Imagem de células B CD19+ em um modelo experimental de encefalomielite autoimune em camundongos usando tomografia por emissão de pósitrons

Resumo

Este artigo detalha a metodologia para radiomarcação de um anticorpo monoclonal anti-CD19 humano-específico e como usá-lo para quantificar células B no sistema nervoso central e tecidos periféricos de um modelo de esclerose múltipla em camundongos usando imagens PET in vivo, contagem gama ex vivo e abordagens de autorradiografia.

Resumo

A esclerose múltipla (EM) é a doença desmielinizante mais comum do sistema nervoso central (SNC) que afeta adultos jovens, muitas vezes resultando em déficits neurológicos e incapacidade à medida que a doença progride. Os linfócitos B desempenham um papel complexo e crítico na patologia da EM e são alvo de várias terapêuticas em ensaios clínicos. Atualmente, não há como selecionar com precisão os pacientes para terapias específicas com células B ou quantificar de forma não invasiva os efeitos desses tratamentos sobre a carga de células B no SNC e órgãos periféricos. A tomografia por emissão de pósitrons (PET) tem um enorme potencial para fornecer informações quantitativas altamente específicas sobre a distribuição espaço-temporal in vivo e a carga de células B em indivíduos vivos.

Este trabalho relata métodos para sintetizar e empregar um traçador PET específico para células B CD19⁺ humanas em um modelo bem estabelecido de MS em camundongos conduzido por células B, a encefalomielite autoimune experimental (EAE), que é induzida com glicoproteína humana recombinante de oligodendrócitos 1-125. Aqui são descritas técnicas otimizadas para detectar e quantificar células B CD19⁺ no cérebro e na medula espinhal usando imagens PET in vivo . Além disso, este artigo relata métodos simplificados para contagem gama ex vivo de órgãos relevantes para a doença, incluindo medula óssea, medula espinhal e baço, juntamente com autorradiografia de alta resolução da ligação do traçador CD19 em tecidos do SNC.

Introdução

A EM é um distúrbio neurológico imunomediado; A apresentação única em cada paciente pode tornar o manejo desafiador tanto para os pacientes quanto para os clínicos¹. A doença em si é caracterizada pela presença de lesões desmielinizantes e infiltração de células imunes no cérebro e na medula espinhal, resultando em comprometimento físico e cognitivo2^. O paradigma tradicional de que a EM é uma doença mediada por células T foi desafiado pela primeira vez em um ensaio clínico de fase II de rituximabe³, uma terapia direcionada ao subconjunto CD20⁺ de células B. Desde então, foram desenvolvidas terapias adicionais com células B que têm como alvo CD19⁴, um biomarcador de células B pan-B que é expresso em uma gama mais ampla de células B, o que pode ser diagnóstico e terapeuticamente vantajoso. Além disso, os métodos existentes para avaliar a eficácia do tratamento (isto é, monitorar o número de recidivas e a atividade da ressonância magnética [RM]) não permitem medidas precoces de resposta, colocando os pacientes em risco significativo de danos ao SNC devido à seleção e otimização da terapia subótima. Assim, há uma necessidade crítica de estratégias para monitorar células imunes específicas, como as células B CD19⁺ , em tempo real no SNC e na periferia de pacientes com EM.

A imagem por PET é uma técnica de imagem robusta que permite a visualização in vivo de corpo inteiro de um determinado alvo de interesse, como CD19. Enquanto coletas de sangue, registros de taxas de recidiva e monitoramento de lesões por meio de ressonância magnética fornecem instantâneos sobre a eficácia do tratamento, a imagem PET pode permitir que pesquisadores e clínicos monitorem a eficácia de uma terapia em todo o corpo. Essa abordagem proativa para o monitoramento terapêutico permite que os médicos avaliem a eficácia da medicação em tempo real, permitindo ajustes rápidos conforme necessário. O monitoramento da localização e densidade das populações celulares associadas à doença também permite a avaliação longitudinal da gravidade usando informações anatômicas específicas do paciente. Portanto, é essencial estabelecer métodos analíticos reprodutíveis para utilizar de forma confiável todo o potencial da imagem por PET em ambientes clínicos e pré-clínicos.

Este trabalho descreve métodos (Figura 1) para realizar imagens de PET, contagem gama ex vivo e autorradiografia (ARG) de células B CD19⁺ com um anticorpo monoclonal (mAb) anti-humano CD19 marcado com 64, conhecido como 16C4-TM (⁶⁴-hCD19-mAb), no modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE) de MS induzida em camundongos transgênicos expressando CD19 humano (hCD19) usando a glicoproteína 1-125 de oligodendrócitos de mielina recombinante humana (MOG_1-125). Também fornecemos métodos para avaliar a ligação do radiotraçador de forma precisa e reprodutível no cérebro e na medula espinhal, ambos locais críticos de patogênese frequentemente gravemente afetados neste e em outros modelos neurodegenerativos. Essas técnicas permitem a investigação não invasiva do papel das células B na patologia da doença e têm o potencial de serem traduzidas clinicamente para avaliar a eficácia de terapias anti-células B na EM.

Protocolo

Figura 1: Desenho do estudo. Uma visão geral das principais técnicas neste artigo. (A) Colocar os ratos na cama de varredura de costas reduz o movimento na coluna. (B) PET/CT dos camundongos. (C) Faça uma incisão na face dorsal do animal para expor a coluna vertebral. (D) Bissetriz a coluna vertebral em porções cervical/torácica e lombar e remover os cortes após os cinco cortes indicados. (E) Use uma seringa para remover a medula espinhal da coluna vertebral, fazendo um selo com a seringa e a coluna vertebral e lavando das extremidades cranial e caudal da coluna vertebral, conforme mostrado. (F) Segmentos isolados da medula cervical/torácica e lombar. Abreviação: PET/CT = Tomografia por emissão de pósitrons/tomografia computadorizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com o Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) da Universidade de Stanford, programa credenciado pela Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International). Os camundongos foram aclimatados ao biotério por pelo menos 7 dias antes do início do estudo para minimizar o estresse nos camundongos, pois o estresse pode afetar a indução de EAE.

1. Indução de EAE em camundongos CD19 fêmeas humanizadas

1. Induzir camundongos fêmeas CD19 C57BL/6J humanizadas com idade entre 9-13 semanas com EAE como descrito anteriormente⁵ usando MOG_1-125.

2. Cuidados com animais e pontuação em modelo de camundongo EAE

1. Escore a progressão da doença e os cuidados com os camundongos conforme descrito anteriormente⁵. Em resumo, pontue esse modelo em uma escala de 1 a 5 da seguinte forma: 1 é fraqueza/claudicação da cauda, 2 é membros posteriores enfraquecidos, 3 é paralisia dos membros posteriores, 4 é paralisia dos membros posteriores com fraqueza dos membros torácicos, 5 é moribundo.

