicionando 100 μL de tampão SELEX e centrifugando a 14.000 x g por 10 min. Mantenha a fração que fluiu através do filtro.
5. Incubar o pool de ssDNA com o vírus infeccioso (etapa de seleção positiva). Tomar os 300 μL da fracção do passo 5.4 e misturar com 50 μL do vírus infeccioso (1 x 10⁸ cópias/ml). Incubar durante 2 h à temperatura ambiente. Siga as etapas 4.4 a 4.11.

6. Acompanhamento do processo SELEX

NOTA: Para monitorar o enriquecimento do pool, o qPCR é usado de duas maneiras. Primeiro, pela quantificação absoluta, é possível testar o enriquecimento das piscinas (rendimento de eluição). Em segundo lugar, por meio do monitoramento da curva de fusão, pode-se avaliar a diversidade dos pools (convergência das espécies aptâmeros)³⁰.

1. Realizar todos os ensaios de qPCR com um volume de reação de 10 μL em placas de 96 poços projetadas para qPCR.
2. Preparar uma mistura padrão de qPCR contendo 5 μL de mistura principal, 0,3 μL de 500 nM de cada primer não marcado, 3,4 μL de H₂O e 1 μL de molde de DNA.
   1. Preparar diluições da biblioteca de ssDNA purificada (passo 2.3) para executar a curva padrão.
   2. Diluir as amostras de ADN para que a sua concentração se ajuste à curva padrão. Para as amostras de R_ia, adicionar 1 μL da amostra sem diluição e 1 μL de diluição 1:10 à mistura de qPCR. Para amostras de R_ix, incluir diluições de 1:10 ou 1:100.
3. Execute o qPCR definindo o seguinte protocolo. Primeiro, defina uma etapa inicial de desnaturação a 98 °C por 2 min. Em seguida, definir 40 ciclos de desnaturação a 98 °C por 5 s e recozimento e extensão a 52 °C por 10 s. Finalmente, defina uma análise da curva de fusão de 65 a 95 °C. Determine os valores do ciclo de limiar (Ct) por análise automatizada de limiar.
4. Usando a curva padrão, quantificar a quantidade de ssDNA em amostras deR i a e R_ix.
5. Calcular o rendimento de eluição como a quantidade de DNA ligado (número de moles em R_ia) dividido pela quantidade de DNA inicial (número de moles em R_i-1x). Plote o rendimento de eluição vs número redondo para ver se um enriquecimento ao longo das rodadas é observado.
6. Plote as curvas de fusão para diferentes rodadas. Espera-se uma mudança para temperaturas de fusão mais altas no pico perto de 75/85 °C à medida que o número de rodadas aumenta. Isso significa que a diversidade da piscina diminui.

7. Sequenciamento de alto rendimento

1. Consulte o recurso de sequenciamento de alto rendimento sobre quais tipos e escalas de sequenciamento estão disponíveis, o que determinará o método de preparação da biblioteca.
   NOTA: Esta decisão levará em consideração tanto o comprimento dos pools a serem sequenciados (incluindo os primers) quanto o número de pools a serem enviados (geralmente, almeje pelo menos 1 x 10^{5-10 6} sequências por pool). Se uma escala de sequenciamento específica não puder ler todo o comprimento do pool, o sequenciamento de extremidade emparelhada poderá ser usado para ler de ambas as extremidades da sequência, em oposição à extremidade única que lê de apenas uma extremidade.
2. Selecione um kit apropriado disponível comercialmente com base no tipo de sequenciamento, em consulta com a instalação de sequenciamento. Prepare vários pools de rodadas de seleção representando alto, médio e baixo enriquecimento, bem como o pool final, usando um par diferente de índices nos adaptadores para cada pool que permitiu a análise de amostra de todas as rodadas usando uma faixa.
   NOTA: A amplificação por PCR também pode ser usada para incorporar os adaptadores e índices necessários para o sequenciamento de alto rendimento, mas isso geralmente custa semelhante aos kits comerciais e não tem um desempenho melhor.
   1. Realize a preparação da biblioteca seguindo estas etapas: reparo final do DNA fragmentado, ligadura do adaptador e amplificação por PCR para produzir as bibliotecas finais.
   2. Purifice o produto de PCR com esferas de limpeza de DNA magnético seguindo as instruções do fabricante.
   3. Quantifique o DNA usando um kit de quantificação baseado em fluorescência. Evite usar métodos menos precisos, como medições UV de pequeno volume.
   4. Misture quantidades aproximadamente iguais (por quantidade de DNA, não por volume) de cada biblioteca de pool contendo índices específicos.
   5. Verifique a qualidade da biblioteca final com quantificação por qPCR e um analisador de fragmentos de DNA. Essa etapa geralmente é executada pelo serviço de sequenciamento.
      NOTA: O pessoal da instalação de sequenciamento pode fornecer informações úteis sobre como preparar a biblioteca e quais controles de qualidade são sugeridos. É necessário discutir com eles antes de preparar as bibliotecas.
3. Envie a biblioteca final preparada para a instalação de sequenciamento seguindo seus requisitos.