3. Conjugação, radiomarcação e caracterização de mAb

1. Conjugar o quelante bifuncional 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-éster mono-N-hidroxisuccinimida do ácido tetracético (éster DOTA-NHS) ao hCD19-mAb para radiomarcação com ⁶⁴.
   1. Usando uma coluna de dessalinização, troque o buffer de armazenamento hCD19-mAb pelo tampão HEPES (pH 8,5-9): condicione a(s) coluna(s) de dessalinização com HEPES. Calcular o número de colunas necessárias com base na capacidade de volume de amostra da coluna de dessalinização e no volume de mAb necessário: tubos de 0,5 ml: 30-130 μL de volume de amostra, 300 μL de lavagem; Tubos de 2 mL: volume de amostra de 200-700 μL, lavagem de 1 mL.
   2. Arrefecer a centrífuga a 4 °C para troca de tampão através da coluna de dessalinização.
   3. Recupere a coluna de dessalinização da geladeira. Retire a parte inferior da coluna de dessalinização, solte a tampa e coloque a coluna em um tubo de coleta.
   4. Centrifugar a 1.500 × g por 2 min para remover a solução de armazenamento; Descarte o fluxo que contém a solução de armazenamento e reutilize o tubo de coleta. Marque uma linha na coluna onde o ponto mais alto da resina compactada de dessalinização é inclinado para cima.
   5. Adicione o buffer HEPES ao lado inferior da coluna de dessalinização. Colocar a coluna de dessalinização na centrífuga com a linha voltada para fora; girar a 1.500 × g por 2 min. Descarte o fluxo e reutilize o tubo de coleta.
   6. Repita as etapas 3.1.4 e 3.1.5 2x usando o mesmo tubo de coleta e descartando o fluxo entre as etapas.
   7. Coloque a coluna de dessalinização condicionada em um novo tubo de coleta e etiqueta; este tubo conterá o hCD19-mAb.
   8. Adicionar hCD19-mAb à parte superior da(s) coluna(s) de dessalinização condicionada(s) e utilizar tampão HEPES para enxaguar o frasco para injetáveis de mAb vazio; adicione-o à parte superior da coluna de dessalinização (volume total de acordo com a recomendação do fabricante). Gire a 1.500 × g por 2 min para eluir o hCD19-mAb. Mantenha o fluxo que contém o hCD19-mAb.
   9. Medir a concentração de hCD19-mAb usando um espectrofotômetro UV/Vis e ajustar para 0,5 μg/μL com tampão HEPES, se necessário.
   10. À solução de hCD19-mAb, adicionar 1/50^º o volume da solução de mAb de 0,5 M de EDTA para obter a concentração final de EDTA de 0,01 M na solução de hCD19-mAb. Deixe a solução de hCD19-mAb-EDTA repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos.
   11. Retire o éster DOTA-NHS do congelador e deixe-o chegar à temperatura ambiente (10-15 min). Calcule o volume de DMSO a ser adicionado ao éster de DOTA-NHS para fazer uma concentração de DOTA que permitirá a adição da razão molar DOTA/mAb desejada (que é tipicamente da ordem de 1-2 DOTA/mAb).
       NOTA: O volume de DMSO-DOTA-NHS-éster adicionado ao hCD19-mAb não deve exceder 10% do volume de mAb. Isso deve ser feito usando uma planilha para que possa ser feito de forma rápida e repetida.
   12. Com base na proporção desejada de DOTA para hCD19-mAb, calcule a quantidade de DOTA-NHS-éster a ser adicionada ao hCD19-mAb.
       nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg de DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → mL de DMSO → fator de diluição da solução de DOTA/DMSO
   13. Pesar 1-2 mg do éster DOTA-NHS e adicionar cuidadosamente o volume correto (calculado na etapa 3.1.11) de DMSO ao éster DOTA-NHS; misture e gire para baixo.
   14. Pipetar o volume calculado da solução de éster de DOTA-NHS (passo 3.1.12) para a solução de hCD19-mAb; limpe a parte externa da ponta da pipeta antes da adição para garantir que o éster extra DOTA-NHS não seja adicionado (sem alterar a quantidade na pipeta). Misture suavemente e gire para baixo.
   15. Leve ao frigorífico (4 °C) para reagir durante a noite (12-16 h).
2. Purificação e concentração
   1. Arrefecer a centrífuga a 4 °C para as etapas de troca do tampão do concentrador centrífugo; Coloque um bloco de tubo de PCR metálico sobre gelo seco para congelar o conjugado.
   2. Remova a reação DOTA-hCD19-mAb da geladeira e tempere adicionando tampão TRIS de grau biológico: 10% do volume total da reação. Retirar 10-20 μg da amostra para análise por espectrometria de massas.
   3. Condicionar a(s) coluna(s) de dessalinização conforme descrito acima (passos 3.1.1-3.1.5), utilizando tampão acetato de amónio 0,1 M, pH 5,5.
   4. Trocar a solução de DOTA-hCD19-mAb por acetato de amónio (passos 3.1.1-3.1.8).
   5. Concentrar a solução de DOTA-hCD19-mAb: adicionar a solução a um concentrador centrífugo de peso molecular de 50 kDa, seguindo as recomendações do fabricante quanto ao volume. Centrifugar a 4.000 × g por 10 min (ou até que o volume seja reduzido em 80%-90%); Descartar o fluxo.
   6. Repita mais nove vezes (10 no total): adicione acetato de amónio suficiente para trazer o volume de volta ao volume máximo recomendado.
      NOTA: O total deve ser o que foi inicialmente adicionado, incluindo o que resta na coluna, geralmente 400-450 μL para um concentrador centrífugo de capacidade de 500 μL.
      1. Enxaguar o frasco para injetáveis de reacção com tampão acetato de amónio para recuperar qualquer DOTA-hCD19-mAb residual; Adicione a lavagem ao concentrador centrífugo.
      2. Centrifugar a 4.000 × g por 10 min.
         NOTA: O tempo de rotação pode ser reduzido em rotações subsequentes se o volume for reduzido para 80%-90% em menos tempo.
   7. Retire a solução proteica do concentrador centrífugo. Observe o volume total do DOTA-hCD19-mAb.
      1. No concentrador centrífugo 2, adicionar tampão acetato de amónio suficiente para um volume total de 100 μL e pipetar para misturar. Tampe a coluna centrífuga concentradora e inverta. Gire a 4.000 × g por 2 min para coletar a solução. Transfira para um novo tubo.
      2. No concentrador centrífugo 500, use uma pipeta para coletar a solução de mAb do concentrador centrífugo; adicionar a um novo tubo.
   8. Meça a concentração usando um espectrofotômetro UV-Vis. Se a concentração for superior a 2 mg/ml, diluir com acetato de amónio para 2 mg/ml.
   9. Alíquota 100 μg por tubo de PCR (aproximadamente 50 μL); marcar os tubos com DOTA-hCD19-mAb, data, massa e concentração. Gire os frascos para injetáveis.
   10. Congele rapidamente o DOTA-hCD19-mAb no bloco de PCR refrigerado em gelo seco (ou congele em gelo seco). Depois de congeladas todas as amostras, coloque-as num congelador a -80 °C.
   11. Medir o número de DOTA por hCD19-mAb por espectrometria de massa. Mantenha uma amostra de anticorpo não conjugado (puro) de cada conjugação para calcular a proporção. Use a equação (1) apresentada abaixo; peso molecular é abreviado MW.
       (1º)
3. Radiomarcação
   OBS: Usar equipamentos de proteção individual (EPIs) apropriados para o manuseio da radioatividade, incluindo jaleco, luvas, dosímetros de corpo e anel, seguindo as normas institucionais. Inspecione e troque luvas regularmente para evitar contaminação radioativa. Use blindagem de chumbo e aumente a distância da fonte radioativa manuseando com pinças quando possível.
   1. Transfira a radioatividade do frasco para injetáveis de transporte para um novo frasco para injetáveis utilizando uma pipeta. Meça a radioatividade.
   2. Remova uma alíquota para a primeira reação de radiomarcação. Adicionar 50 μL de acetato de amónio (pH 5,5) por 1 mCi de ⁶⁴-CuCl₃. Meça o pH pipetando 1 μL em uma tira de pH com uma faixa que capture 5,5 com resolução suficiente para distinguir entre 5 e 6.
   3. Se o pH não for 4-5,5, altere-o usando NaOH 1 M ou HCl 0,1 M. Adicione pequenas quantidades, 1-5 μL, de NaOH 1 M se o pH for menor que 4 ou 0,1 M HCl se o pH for maior que 5,5 até que o pH correto seja atingido. A cada adição, misture bem, gire para baixo e meça o pH conforme descrito acima. Observe cada adição e remoção de qualquer solução (inclusive para verificar o pH) para que o volume final possa ser calculado.
   4. Uma vez atingido o pH ótimo, adicionar 10 μg de DOTA-hCD19-mAb por 1 mCi de ⁶⁴-CuCl₃. Misture delicadamente e gire para baixo brevemente.
   5. Coloque o frasco para injetáveis de reacção num misturador termométrico regulado para 37 °C e 400 rotações por minuto (rpm).
   6. Após 30 min, extinguir a reação: dividir o volume total da reação por 50 e adicionar esse volume de 0,5 M EDTA à mistura de reação.
   7. Determine a eficiência de marcação usando cromatografia instantânea de camada fina (ITLC) para medir a porcentagem de cobre ligado e livre na solução.
      1. Corte tiras de papel TLC de 1 cm de largura. Marque 1 cm da parte superior e inferior da tira e prepare um tubo (balão cônico de 50 mL) com fase móvel inferior a 1 cm de ácido cítrico 0,1 M (o nível da fase móvel deve estar abaixo da marca de 1 cm na tira quando colocado no tubo).
      2. Pipetar 1 μL da solução de reacção na tira na marca inferior de 1 cm (frente do solvente) e colocar a tira no tubo. Observe até que a frente do solvente atinja a marca superior de 1 cm, retire a tira e envolva-a em um pedaço de filme plástico.
      3. Coloque a tira na plataforma e execute-a através de um scanner de imagem radio-TLC. Procure o mAb radiomarcado na origem e ⁶⁴livre que viaja com a fase móvel frontal (Figura 2). Se a percentagem de cobre livre for inferior a 5% (95% de eficiência de rotulagem), proceda à injeção nos animais. Se a percentagem de cobre livre for superior a 5%, proceda à purificação.
         NOTA: A porcentagem de cobre livre geralmente depende da proporção de DOTA-mAb para ⁶⁴, tempo de reação, pH e temperatura. As condições de reação devem ser otimizadas por cada usuário para cada novo mAb para garantir resultados consistentes.
4. Purificação através de uma coluna gravitacional de grau de ADN descartável
   1. Condicionar uma coluna de fluxo gravitacional de grau de DNA descartável (coluna de troca de dessalinização/tampão) de acordo com as instruções do fabricante. Colocar a coluna gravitacional de grau de ADN descartável num suporte de anel ou outro instrumento atrás de uma blindagem de chumbo adequada; Certifique-se de que o aparelho é estável e facilmente móvel. Coloque o tubo por baixo da coluna.
   2. Pipetar a mistura bruta de reação na resina da coluna de fluxo por gravidade. Espere até que todo o líquido tenha fluído para a resina. Pipetar PBS suficiente para trazer todo o volume (produto bruto mais PBS) para 500 μL. Eliminar o fluxo.
   3. Coloque a coluna sobre tubos de centrífuga de 1,5 mL rotulados como 1-10. Adicionar 1 ml de PBS à coluna. Colete cinco gotas em cada tubo até que o fluxo tenha parado.
      NOTA: Menos de 10 tubos podem ser necessários.
   4. Tampar a parte inferior da coluna e medir a radioatividade residual. Meça cada frasco para injetáveis com o flowthrough. Para cada frasco para injetáveis com mais de 50 μCi, preparar um ITLC por etapa 3.3.7 para medir a percentagem de cobre ligado em cada fração.
      OBS: As primeiras uma ou duas frações conterão apenas fase móvel; o mAb radiomarcado eluirá primeiro (tipicamente frações 2 ou 3 a 5 ou 6) e o ⁶⁴livre eluirá por último (alguns grudarão na coluna). A porcentagem ligada a ⁶⁴pode variar entre as frações.
   5. Combinar as frações com ligação superior a 95% (menos de 5% de cobre livre); Use a solução injetável. Se desejar, realizar HPLC de exclusão de tamanho para confirmar a marcação radioativa⁵ e calcular a atividade molar. Salve uma alíquota para medir a concentração em um espectrofotômetro UV-Vis depois que ele tiver decaído 10 meias-vidas (127 h ou 5,3 dias).

4. Preparação da dose

NOTA: Antes de manusear a dose, use EPI adequado, incluindo jaleco, dosímetros de corpo e dedo e luvas.

1. Injetar ⁶⁴-DOTA-hCD19-mAb 18-24 h antes da varredura PET, para permitir a circulação adequada do radiotraçador no corpo.
2. Coloque imediatamente o recipiente de chumbo com o ⁶⁴-DOTA-hCD19-mAb atrás da blindagem de chumbo. Ligue o contador Geiger para monitorar possíveis contaminações.
   NOTA: Troque as luvas com frequência ao manusear material radioativo. Recomenda-se luvas duplas durante a retirada de doses para facilitar a troca rápida de luvas. Coloque sempre materiais perfurocortantes e lixo contaminados na área de lixo protegida designada.
3. Diluir o ⁶⁴-DOTA-hCD19-mAb até uma concentração adequada num tubo de centrífuga de plástico de baixa ligação de 1,5 ml.
   NOTA: O ⁶⁴-DOTA-hCD19-mAb liga-se ao plástico se não for de baixa ligação; ^64ºvai se ligar ao vidro.
   1. Diluir o radiotraçador em soro fisiológico para evitar a radiólise e simplificar a obtenção de doses consistentes.
   2. Preparar doses para administrar entre 75 e 150 μCi em 100 μL, se possível. Certifique-se de que o volume total máximo injetado não exceda 10% do peso corporal do rato.
4. Use uma seringa de insulina de 500 μL (50 cc) para retirar a dose do tubo de plástico de baixa ligação. Certifique-se de que não há bolhas na seringa, pois ela será injetada por via intravenosa.
   1. Pré-rotular as seringas com os números de animais correspondentes.
   2. Registre a atividade e o tempo de dose em um caderno de laboratório para análise de dados.
   3. Ter as doses prontas para injeção assim que os animais forem cateterizados para reduzir o tempo sob anestesia.
5. Após o preparo das doses, prepare um padrão (simulador) para varredura para gerar um fator de calibração.
   1. Encher um tubo cônico de 15 mL com 50-75 μCi de atividade diluída em água (ou PBS).
      NOTA: Garantir a mistura completa da solução. O padrão pode ser livre ⁶⁴sobra da rotulagem.
      1. Meça a quantidade de atividade no padrão e registre o tempo.

5. Canulação e Injeção

NOTA: Ver métodos⁶ descritos anteriormente para canulação intravenosa de ratinhos para injeção do radiotraçador⁶.

1. Pesar e pontuar os ratinhos quanto à gravidade da doença, conforme descrito na secção 2.1, antes de anestesiar os ratinhos numa caixa knockdown preenchida com isoflurano a 1,5-3% em preparação para administração de radiotraçador.
   NOTA: Estes ratos serão injetados na parte superior da bancada, não no scanner PET como descrito anteriormente. Não há necessidade de colar os cateteres no lugar para injeção, pois os camundongos não serão movidos entre a canulação e a injeção.
2. Uma vez que um mouse é canulado, insira a agulha na extremidade do cateter e injete lentamente. Após a injeção, siga com uma pequena lavagem de soro fisiológico através do cateter para garantir que toda a dose seja injetada.
   OBS: O volume deve ser aproximadamente igual ao volume morto do cateter, que é de 50 μL para os cateteres utilizados pelos autores.
   1. Injetar sobre um pedaço de lenço de laboratório para coletar quaisquer gotejamentos de radiotraçador; Inclua isso ao medir a dose residual.
   2. Registre o tempo de injeção em um caderno de laboratório.
3. Remova a cânula imediatamente após a injeção. Meça a cânula, a seringa de dose e o tecido usando um calibrador de dose para determinar a dose residual que não foi injetada no camundongo.
   1. Registre a atividade e o tempo em um caderno de laboratório.
4. Depois que os camundongos forem injetados, rotule suas gaiolas com um cartão de gaiola indicando que os camundongos são radioativos. Registrar e registrar as gaiolas de acordo com as diretrizes institucionais. Em seguida, coloque os ratos em uma área de retenção radioativa designada.