8. Análise de sequenciamento

1. A maioria dos softwares disponíveis para análise de sequenciamento foi projetada para ser executada na linha de comando em um sistema operacional Linux. Para pequenos conjuntos de dados, configure o sistema operacional Linux desejado e instale os programas necessários em um computador pessoal; para conjuntos de dados maiores, a análise HTS é executada em recursos de computação de alto desempenho ou supercomputadores (recomendado).
   NOTA: O acesso e o treinamento serão necessários para usar recursos de computação de alto desempenho, o que pode levar algum tempo para ser obtido. Além disso, será necessário conhecimento básico do uso da linha de comando do UNIX. Muitos recursos gratuitos sobre o uso básico da linha de comando estão disponíveis on-line, e os recursos de computação provavelmente fornecerão informações adicionais para o uso de seus sistemas.
2. Acesse os arquivos de sequenciamento, geralmente em um formato de arquivo FastQ compactado, usando as informações fornecidas pelo recurso de sequenciamento.
   1. Use um cliente FTP para transferir os arquivos para seu próprio computador e/ou o recurso de computação de alto desempenho. Muitos programas de análise de sequência podem usar diretamente arquivos compactados, portanto, mantenha os arquivos compactados, se possível, para limitar seus tamanhos de arquivo (leituras de sequência grandes de sequência de 50 sequências M + podem ocupar 100 Gb + de espaço de arquivo quando descompactados).
   2. Se os arquivos de sequência precisam ser descompactados, use a função gzip que é padrão na maioria das instalações do Linux. Obtenha informações adicionais sobre o gzip e suas opções no manual instalado digitando "man gzip" na linha de comando.
3. Limpe as sequências antes da análise por desmultiplexação, removendo os adaptadores de sequenciamento, removendo leituras de baixa qualidade e incluindo leituras nas direções direta e inversa.
   1. Use o programa FastQC³¹ após cada uma das etapas a seguir para obter informações básicas de controle de qualidade sobre as sequências para avaliar a eficácia de cada etapa de limpeza.
   2. Demultiplex as sequências para separar todas as sequências de um único arquivo de leitura nos diferentes pools com base nos índices incluídos nos adaptadores de sequenciamento. Essa etapa geralmente é realizada pelo serviço de sequenciamento, que deve ser consultado, pois o procedimento exato dependerá da máquina de sequenciamento utilizada.
   3. Remova os adaptadores de sequenciamento usando o programa de linha de comando, Cutadapt³². Use os primers de seleção (em vez de adaptadores de sequenciamento) como a entrada no modo Adaptador vinculado. Use a opção --discard-untrimmed para descartar quaisquer sequências que não contenham os primers de seleção.
   4. Defina opções para a taxa de erro máxima para corresponder aos adaptadores e o comprimento mínimo e máximo das sequências a serem aceitas. Se estiver usando leituras finais emparelhadas, insira parâmetros específicos disponíveis e forneça os arquivos de sequenciamento de Leitura 1 e Leitura 2. Defina parâmetros adicionais conforme necessário, consultando o manual Cutadapt³².
      NOTA: A ligadura de adaptadores de sequenciamento a pools é independente de direção e incorporará aproximadamente 50% das sequências na direção direta e 50% na direção inversa. Para evitar a perda de 50% das sequências na direção inversa, o Cutadapt pode ser executado uma segunda vez usando o complemento reverso dos primers de seleção como entradas.
   5. (Opcional) Se o sequenciamento de extremidade emparelhada for usado, mescle os arquivos Read 1 e Read 2 com o programa PEAR³³.
   6. Use o programa FASTX-Toolkit³⁴ para remover sequências de baixa qualidade que tenham uma qualidade abaixo de um determinado limite em qualquer nucleotídeo. Um ponto de corte de qualidade de 30 é um bom ponto de partida. Se a qualidade geral for geralmente boa, esta etapa pode ser ignorada.
   7. Para mesclar os arquivos de sequência na direção inversa com aqueles na direção de avanço, use a função de fastx_reverse_complement FASTX-Toolkit nos arquivos de direção inversa. Em seguida, use o programa cat embutido (padrão na maioria das instalações do Linux) para mesclar os arquivos de complemento para frente e para trás - reverso em um único arquivo.
4. Para analisar o enriquecimento de sequências em diferentes pools de seleção, use o kit de ferramentas de análise FASTAptamer³⁵.
   1. Use FASTAptamer-Count para contar o número de vezes que cada sequência aparece. Em seguida, classifique e classifique as sequências por abundância. O arquivo de saída de contagem é necessário como entrada para todos os outros programas FASTAptamer.
   2. Use FASTAptamer-Clust para agrupar todas as sequências em um arquivo em clusters de sequências estreitamente relacionadas. Use o parâmetro "distance" para definir o número de mutações de nucleotídeo único ou indels permitidas para agrupar em um cluster.
      NOTA: O programa FASTAptamer-Clust pode ser muito caro computacionalmente se um grande número de sequências únicas estiver presente (especialmente para rodadas iniciais), o que pode levar dias ou até semanas para ser totalmente concluído. O parâmetro de filtro de corte pode ser usado para excluir sequências de baixa abundância do agrupamento. Geralmente, é bom começar com um corte mais alto, como 10 ou 5 leituras por milhão (RPM) e diminuí-lo se o programa terminar rapidamente. Se os pools forem muito heterogêneos, talvez não seja viável agrupar as sequências em um período de tempo razoável.
   3. Use FASTAptamer-Enrich para calcular o enriquecimento de cada sequência presente em mais de uma rodada da seleção. Compare o RPM da sequência de uma população com o RPM de outra. Use o programa Enrich nos arquivos Count ou Cluster. A saída é um arquivo de valor separado por tabulação (.tsv) que pode ser aberto em qualquer software de planilha para análise adicional e fácil classificação.
      NOTA: O programa FASTAptamer-Enrich também pode ser muito caro computacionalmente se um grande número de sequências exclusivas estiver presente. O parâmetro de filtro de corte pode ser usado para excluir sequências de baixa abundância da saída para evitar arquivos muito grandes para serem abertos em software de planilha.
   4. (Opcional) Se muitos pools forem muito heterogêneos (muitas sequências exclusivas e poucas sequências duplicadas), talvez não seja viável usar os programas Clust ou Enrich. Nesse caso, execute uma verificação de enriquecimento manual usando o arquivo de saída Count, que classifica as sequências por abundância (mais abundante na parte superior) e renomeia o identificador de sequência para incluir informações importantes, como RPM.
      1. Use o programa padrão Linux "head" nos arquivos Count para obter uma lista das sequências mais abundantes. Em seguida, use o programa "grep" padrão do Linux para pesquisar cada uma das sequências mais abundantes nos arquivos de contagem de todos os outros pools relevantes. Se houver correspondências, use o identificador de sequência modificado para determinar o RPM nesse pool, para construir manualmente as informações de enriquecimento.
         Observação : scripts para todas as etapas de análise de sequenciamento podem ser encontrados nos arquivos de codificação suplementar 1-11.