6. PET/CT

1. Realizar imagens de PET 18-24 h após a injeção de ⁶⁴-DOTA-hCD19-mAb. Pese e marque os ratos antes da digitalização.
   NOTA: As instruções de operação do scanner dependem do scanner que está sendo usado.
   1. Verifique se o componente de raios-X do scanner PET/CT está aquecido e pronto para aquisição.
   2. Abra o software de aquisição do scanner PET no computador.
   3. No menu suspenso Login do investigador , clique nas informações apropriadas do laboratório.
   4. Na página Projeto , crie um novo projeto ou selecione um projeto existente no menu suspenso.
   5. Quando o prompt de inicialização aparecer automaticamente na tela, clique em Home Bed e aguarde a cama para casa. Em seguida, clique em Aquecer CT.
      1. Verifique se a porta de proteção da TC está fechada para permitir que a TC aqueça.
2. Enquanto o scanner está aquecendo, marque os camundongos EAE e injete-os por via subcutânea com 0,2-0,4 mL de soro fisiológico quente no flanco para hidratação.
3. Depois que o scanner estiver aquecido, volte ao computador para configurar os exames PET para o estudo.
   Observação : eles podem ser configurados antes do dia da varredura.
   1. No cabeçalho Estudos Recentes , clique em Criar Novo Estudo. Preencha o nome do estudo, protocolo, composição e informações do assunto.
      1. Se estiver executando um PET/CT, selecione Protocolo PET primeiro e, em seguida, selecione Protocolo CT.
         Observação : normalmente, uma TC padrão é suficiente para varredura do modelo de mouse EAE. Uma tomografia computadorizada tem 1 min de duração e é adquirida com binning a 2 x 2 na tensão de 80 kVp, corrente de 150 μA e projeções de 720. As imagens de TC são reconstruídas usando um algoritmo de Feldkamp modificado.
      2. Para o protocolo PET, escolha uma varredura estática de 64 minutos de 10 a 15 minutos. Se essa verificação ainda não estiver na lista de protocolos disponíveis, adicione-a clicando na guia Protocolos no menu Padrão , Criar Novo Protocolo | Menu suspenso Isótopos . Se o isótopo desejado não estiver listado, clique em Mais | Adicione da Biblioteca e adicione o isótopo desejado. Defina a duração da varredura, clique no botão de opção para Static Scan, nomeie o protocolo e clique em Save.
      3. Retorne à guia Estudos e continue a nomear e configurar todas as varreduras desejadas para o dia.
         NOTA: Recomenda-se também configurar um exame de "Teste de TC" usando apenas uma TC padrão para verificar o posicionamento do leito do primeiro exame para garantir a colocação ideal. Esta deve ser a primeira varredura executada para o estudo.
4. Quando o scanner estiver pronto, anestesiar os ratos em uma caixa knockdown para prepará-los para a varredura.
   NOTA: Nesta fase, os ratos estão provavelmente muito doentes; A melhor prática é minimizar o tempo sob anestesia.
   1. Aplique gel para os olhos.
5. Verifique se a cama de varredura de quatro mouses está equipada com elementos de aquecimento, como almofadas de aquecimento ou ar aquecido, com isoflurano ajustado para 1,5%-2% e almofada de aquecimento ligada (Figura 3). Coloque os ratos em decúbito dorsal na cama de escaneamento.
   1. À medida que a doença EAE progride, a coluna vertebral do rato torna-se severamente curvada. Escaneie os ratos enquanto eles estão de costas para endireitar a coluna o máximo possível, melhorando a análise a jusante. Puxe suavemente a cauda do rato para ajudar a endireitar a coluna.
6. Uma vez na posição supina, tape firmemente cada mouse no lugar com fita de microscópio macio. Use uma tira de fita sobre a cabeça e outra suavemente sobre a barriga para minimizar o movimento devido à respiração.
   1. Registre em um bloco de anotações de laboratório qual mouse está em que posição de digitalização.
7. Depois que os mouses estiverem protegidos, retorne ao computador de digitalização para operar o scanner.
8. Abra o menu Controlador de movimento . Clique em PET Center FOV para mover os ratos na cama de digitalização para o anel PET. Para a primeira varredura do dia, clique em CT Center FOV. Uma vez na posição, execute o exame de TC Test para garantir que a posição está correta; repetir até que a posição do leito seja satisfatória.
   1. Coloque um pequeno pedaço de fita branca sobre a cama de digitalização para marcar o posicionamento correto da cama para o restante do estudo.
9. Quando a cama estiver no lugar para a varredura PET, inicie a sequência de varredura clicando em Executar.
   1. Aguarde até que o scanner se mova automaticamente do anel PET para a TC.
   2. Verifique sempre visualmente se os animais se moveram para a posição adequada tanto para PET quanto para CT.
   3. Registre a hora de início da varredura em um caderno de laboratório para correção de decaimento da dose injetada durante a análise de dados.
10. Após a conclusão da varredura, permita que a imagem seja reconstruída. Verifique os dados antes de remover os animais.
    NOTA: A reconstrução de OSEM (expectation-maximization) de subconjuntos ordenados em 3D levará aproximadamente 5 minutos para uma varredura estática.
11. Verificar e aprovar visualmente os dados, usando o baço como controle positivo, pois esse tecido contém um grande número de células B. Retire os animais do leito de varredura e coloque-os em uma caixa knockdown cheia de isoflurano em preparação para perfusão e posterior dissecção.
12. Repita as etapas 6.5-6.12 para os camundongos restantes no estudo.
13. Quando todos os ratos forem escaneados ou ao digitalizar um grupo que tenha um lugar aberto no leito de digitalização, digitalize o padrão preparado na etapa 4.6.

7. Dissecção para contagem gama ex vivo e autorradiografia

1. Antes de dissecar, certifique-se de que todos os tubos de contagem gama e centrífuga foram pré-pesados.
2. Realizar eutanásia por perfusão, como descrito anteriormente⁶, com PBS e toracotomia enquanto os camundongos estão profundamente anestesiados (inalação contínua de isoflurano a 4%, 2 L/min a 100% O₂).
3. Para remover a medula óssea, corte ambos os fêmures no joelho e na pelve. Certifique-se de que ambas as cabeças são removidas do fêmur.
   1. Coloque ambos os fêmures em um tubo centrífugo de 0,5 mL que tenha um orifício no fundo (usando uma agulha de 20 G) e tenha a tampa cortada.
   2. Colocar o tubo de 0,5 mL contendo os fêmures dentro de um tubo centrífugo de 1,5 mL com a tampa cortada.
   3. Coloque toda a configuração do tubo em uma mini centrífuga. Gire por 4 min a 4.500 × g.
      NOTA: A medula óssea deve ser deslocada através do orifício no tubo centrífugo de 0,5 mL e depositada no fundo do tubo de centrífuga de 1,5 mL.
      1. Separe os tubos. Pesar os fémures vazios no tubo de centrífuga de 0,5 ml. Pesar a medula óssea no tubo centrífugo de 1,5 mL. Coloque cada tubo de centrífuga em tubos de contagem gama.
4. Remova o cérebro usando fórceps e tesouras, tomando cuidado para manter o tronco cerebral intacto. Coloque o cérebro em um tubo de contagem gama. Registre o peso seco, lave com PBS e mantenha no gelo até estar pronto para a contagem.
5. Para remover a medula espinhal, execute as seguintes etapas.
   1. Remova a pele e os pelos fazendo uma incisão na face dorsal do animal para expor a coluna vertebral (Figura 1).
   2. Separe a região lombar (L) da cervical (C) e torácica cortando ao longo de três planos transversais ao redor e através da coluna vertebral: na base do pescoço (vértebra C1) (Figura 1D, Número 1); na base da caixa torácica (vértebra L1) (Figura 1D, Número 2); na base da pelve (vértebra L5) (Figura 1D, Número 3).
   3. Corte sob a caixa torácica (Figura 1D, Número 2).
   4. Corte diretamente acima do sacro para separar a região lombar da coluna. Corte cuidadosamente a coluna vertebral a partir da extremidade pélvica até que a medula lombar esteja visível (Figura 1D, Número 3). Aparar os tecidos circundantes para isolar as regiões lombar e cervical/torácica da coluna vertebral (Figura 1D, Números 4 e 5).
   5. Para expulsar a medula espinhal, use uma seringa deslizante (3-10 mL) preenchida com PBS. Crie um selo entre a seringa e a coluna vertebral usando o polegar e o indicador.
      1. Empurre suavemente o PBS através da seringa para expulsar a medula espinhal para uma almofada absorvente (Figura 1E); repetir para ambas as regiões da coluna vertebral. Coloque os tecidos da medula espinhal em um tubo de contagem gama.
      2. Registre o peso seco e adicione PBS para garantir que o tecido esteja no fundo do tubo para evitar a secagem. Coloque o tubo no gelo até ficar pronto para a contagem.
      3. Expulsar a medula cervical/torácica da extremidade cranial e a medula lombar da extremidade caudal da coluna vertebral (Figura 1E).

8. Contagem gama ex vivo

1. Abra o software do contador gama. Navegue até a lista de trabalho e selecione o protocolo desejado, como um protocolo de contagem de 30 s para ⁶⁴.
2. Prepare pelo menos três padrões em tubos separados. Execute-os agora para uso na análise (etapa 10.2). Objetivo de fazer três volumes de réplica e quantidades de atividade em três tubos separados.
   NOTA: Um volume de 500 μL dá bons resultados. Enquanto a atividade será determinada pela máquina usada, 10 μCi geralmente funciona bem.
3. Coloque os padrões em um rack etiquetado com o código de barras correspondente ao protocolo desejado a ser executado. Coloque o rack no contador gama.
4. Depois de registrar os pesos dos órgãos, coloque os tubos contendo os órgãos no rack de contagem gama após os tubos contendo os padrões.
   NOTA: Os órgãos de interesse para este modelo podem incluir linfonodos axiais, sangue, medula óssea, cérebro, linfonodos cervicais, fêmur, coração, fígado, medula espinhal lombar, músculo, baço, cauda e medula espinhal cervical/torácica.
5. Coloque um rack com um código de barras de parada na parte de trás do contador gama.
6. Pressione o botão Reproduzir no computador. Se possível, não pressione Play até que haja vários racks ou órgãos a serem executados para permitir que todos os tubos sejam contados continuamente em um arquivo. Certifique-se de que um rack com um código de barras de parada esteja na parte de trás do contador gama para cada execução.
7. Execute até que todas as amostras tenham sido contadas. Salve e exporte o arquivo.