9. Validação e ensaios de ligação do Aptamer

1. A partir das informações de enriquecimento obtidas através da análise de sequências, identificar as sequências candidatas aptâmeras com base nas sequências que têm mais enriquecimento nas rodadas de seleção subsequentes e/ou as sequências mais abundantes na rodada final de seleção. Selecione várias sequências candidatas diferentes (pelo menos 10-20) para testes adicionais, pois as mais enriquecidas podem não ser necessariamente as aptâmeras de melhor desempenho.
2. Realizar a triagem inicial de aptâmeros candidatos usando um ensaio de ligação que pode ser realizado rapidamente para várias amostras. Um ensaio de ligação de ultrafiltração baseado em coluna³⁶ ou um ensaio de oligonucleotídeos ligados a enzimas (ELONA) são bons métodos para essa triagem inicial.
3. Analisar a especificidade e afinidade das sequências que mostram a melhor atividade de ligação a partir da triagem inicial, usando pelo menos dois ensaios de ligação independentes (por exemplo, MicroScale Thermophoresis (MST)^37,38, Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay (ELONA)^39, surface plasmon resonance 40 ou biolayer interferometry (BLI)⁴¹).

Uma vez que aptâmeros de DNA podem ser obtidos usando SELEX em um tubo de ensaio15, essa estratégia SELEX foi cuidadosamente projetada para incluir etapas de seleção positiva em direção ao vírus infeccioso inteiro intacto (ou seja, reter as moléculas de DNA que se ligam ao vírus infeccioso), bem como etapas de contra-seleção para o mesmo vírus que foi tornado não infeccioso por um método de desinfecção particular, especificamente o tratamento UV, descartando as sequências de DNA que podem se ligar ao vírus não infeccioso. Uma representação esquemática do processo de seleção é mostrada na Figura 1.

Como resultados representativos deste protocolo, escolhemos a selecção de um aptâmero para SARS-CoV-2 infeccioso. Devido à exigência de condições de trabalho de nível de biossegurança 3 (BSL3) para lidar com o SARS-CoV-2 infeccioso intacto, optamos por trabalhar com um vírus pseudotipado. Os vírus pseudotipados são gerados a partir de um vírus de espinha dorsal relativamente inofensivo, neste caso um tipo de lentivírus (HIV), que foi modificado para exibir a proteína de superfície de um vírus diferente de interesse dentro de seu envelope viral, permitindo que ele mimetize de perto a superfície e o mecanismo de entrada do vírus desejado sem os riscos associados ao trabalho com patógenos humanos perigosos. É importante ressaltar que esses pseudovírus são modificados para serem defeituosos na replicação viral contínua25,42. Neste trabalho, três vírus pseudotipados diferentes foram usados: p-SARS-CoV-2, onde as proteínas spike (S) do SARS-CoV-2 são incorporadas no envelope; p-SARS-CoV-1, contendo proteína spike (S) do SARS-CoV-1; e p-H5N1, contendo hemaglutinina e neuraminidase isoladas da cepa A/Goose/Qinghai/59/59/05 (H5N1) do vírus da influenza aviária de alta patogenicidade.

Nas duas primeiras rodadas de seleção, nenhuma etapa de contra-seleção foi incluída para minimizar a remoção inespecífica de ligantes de DNA que normalmente estão presentes apenas como cópias únicas nas rodadas iniciais. Após as duas primeiras rodadas, etapas de seleção positiva e contrária foram incluídas em cada rodada para alcançar uma alta seletividade. Para a selecção do contador, p-SARS-CoV-2 que tinha sido tornado não-infeccioso pelo tratamento UV, bem como p-SARS-CoV-1 e p-H5N1 foram usados para ganhar selectividade contra outros vírus.

Para monitorar o progresso da seleção, a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) foi usada. Esta técnica representa um método simples que não requer a rotulagem da piscina e pode ser geralmente aplicada a praticamente qualquer alvo30. Ele aproveita duas características da técnica de qPCR. Primeiro, a possibilidade de quantificação absoluta usando uma curva padrão para calcular o rendimento de eluição, definido pelo ssDNA ligado ao vírus infeccioso sobre o total adicionado de ssDNA. Nossos resultados mostraram que o rendimento de eluição aumentou inicialmente a cada rodada inicial de SELEX e se nivelou nas rodadas 8 e 9 (R8 e R9), sugerindo um enriquecimento dos pools em sequências que se ligam ao vírus infeccioso (Figura 2A). Em segundo lugar, as curvas de fusão de cada rodada do pool de DNA fornecem mais evidências da diversidade de sequências dos pools30. Comparando-se as curvas de fusão, pode-se observar um deslocamento do pico em alta temperatura de fusão (T m) de 77 °C para 79 °C, sugerindo que o pool de DNA convergiu de sequências aleatórias com T m baixo para sequências mais conservadas com Tm mais alto (Figura 2B). Além disso, nas últimas rodadas (R8 e R9), aparece um pico em Tm baixo (~70 °C). Isso pode estar relacionado à produção de dímeros-primers durante a PCR. Uma possível solução para evitar isso é reduzir o número de ciclos durante a PCR (por exemplo, de 18 ciclos para 12 ou 15 ciclos).

Depois de confirmar um enriquecimento do pool por qPCR, usamos o sequenciamento de alto rendimento (HTS) para as rodadas 3, 5, 7, 8 e 9 do SELEX para descobrir quais sequências são responsáveis pela ligação do alvo do vírus. Em comparação com os procedimentos tradicionais de sequenciamento de clonagem, o HTS permite que a evolução de sequências individuais ao longo de várias rodadas de seleções seja monitorada, para finalmente identificar as sequências aptâmeras que são enriquecidas ao longo das rodadas subsequentes. A Figura 3A mostra a abundância relativa (em leituras por milhão) para a sequência SARS2-AR10, obtida ao longo de rodadas de seleção consecutivas. A estrutura secundária de SARS2-AR10 é prevista pelo software Mfold, e os resultados (Figura 3B) mostram uma estrutura secundária estruturada que contém uma região de loop do tronco que pode estar envolvida no reconhecimento do vírus. Uma caracterização mais aprofundada da ligação de afinidade dessa sequência foi relatada anteriormente22. A termoforese em microescala (MST) e um ensaio de oligonucleotídeo ligado à enzima (ELONA) demonstraram que o aptâmero SARS2-AR10 se liga ao p-SARS-CoV-2 infeccioso com um Kd = 79 ± 28 nM, e não se liga ao p-SARS-CoV-2 não infeccioso ou a outros coronaviruses como p-SARS-CoV-1 e 229E.

Figura 1: Representação esquemática do processo SELEX de aptâmeros que distingue vírus infecciosos de não infecciosos. Etapas de seleção positiva e contrária foram adicionadas em cada rodada após a segunda rodada para alcançar alta especificidade em relação ao vírus infeccioso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Monitorando o progresso do SELEX de aptâmeros infecciosos específicos para SARS-CoV-2. (A) Quantificação do rendimento de eluição (ou seja, o ssDNA ligado sobre o ssDNA adicionado) para cada rodada de SELEX usando qPCR. (B) Curva de derretimento para os diferentes pools durante a seleção do aptâmero SARS-CoV-2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Enriquecimento e estrutura secundária do aptâmero SARS2-AR10. Leituras por milhão (RPM) obtidas pela análise dos dados HTS para a sequência SARS2-AR10 em função das rodadas de seleção, usando FASTAptamer-Count. Inset: A estrutura secundária mais estável prevista da sequência SARS2-AR10 baseada no software UNAFold. Os cálculos foram feitos a 25 °C, 100 mM NaCl e 2 mM MgCl2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de sequências de DNA.