9. Autorradiografia (ARG) ex vivo do tecido do SNC

1. Seguir os passos publicados anteriormente para ARG cerebral e medular (excluindo os passos 2-6 descritos por Chaney et al., pois os camundongos já são injetados com radiotraçador do PET scan)⁶.
   NOTA: Instruções específicas para preparar o ARG da medula espinhal estão listadas aqui⁶.
2. Após a contagem gama estar completa para a medula lombar e cervical/torácica, coloque imediatamente os tubos no gelo até que todos os tecidos do SNC tenham sido contados.
   NOTA: Consulte o método publicado anteriormente para ARG do cérebro⁶.
3. Incline suavemente os tubos para permitir que a medula espinhal caia para fora em uma almofada absorvente. Se a medula espinhal grudar na lateral do tubo, lave suavemente com PBS frio e incline o tubo novamente. Seque cuidadosamente cada medula espinhal manchando suavemente com um tecido de laboratório. Coloque as medulas, secas de forma organizada, sobre um pedaço de papel preto grosso.
   1. Etiqueta ao lado da medula espinhal com uma caneta branca para fácil identificação.
   2. Deixe espaço nos cantos e no meio do papel preto para colocar pilhas de três lâminas de microscópio para atuar como espaçadores para evitar a compressão da medula espinhal quando o ARG estiver fechado. Use 5-7 pilhas.
4. Uma vez que todas as medulas, lombar e cervical/torácica estejam posicionadas sobre o papel preto e etiquetadas, coloque cuidadosamente o pedaço de papel no ARG. Coloque o aberto em uma bandeja de gelo seco para congelar a medula espinhal.
5. Uma vez congelado, coloque delicadamente o filme plástico entre a tela de armazenamento digital de fósforo e a medula espinhal e coloque a tela em cima das amostras. Feche imediatamente o e coloque-o no congelador de -20 °C por aproximadamente 10 meias-vidas (~127 h).
6. Quando o tempo de exposição estiver completo, digitalize o filme usando um imageador de fósforo. Analise a imagem digital resultante (consulte a secção 12 para obter instruções).

10. Análise dos dados de biodistribuição

1. Montar uma planilha de "Correção de Dose" para determinar matematicamente a correção temporal do decaimento radioativo, normalizando assim as doses de radiação e permitindo comparações entre os sujeitos.
   1. Corrigir todas as doses para o tempo de injeção, contabilizando a atividade residual deixada na seringa e no cateter após a injeção.
   2. Usando os padrões preparados no passo 8.2, a média da quantidade de atividade (μCi) e das contagens normalizadas por minuto (CPM). Divida o CPM médio pelo valor médio da atividade padrão para obter CPM/μCi.
      NOTA: Certifique-se de que a quantidade de atividade para cada padrão seja corrigida para o momento em que o contador gama conta o CPM dos padrões. O contador gama deve normalizar todos os valores de CPM para a hora de início do protocolo.
2. Configure a planilha "Resultados" para calcular a porcentagem final de dose injetada por grama de tecido (%ID/g) para cada amostra.
   1. Corrigir o CPM normalizado do contador gama para cada amostra contada até o momento da injeção do animal.
      NOTA: A correção de decaimento pode ser para qualquer ponto de tempo; garantir que todas as doses e valores de CPM sejam corrigidos para o mesmo ponto de tempo.
   2. Normalizar o CPM corrigido para a massa de cada amostra para determinar o CPM por amostra. Calcule o CPM total injetado subtraindo o CPM na cauda do CPM injetado calculado.
      NOTA: A cauda não precisa ser corrigida em massa, pois esse valor de CPM será simplesmente subtraído do total de CPM injetado para contabilizar qualquer traçador extravenoso da injeção.
   3. Divida o CPM por massa pelo CPM total injetado para calcular %ID/g.
3. Configure uma planilha de "Resumo" para exibir os resultados finais para entrada em um software gráfico e posterior visualização de dados e análise estatística.

11. Análise de imagens PET

1. Abra o software de análise PET. lamber em arquivo |Abrir dados locais | DICOM. Localize o arquivo desejado (formato DICOM). Abra o PET e o CT.
2. No Gerenciador de dados, ajuste o contraste PET e CT para os níveis desejados.
3. Registre e corte ratos individuais.
   1. No menu Navegação , selecione a guia Reorientação/Registro .
   2. Vá para o menu Rígido dentro desta guia. Designe a tomografia computadorizada (0 ) como a varredura fixa e a varredura PET (1) como a varredura em movimento .
   3. Selecione Transformação Rígida e Qualidade Rápida . Clique em Cadastrar.
   4. Após a conclusão do registro (5-10 min), clique na marca de seleção para salvar o registro.
   5. Inspecione visualmente os dados para garantir que o registro foi bem-sucedido. Exporte a sessão clicando em Arquivo | Sessão | Exportação.
   6. Em seguida, corte cada mouse em um corte de corpo inteiro: vá para o menu Navegação e clique em Recortar. Arraste os lados de cada seção transversal da borda externa para dentro.
   7. Quando o mouse desejado estiver bem cortado, clique na marca de seleção e exporte a sessão para salvar.
   8. Em seguida, corte e endireitar as cabeças de cada mouse para análise cerebral usando o manual Tradução, rotações e inversões no menu Registro/Reorientação . Exportar para salvar.
4. Analise a medula espinhal.
   1. Para iniciar a análise de regiões de interesse (ROIs) na medula espinhal, abra a Ferramenta de ROI 3D no Menu de Navegação .
   2. Sob o cabeçalho ROIs, use o sinal de mais na parte inferior do menu para criar seis ROIs: ROI Lombar, ROI Cervical/Torácica, Esqueleto Lombar, Esqueleto Torácico, Medula Espinhal Lombar, Medula Espinhal Torácica.
      NOTA: As ROIs Lombar e Cervical/Torácica são grandes ROIs generalizadas que serão usadas para criar as ROIs do esqueleto (Figura 4).
   3. Para evitar interferência visual do sinal PET com esta etapa, clique em F3 para desligar o PET.
   4. Vá para o topo do 3D ROI Tool Operator. Clique no ponto sólido à direita do símbolo do cursor para abrir o modo de pintura 3D e o menu Erode/Dilate .
   5. Selecione Esfera e altere o tamanho para 20 pixels. Defina Dilatar como +5.
      1. Antes de prosseguir, vá para a parte inferior do menu. Certifique-se de que o ROI lombar esteja selecionado, pois este é o primeiro ROI a ser desenhado.
   6. Na TC, encontre a vértebra L6 da coluna vertebral (onde a coluna se encontra com os quadris). Iniciando uma vértebra acima de L6, desenhe uma ROI Lombar ROI aproximada sobre as cinco vértebras acima dos quadris (vértebras L1-L5). Em seguida, mude para ROI Cervical/Torácica e trace o restante da coluna até a base do crânio.
      NOTA: Isso não precisa ser preciso, pois é usado para indicar onde o limiar de Otsu deve ocorrer na etapa 11.4.8.
   7. Depois de desenhar os ROIs generalizados, vá para o topo do operador. Selecione o menu Algoritmos de segmentação .
   8. No menu suspenso, selecione Otsu Thresholding. Para a entrada, selecione ROI lombar. Na parte inferior do menu, verifique se Esqueleto lombar está selecionado. No menu suspenso ao lado de Imagem, verifique se a tomografia computadorizada está selecionada e clique em Aplicar. Repita para ROI Cervical/Torácica e Esqueleto Torácico.
      1. Se o limiar de Otsu não realçar suficientemente a coluna vertebral, use o limiar global e altere o valor mínimo para 350 e o máximo para 3.500 para o limiar manual e ajuste conforme necessário para isolar as vértebras.
   9. Depois de usar o Otsu Thresholding para criar as ROIs do Esqueleto, retorne ao menu Navegação (ícone do cursor). Exclua ou marque a coluna H (ocultar) para as ROIs Lombar e Cervical/Torácica ásperas para ocultá-las. Marque a coluna I (imutável) para ambas as ROIs do Skeleton para que elas não possam ser editadas.
   10. Finalmente, volte ao topo do Operador de Ferramentas de ROI 3D e vá para o menu Pintura 3D para desenhar as ROIs da Medula Espinhal.
       1. Selecione a ferramenta Esfera novamente e trace a medula espinhal dentro do esqueleto para Lombar e Torácica, garantindo que o ROI correto seja selecionado na parte inferior do menu.
       2. Para apagar qualquer ROI, clique em Comando/Controle e desenhe sobre a peça a ser apagada.
       3. Verifique a ROI da medula espinhal de todos os três planos para certificar-se de que não há ROI desenhada fora da coluna vertebral.
5. Exportar resultados de análise da medula espinhal.
   1. Se o sinal PET foi desligado na etapa 11.4.3, pressione F3 depois que as ROIs da medula espinhal forem desenhadas para ligar o PET novamente, ou selecione o Visual Controller (VC) e clique na barra PET.
   2. Volte para o menu Navegação (ícone do cursor). Clique no ícone de grade para Mostrar tabela. Copie a tabela para o software de planilha e salve.
   3. Por fim, exporte o arquivo no software de análise PET, conforme descrito acima, para salvar os ROIs desenhados.
6. Analise o cérebro usando um atlas 3D semi-automatizado.
   1. Abra o arquivo de corte de cabeçalho. Importe o atlas do cérebro do mouse acessando o menu Módulos Avançados e selecionando a Ferramenta Atlas do Cérebro 3D. Verifique se a referência está definida como CT e se a opção de corte está desmarcada. Defina um caminho para o diretório de saída.
   2. Em Configuração avançada, altere Transform para Versor-Affine. Mantenha todas as outras configurações padrão. Clique em Executar.
   3. Ajuste manualmente o atlas no menu Reorientação/Registro e use a TC do crânio como diretriz para o ajuste do atlas.
      1. Tenha muito cuidado se a escala for necessária, pois isso pode afetar muito os volumes da estrutura cerebral. Clique na marca de seleção quando o ajuste estiver concluído.
      2. Execute novamente o atlas com a opção Importar ROIs 3D selecionada.
      3. Exporte o arquivo para salvar o atlas instalado na cabeça cortada.
   4. Depois de desenhar e exportar todas as ROIs dos órgãos desejados, calcule um valor de correção de vinculação padrão. Corrija todos os dados e converta para %ID/g conforme descrito anteriormente⁶. Normalizar para o órgão que se adequa ao modelo animal, como o coração para normalizar para radiotraçador presente no pool sanguíneo.

12. Análise autorradiografia ex vivo

1. Abra o arquivo de imagem digital (.gel) usando o software de análise de imagem. Ajuste o brilho e o contraste para o limite desejado. Aplique uma tabela de pesquisa de cores adequada, se desejar.
   NOTA: Royal ou Grays são recomendados para facilitar a visualização.

Resultados

O hCD19-mAb foi conjugado ao DOTA e radiomarcado com ⁶⁴como mostra a Figura 2. EAE e camundongos virgens de pesquisa foram submetidos à PET/CT (Figura 3) 18-24 h após a injeção com ⁶⁴-DOTA-hCD19-mAb. As imagens de PET/CT foram co-registradas usando o software de análise PET, e os tecidos do SNC foram analisados usando ROIs manuais ou um atlas cerebral 3D semi-automatizado. A ligação do radiotraçador nas ROIs (Figura 4) foi maior em camundongos EAE do que em camundongos virgens. A contagem gama ex vivo e a ARG mostraram ligação aumentada na medula espinhal (segmentos torácicos lombar e cervical) e no cérebro (somente ARG) de camundongos EAE em comparação com virgens (Figura 5 e Figura 6). A contagem gama ex vivo de camundongos perfundidos também mostrou diminuição da ligação do radiotraçador em órgãos periféricos, incluindo baço, fêmur e medula óssea (Figura 5), consistente com células B saindo da periferia e infiltrando o SNC neste modelo de EAE.

Figura 2: Esquema de conjugação e radiomarcação para geração de 64 anticorpos monoclonais CD19 marcados com, 16C4-TM mAb (⁶⁴-DOTA-hCD19-mAb), além de dados de controle de qualidade. (A) Reação do éster de DOTA-NHS com anticorpo monoclonal hCD19 para produzir conjugado hCD19-DOTA (não em escala) e marcação radioativa com 64-CuCl₃ para produzir ⁶⁴-DOTA-hCD19-mAb. (B) Cromatógrafo ITLC representativo. O pico em 40-60 cm é o anticorpo radiomarcado; unbound ⁶⁴-CuCl₃ viaja com a fase móvel e estaria presente de 200 a 240 cm. Não há ⁶⁴-CuCl₃ livre detectável neste cromatógrafo. (C) As especificações de controle de qualidade do anticorpo radiomarcado. Abreviaturas: éster DOTA-NHS = éster mono-N-hidroxisuccinimida do ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetracético; ITLC/HPLC = cromatografia em camada delgada instantânea/cromatografia líquida de alta eficiência; MALDI/LC-MS = dessorção/ionização/cromatografia líquida assistida por matriz/espectrometria de massas; CPM = contagens por minuto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Fotografias demonstrando como proteger camundongos em uma cama impressa em 3D dentro do scanner PET para permitir imagens de alta qualidade da medula espinhal e do cérebro, minimizando o movimento . (A) Cama com scanner de quatro ratos impressa em 3D (também conhecida como "hotel do rato") equipada com elementos de aquecimento e tubos de anestesia. (B) Camundongos anestesiados em decúbito dorsal para maximizar a retidão da coluna vertebral; A posição da cama de cada mouse é registrada. (C) Ratos colados firmemente em toda a cabeça para minimizar o movimento no cérebro e através da barriga para minimizar o movimento da respiração, sem afetar a respiração. (D) Mouse bed posicionado dentro do scanner e colado no leito de digitalização. A tubulação de anestesia foi conectada do scanner ao leito e o isoflurano ajustado para 2%. A respiração em camundongos foi monitorada para garantir o nível adequado de isoflurano antes de fechar a porta do scanner. Abreviação: PET = Tomografia por emissão de pósitrons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagem da medula espinhal e análise do cérebro e resultados usando o software de análise PET . (A) i) ROIs (rosa e bronzeado ) desenhadas na coluna para separar as vértebras lombares e cervicais e preparar a imagem para o limiar de Otsu. ii ) As vértebras da coluna vertebral (turquesa e vermelha) foram segmentadas usando Otsu Thresholding. iii ) As vértebras foram então tornadas imutáveis no menu de ROI 3D, e a medula espinhal dividida em ROIs cervical/torácica (roxa) e lombar (marinha). iv) A ROI vertebral foi removida, restando ROIs medulares e atlas cerebral representativo aplicados. (B) Análise representativa dos resultados da PET de várias regiões do SNC representadas como %ID/g normalizadas para a ROI do coração dentro de cada animal. A aquisição do PET foi um exame estático de 10 min via PET/CT. Regiões cerebrais quantificadas usando uma abordagem semi-automatizada de atlas cerebrais, mostrada no painel A. iv) Resultados representativos mostram significância ou tendência a aumento significativo na ligação do traçador no cérebro e na medula espinhal torácica. Estatística realizada por meio do teste t de Student (*: p < 0,0332). Abreviações: PET = Tomografia por emissão de pósitrons; ROIs = regiões de interesse; SNC = sistema nervoso central; TC = tomografia computadorizada; %ID/g = percentagem de dose injetada por grama de tecido; EAE = encefalomielite autoimune experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Quantificação representativa da contagem gama ex vivo em vários órgãos em camundongos EAE e virgens expressa em %ID/g. Após o PET scan, os camundongos foram perfundidos com PBS para remover o radiotraçador presente no sangue, livre ou ligado às células B CD19⁺ residentes no sangue, e os órgãos rapidamente dissecados e pesados para ter um peso preciso de cada órgão. A ligação do traçador é significativamente diminuída no baço e na medula óssea em camundongos EAE em comparação com os virgens de estudo. Observa-se aumento da ligação do radiotraçador nos segmentos lombar e cervical/torácico da medula espinhal de camundongos EAE. O cérebro não mostra aumento significativo no sinal do radiotraçador, embora esteja tendendo a um aumento significativo. Estatística realizada pelo teste t de Student (*: p < 0,0332; ****: p < 0,0001). Abreviações: PET = Tomografia por emissão de pósitrons; %ID/g = percentagem de dose injetada por grama de tecido; EAE = encefalomielite autoimune experimental; PBS = solução salina tamponada com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Imagens ARG ex vivo mostram ⁶⁴ligações de-DOTA-hCD19-mAb em cortes cerebrais sagitais e medula espinhal inteira de EAE em comparação com camundongos virgens. Filmes digitais de armazenamento de fósforo foram escaneados usando um imageador de fósforo após serem expostos a amostras de tecido radioativo por aproximadamente 10 meias-vidas (127 h ou 5 dias). As imagens resultantes revelam sinal visualmente mais alto no cérebro de camundongos EAE em comparação com seções cerebrais de camundongos virgens, o que é esperado devido às regiões conhecidas por conter células B neste modelo⁵. Especificamente, há aumento do sinal traçador no tronco cerebral, cerebelo e ventrículos de seções cerebrais de camundongos EAE. Este aumento no sinal para seções cerebrais de camundongos EAE espelha o que foi encontrado na quantificação PET de todo o cérebro detalhada acima. Da mesma forma, há um aumento na ligação do radiotraçador nos segmentos da medula espinhal cervical/torácica e lombar em comparação com a medula espinhal virgen, refletindo o que foi encontrado usando a contagem gama ex vivo . Abreviações: PET = Tomografia por emissão de pósitrons; EAE = encefalomielite autoimune experimental; Vent = ventrículos; Cb = cerebelo; BS = tronco encefálico; TSc = medula torácica e cervical combinadas; LSc = medula lombar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: Coloração de tecidos do SNC de tecido cerebral de camundongos virgens e EAE com CD45R/B220. Células B são observadas no tronco encefálico, meninges e substância branca de camundongos EAE (n = 7 EAE, n = 5 camundongos virgens, média de quatro fatias por animal). Esse número é de ⁵. Barras de escala = 5 mm (aumento baixo [1x]) em imagens sagitais do cérebro, 100 μm (aumento alto [20x]) no tronco encefálico, meninges e substância branca cerebelar. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este artigo descreve um método simplificado para obtenção de imagens de células B CD19⁺ humanas em um modelo de EM em camundongos usando CD19-PET. Devido à apresentação heterogênea da EM e às diferentes respostas aos tratamentos, seu manejo na clínica pode ser desafiador e novas abordagens para seleção e monitoramento terapêutico são extremamente necessárias. A imagem por PET pode servir como uma ferramenta poderosa para monitorar a progressão da doença e a resposta individual à terapia de depleção de células B. Além da SM, a imagem por PET-CD19 pode ser usada para monitorar a depleção de células B após o tratamento em subtipos de linfomas e leucemia ou outras doenças mediadas por células B. Este protocolo e dados representativos mostram a utilidade da imagem de células B em doenças neurológicas.