Arquivo de codificação suplementar 1: Cutadapt_script.txt identifica quaisquer sequências em um determinado arquivo de entrada que tenham os primers de avanço e reverso especificados, descarta qualquer sequência que não tenha os primers e remove os primers das sequências que os tinham. Ver referência31 para mais informações sobre o Cutadapt. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2: FASTAptamer_cluster_script.txt agrupará todas as sequências de um único arquivo de contagem em famílias/clusters de sequências estreitamente relacionadas/semelhantes. Isso é útil se uma sequência candidata for identificada, de modo que outras sequências semelhantes no mesmo cluster também possam ser identificadas como potenciais candidatas. Ver referência34 para mais informações sobre o FASTAptamer. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 3: FASTAptamer_count_script.txt contará o número de ocorrências de cada sequência única de um determinado arquivo FASTA/FASTQ de entrada e produzirá um arquivo de saída de cada sequência única em ordem decrescente (maior abundância para menor abundância). Os arquivos de saída Count são necessários como entradas para todos os outros programas FASTAptamer. Ver referência34 para mais informações sobre o FASTAptamer. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 4: FASTAptamer_enrich_script.txt compara todas as sequências de quaisquer dois ou três arquivos de entrada, fornece a abundância de todas as sequências exclusivas entre todos os arquivos e fornece todas as combinações de valores de enriquecimento em pares (em RPM) de todas as sequências encontradas em vários arquivos. Ver referência34 para mais informações sobre o FASTAptamer. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 5: fastqc_script.txt é uma ferramenta de controle de qualidade para arquivos FastQ que fornece informações de qualidade fáceis de ler para dados de sequenciamento de alta taxa de transferência, como níveis de duplicação, comprimentos de leitura e pontuações de qualidade. Consulte a referência30 para obter mais informações sobre o FastQC. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 6: FASTX_fwd_rev_merge_script.txt usa o FASTX-Toolkit para produzir o complemento reverso de todas as sequências de um determinado arquivo reverso. Em seguida, ele usa o comando cat (padrão na maioria dos sistemas operacionais UNIX) para mesclar esse arquivo de complemento reverso reverso com um determinado arquivo de encaminhamento de sequências, para fornecer um único arquivo com todas as sequências. Consulte a referência33 para obter mais informações sobre o FASTX-Toolkit. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 7: FASTX_quality_filter_script.txt usa o FASTX-Toolkit para verificar a qualidade das sequências em um determinado arquivo FastQ e pode descartar quaisquer sequências que sejam de baixa qualidade. Este método é geralmente melhor do que os métodos de corte de filtragem de qualidade para análise de sequências de seleção in vitro . O corte envolve a remoção de bases (normalmente perto das extremidades) de sequências com base em baixa qualidade, o que é aceitável para sequenciamento genômico, mas como toda a sequência é necessária para o DNA funcional, aparar as extremidades não é útil. Em vez disso, se muitas bases de uma sequência forem de baixa qualidade, toda a sequência será descartada. Consulte a referência33 para obter mais informações sobre o FASTX-Toolkit. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 8: grep_searcher_script.txt é usado para procurar uma sequência de entrada específica em um arquivo de entrada específico e gerar a saída do ID e da sequência em um arquivo de saída (se ele foi encontrado na entrada). Esse script é útil para pools que são muito heterogêneos (ou seja, têm muitas sequências exclusivas), o que faz com que o FASTAptamer Clust demore muito para ser executado corretamente e resulte em arquivos FASTAptamer Enrich muito grandes para serem abertos em programas de planilha típicos para análise. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 9: gzip_compress_decompress_script.txt usa o Gzip para compactar ou descompactar arquivos. Um arquivo compactado normalmente terá uma extensão de .gz anexada ao nome do arquivo. Recomenda-se compactar arquivos grandes para economizar espaço no arquivo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 10: PEAR_script.txt é usado apenas para arquivos de sequenciamento de extremidade emparelhada e mesclará o arquivo de Leitura 1 com o arquivo de Leitura 2 correspondente. Ver referência32 para mais informações sobre o PEAR. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 11: tar_extraction_creation_script.txt extrairá ou criará arquivos Tar, que são usados para agrupar vários arquivos e/ou diretórios em um único arquivo. Eles também são frequentemente compactados para reduzir o tamanho do arquivo, como com a compactação bz2, conforme incluído neste script. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm nada a revelar.