Para estudar células B CD19⁺ humanas no contexto da EM, escolhemos o modelo MOG_1-125 EAE dependente de células B⁷. Semelhante a outros modelos de EAE, esse modelo apresenta sintomas de paralisia progressiva e infiltração de células imunes no SNC. No entanto, o modelo MOG_1-125 é único por ser um modelo conduzido por células B: camundongos contêm números variados de células B no espaço subaracnóideo nas meninges, tronco cerebral, parênquima e ventrículos. Esses linfócitos podem estar esparsamente espalhados por essas regiões e/ou formar estruturas semelhantes a folículos, o que também é observado em humanos com^EM8,9. Além de usar camundongos virgens como controles, um kit de indução completo somente com adjuvante de Freund (CFA) pode ser usado (ou seja, uma emulsão de indução idêntica à que é dada a camundongos EAE sem a proteína MOG). No modelo de camundongo EAE, a barreira hematoencefálica (BHE) é disfuncional e permite a passagem de entidades maiores, como anticorpos. O radiotraçador CD19-mAb só se ligará e permanecerá no SNC se as células B estiverem presentes; o traçador voltará a circular para o pool sanguíneo se as células B não estiverem presentes. Demonstramos isso usando contagem gama e autorradiografia ex vivo de tecidos do SNC por perfusão antes de medir os níveis de radioatividade nos tecidos. Também demonstramos isso em publicações anteriores relatando o uso de radiotraçadores PET baseados em mAb (ou seja, abordagens de imagem imunoPET) para detectar células B no SNC ^1,2.

O quelante DOTA foi utilizado por ter sido utilizado em exames clínicos de PET com peptídeos e anticorpos marcados com cobre-64, e nosso objetivo é traduzir o hCD19-mAb para exames clínicos de imagem de pacientes com EM. O DOTA tem afinidade de ligação adequada ao cobre-64 in vivo. A estabilidade in vivo é muito importante porque ⁶⁴livre vai para o fígado e pode obscurecer o sinal do radiotraçador ligado; Assim, é importante medir o sinal no fígado para calcular o sinal relativo em comparação com outros órgãos. O músculo é tipicamente tomado como um tecido de controle, mas no caso do EAE, pode haver inflamação presente nos músculos. A meia-vida de ⁶⁴é de 12,7 h, o que dá tempo suficiente para o DOTA-hCD19-mAb se ligar ao seu alvo, garantindo que o sinal possa ser medido por PET. Ao preparar o conjugado, reações de teste em pequena escala (75-125 μg) devem ser realizadas para determinar a quantidade de DOTA a ser adicionada ao mAb para produzir a relação DOTA/mAb desejada (por exemplo, uma reação de 6-10 vezes o excesso de DOTA-NHS-éster por mol mAb pode fornecer um conjugado de 1-2 DOTA/mAb). O tempo de reação e a temperatura (por exemplo, 2-4 h ou durante a noite a 4 °C ou temperatura ambiente) também influenciam a relação DOTA/mAb e devem ser otimizados. Uma titulação com cobre não radioativo pode ser realizada para calcular o número de DOTAs por mAb; no entanto, recomendamos a realização de MALDI-MS e/ou LC-MS para resultados mais confiáveis e precisos.

A razão DOTA/mAb calculada é um valor médio para uma determinada amostra e alguma variação é esperada. Para MALDI, várias tomadas são tomadas por amostra para os mAbs conjugados e não conjugados. Em seguida, calculamos a razão entre conjugado e não conjugado para determinar o número médio de DOTA/mAb. A relação DOTA/mAb é importante porque muitos quelantes interromperão a ligação de anticorpos e muito poucos levarão a marcação radiológica inconsistente e sinal baixo. A razão deve ser muito próxima entre os lotes de conjugado para manter a intensidade de sinal consistente e a cinética de ligação; Idealmente, o mesmo lote de conjugado deve ser usado para todos os experimentos dentro de um estudo particular. Uma técnica promissora para reduzir os efeitos potenciais sobre a imunorreatividade devido à possível superconjugação é utilizar a conjugação sítio-específica¹⁰ , em que a conjugação do quelante é sítio-seletiva sobre os glicanos de cadeia pesada do anticorpo, garantindo, assim, a adição de 1 quelante por mAb.

As condições da reação de radiomarcação devem ser otimizadas para garantir a mais alta eficiência de marcação e rendimento, uma vez que diferenças no anticorpo, razão DOTA/mAb e atividade molar de ⁶⁴, entre outras condições, afetarão a marcação radioativa. O uso da razão conjugada ideal de ⁶⁴para mAb pode permitir que o radiotraçador seja usado sem purificação, reduzindo o tempo necessário para a marcação radiológica e a perda devido à coluna de fluxo de gravidade e ao decaimento radioativo. Uma atividade molar consistente e confiável também pode ser alcançada quando a mesma razão conjugada de ⁶⁴para mAb é usada, o que é especialmente importante ao comparar resultados em várias coortes de camundongos ou estudos de imagem. As condições da ITLC também podem ser modificadas para se adequar a cada usuário. Se a purificação for necessária, uma alíquota deve ser guardada para HPLC e/ou espectrofotometria UV/Vis para que a atividade molar possa ser calculada.

É importante ressaltar que o uso de anticorpos radiomarcados para exames de imagem pode ser um desafio. É essencial que o anticorpo utilizado para o radiotraçador seja biologicamente inerte para não ter efeito fisiológico. Além disso, como os anticorpos têm uma longa residência sanguínea, deve-se esperar tempo suficiente para a circulação, ligação e depuração de um determinado mAb para garantir um sinal-para-fundo adequado sem comprometer a qualidade da imagem. Normalmente, esperar por 20-48 h por um mAb marcado com 64 é suficiente, mas deve-se obter imagens em 2, 4, 6, 12, ²⁴, 48 h após a injeção ao avaliar um novo traçador PET mAb para determinar o melhor ponto de tempo para a obtenção de imagens em um determinado modelo de roedor. O mesmo vale para a aquisição de imagens ARG com a maior relação sinal-fundo. As imagens representativas deste protocolo foram obtidas 18-20 h após a injeção, embora outros momentos possam ser usados dependendo do radioisótopo utilizado. Diferentes anticorpos que se ligam a diferentes epítopos de CD19 produzirão resultados variados e devem ser rigorosamente caracterizados.

Ao analisar o sinal da medula espinhal, é importante posicionar os ratos de costas na cama de varredura para reduzir o movimento causado pela respiração. Além disso, a colocação supina pode ajudar a endireitar a coluna vertebral em camundongos que têm curvatura espinhal aumentada devido à progressão da doença EAE. Outro aspecto importante a ser considerado quando se pretende detectar sinal na coluna vertebral e na medula espinhal é evitar a injeção de MOG_1-125 no flanco, pois os locais de injeção podem ligar o traçador devido à resposta imune associada nessas áreas. A proximidade do local da injeção pode interferir na análise da medula espinhal; Assim, as injeções no tórax são preferíveis para a aplicação aqui descrita.

As técnicas de análise de imagem utilizadas são específicas para exames de imagem do SNC. Uma ferramenta de atlas cerebral dentro do software de análise de imagens fornece resultados reprodutíveis e confiáveis, desde que o registro de PET e TC seja preciso. Usar o atlas cerebral 3D semi-automatizado e ajustá-lo para se ajustar ao crânio de cada rato permite ROIs consistentes entre os animais. Como atualmente não existe uma abordagem automatizada ou semi-automatizada para analisar o sinal na medula espinhal, as ROIs manuais devem ser desenhadas. Notavelmente, ao quantificar as células B CD19⁺ (ou qualquer tipo de célula presente na medula óssea e na medula espinhal), é fundamental eliminar ao máximo o sinal proveniente da coluna vertebral e da medula óssea. A razão para isso é que camundongos virgens são conhecidos por conter mais células B CD19⁺ em sua medula óssea do que camundongos EAE, nos quais as células B saem da periferia para se infiltrar no SNC ^5,11. Este sinal da medula óssea pode obscurecer o verdadeiro sinal na medula espinhal.

Para delinear o verdadeiro sinal da medula espinhal e, ao mesmo tempo, minimizar a contribuição do sinal da coluna vertebral e da medula óssea, o limiar de Otsu da imagem de TC pode ser usado para fazer uma ROI imutável para a coluna vertebral. Uma ROI da medula espinhal separada pode então ser facilmente desenhada dentro da coluna vertebral. A mesma técnica também pode ser aplicada para medir a medula óssea no fêmur. Este é um método muito útil para obter informações sobre a ligação do traçador na medula espinhal. No entanto, devido à resolução espacial relativamente baixa da PET e a questões relacionadas ao efeito de volume parcial ao escanear pequenas regiões anatômicas de camundongos, o uso de técnicas confirmatórias ex vivo adicionais (por exemplo, contagem gama, ARG) permite a validação da ligação do radiotraçador na medula espinhal sem a presença de sangue, líquido cefalorraquidiano ou sinal de transbordamento da coluna vertebral.

O sinal na medula espinhal cervical/torácica tende a variar nos camundongos EAE, dependendo da gravidade da doença e de quantas células B infiltram durante a resposta imune adaptativa. Essa variação no número de células B que se infiltram, bem como a pequena quantidade de células B no SNC em comparação com aquelas na medula óssea pélvica/espinhal de camundongos virgens, pode tornar a quantificação in vivo do tecido da medula espinhal desafiadora em camundongos. Dada a resolução espacial do PET em imagens de pequenos animais, o sinal da medula óssea pode transbordar para o sinal da medula espinhal. A biodistribuição ex vivo e a autorradiografia completadas aqui ajudam a validar o sinal PET das vértebras versus tecido da medula espinhal. Os camundongos são perfundidos antes da dissecção para remover qualquer traçador não ligado no pool de sangue para que os resultados da contagem gama e da autorradiografia reflitam o traçador que está realmente ligado em cada órgão, em vez do traçador que está no pool de sangue nesse órgão.

Radiotraçadores circulam através do sangue, e com traçadores de anticorpos, especificamente, muitas vezes há radiotraçador não ligado presente no sangue por semanas após a injeção inicial. Uma vez que estamos fazendo imagens do cérebro e da medula espinhal, que têm muitos vasos sanguíneos, é importante entender qual parte do sinal é realmente devido à ligação do traçador no cérebro/tecido de interesse versus o presente no pool sanguíneo. Assim, é necessário dividir o sinal cerebral por sinal no pool coração/sangue. No cenário clínico, as mesmas técnicas de análise de imagem do limiar de Otsu das vértebras e ROIs dos tecidos da medula espinhal podem ser usadas para quantificação. Dado o maior volume de tecido em humanos em comparação com camundongos, deve haver significativamente menos impacto dos efeitos parciais de volume, levando a uma melhor precisão e negando a necessidade de técnicas ex vivo para confirmar os achados in vivo . O uso de PET na clínica permitirá que os médicos personalizem a terapia para cada paciente, dependendo de sua carga individual de células B.

O ARG é particularmente útil para a aquisição de imagens de alta resolução para permitir um delineamento mais preciso da localização espacial da ligação do traçador em pequenas regiões, como tronco cerebral e cerebelo. Os mesmos cortes e/ou cortes adjacentes podem ser guardados para coloração imunoistoquímica para confirmar a presença de células B. Previamente coramos tecidos do SNC com CD45R/B220 (Figura Suplementar S1) para correlacionar o número de células B com o sinal PET e^ARG5,9. A coloração pode então ser comparada espacialmente com os resultados da ARG para verificar se o sinal do radiotraçador corresponde ao padrão de coloração. As células B podem estar presentes em grupos ou difusamente por todo o tronco cerebral; A sensibilidade do PET é suficientemente alta para medir o sinal, o que é encorajador para a tradução clínica. Para ARG da medula espinhal, a remoção da medula espinhal das vértebras garante que o sinal medido seja devido à ligação do traçador no tecido da medula espinhal em vez da medula óssea e/ou sangue, o que pode obscurecer as imagens de PET devido a efeitos parciais de volume.

Semelhante à ARG, a contagem gama ex vivo permite a quantificação do sinal radioativo em órgãos individuais. Para esta técnica em particular, é importante medir o peso úmido dos tecidos e garantir que eles estejam no fundo de seus respectivos tubos antes de colocá-los no contador gama. Os tubos devem ser marcados com o número do rato e tecido, de modo a que o tubo correto seja utilizado; O tubo é então pesado em uma balança calibrada e os órgãos são inseridos até o décimo mais próximo de um micrograma (0,0001 mg). Alguns tecidos são extremamente pequenos e a diferença na massa do tubo antes e depois será da ordem de 0,0001 mg. Os tecidos devem ser pesados imediatamente após a dissecção para evitar perda de umidade, o que resulta em uma massa menor. Após a pesagem, os tubos do cérebro e da medula espinhal devem ser preenchidos com PBS para evitar a secagem antes de congelar esses tecidos para ARG.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,5 mL 50 kDa MWCO Filtro centrífugo	MiliporeSigma	UFC505008	filtro centrífugo
64-CuCl3	Universidade de Washington em St. Louis; Universidade de Wisonsin, Madison; ou outro fornecedor
AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner	Eckert & de Autorradiografia Ziegler	AR-2000
	Cole Palmer	EW-21700-34	Alumínio, 8" x 10"
Filme de Autorradiografia	GE Life Sciences	28-9564-78	Tela de Armazenamento de Fósforo BAS-IP SR 2025 E Super Resolução, 20 x 25 cm, somente tela
Cateter de Agulha	Borboleta SAI Infusion Technologies	BLF-24
DOTA-NHS-ester	Macrocíclicos	B-280
EAE Kit	de Indução Hooke Laboratories	EK-2160
Geiger Counter	Ludlum	14C
Scanner PET/CT GNEXT	Sofie	GNEXT
Contador Automático de Gama Hidex		AMG
HPLC Coluna	Phenomenex	00H-2146-K0	5 μ m SEC-s3000 400 Å, coluna Illustra NAP-5 de 300 x 7,8 mm
	Coluna de gravidade de DNA Cytiva	17085301
Imagem	de análise NIH
Tubos de coleta de ligação de proteínas baixas (1,5 mL)	Espectrofotômetro Thermo Scientific	PI90410
NanoDrop Lite	/nano-espectrofotômetro UV-Vis	Thermo Scientific	840281400
Tubos de PCR de 0,2 mL, para	Eppendorf	30124707
9410	GE Healthcare	8149-30-9410
VivoQuant	Invicro	Versão 4 Patch 3	Software de Análise PET; deve adquirir o complemento do atlas cerebral
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0,5 mL	Thermo Scientific	PI89882	Coluna de dessalinização