Artigo de método

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

DOI:

10.3791/64135

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23 de setembro de 2022

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1College of Life Science, Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, 3Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo descreve a centrifugação diferencial para isolar e caracterizar EVs representativos (exossomos e microvesículas) de CTMs humanas cultivadas. Outras aplicações desses EVs também são explicadas neste artigo.

Resumo

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As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas heterogêneas de membrana liberadas pela maioria dos tipos celulares, sendo cada vez mais reconhecidas como reguladoras fisiológicas da homeostase organismal e importantes indicadoras de patologias; Enquanto isso, seu imenso potencial para estabelecer terapêuticas de doenças acessíveis e controláveis está surgindo. As células-tronco mesenquimais (CTMs) podem liberar grandes quantidades de EVs em cultura, o que tem se mostrado promissor para impulsionar a regeneração tecidual eficaz e facilitar aplicações terapêuticas extensivas com boa escalabilidade e reprodutibilidade. Há uma demanda crescente por protocolos simples e eficazes para coleta e aplicação de MSC-EVs. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido com base na centrifugação diferencial para isolar e caracterizar EVs representativos de CTMs, exossomos e microvesículas humanas cultivadas para aplicações futuras. A adaptabilidade desse método é mostrada para uma série de abordagens a jusante, como rotulagem, transplante local e injeção sistêmica. A implementação desse procedimento abordará a necessidade de coleta e aplicação simples e confiável de MSC-EVs em pesquisa translacional.

Introdução

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As células-tronco são células pluripotentes indiferenciadas com capacidade de autorrenovação e potencial translacional1. As células-tronco mesenquimais (CTMs) são facilmente isoladas, cultivadas, expandidas e purificadas em laboratório, o que permanece característico das células-tronco após múltiplas passagens. Nos últimos anos, evidências crescentes têm apoiado a visão de que as CTMs atuam de forma parácrina no uso terapêutico 2,3. Especialmente a secreção de vesículas extracelulares (EVs) desempenha um papel crucial na mediação das funções biológicas das CTMs. Como nanopartículas memb....

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Protocolo

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Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Quarta Universidade Médica Militar e realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Camundongos C57Bl/6 com oito semanas de idade (sem preferência por fêmeas ou machos) foram utilizados. As CTMs criopreservadas derivadas do cordão umbilical humano (CTMSCs), utilizadas no presente estudo, foram obtidas de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). O uso de células humanas foi aprovado pelo Comitê de Ética da Quarta Universidade Militar de Medicina.

1. Cultura de célul....

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Resultados

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MVs e Exos de UCMSCs humanas cultivadas são isolados seguindo o fluxo de trabalho experimental (Figura 1). Os resultados da NTA demonstram que o tamanho dos Exos de CTMs humanas varia de 40 nm a 335 nm com um tamanho de pico de cerca de 100 nm, e o tamanho de MVs varia de 50 nm a 445 nm com um tamanho de pico de 150 nm (Figura 2). A caracterização morfológica dos Exos derivados das CTM exibe uma forma típica de taça (Figura 3). Os E.......

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Discussão

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Os EVs estão emergindo para desempenhar um papel importante em diversas atividades biológicas, incluindo apresentação de antígenos, transporte de material genético, modificação do microambiente celular, entre outros. Além disso, sua ampla aplicação traz novas abordagens e oportunidades para o diagnóstico e tratamento de doenças21. A implementação de aplicações terapêuticas de EVs baseia-se no sucesso do isolamento e caracterização. No entanto, devido à falta de métodos padronizados de isolamento e.......

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32000974, 81930025 e 82170988) e da Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2019M663986 e BX20190380). Somos gratos pela assistência do National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) e do Laboratório Central de Análises e Testes do Centro de Inovação Médica Militar da Universidade Médica da Força Aérea.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10% de iodopovidona (Betadine)Weizhenyuan10053956954292desinfecção de feridas
Particle Metrix110-0020Calibre o instrumento NTA
CarprofenoSigma53716-49-7Medicina analgésica
Gerador de imagens de veias caudais KEW Life ScienceKW-XXYCentrífuga de veia caudal
Eppendorf5418RCentrifugação
Soro bovino fatalCorning35-081-CVCultura de UCMSCs
Formvar/malha quadrada revestida de carbonoPBL Assay Science 24916-25Microscópio eletrônico de transmissão
Almofada de aquecimentoZhongke Life ScienceZ8G5JBMzCuidados pós-tratamento de animais
Solução de heparinaStemCell7980Injeção sistêmica
IsofluranoRWD Life ScienceR510-22Anestesia
animal Mínimo Essencial Médio Alfa básico (1x)GibcoC12571500BTCultura de UCMSCs
Analisador de rastreamento de nanopartículasParticle MetrixZetaView PMX120Análise de rastreamento de nanopartículas
PBS (1x)MeilunbioMA0015Ressuspender EVs
Penicilina / EstreptomicinaProcell Life SciencePB180120Cultura de UCMSCs
Ácido fosfotúngsticoSolarbio12501-23-4Microscópio
PipetaEppendorf3120000224
PKH26 Kit de Ligação de Células Fluorescentes VermelhasSigma-AldrichMINI26Rotulagem EVs
Punção de biópsia de peleAcuderm69038-10-50Defeitos de pele
Software ZetaViewParticle MetrixVersão 8.05.14 SP7 
Equipamento termostáticoGrantv-0001-0005Banho-maria
Microscópio eletrônico de transmissãoHITACHIHT7800Microscópio eletrônico de transmissão
UCMSCsBai'ao UKK220201Comercialmente UCMSCs
UltracentrífugaBeckmanXPN-100Centrifugação
Sistema de purificação de água filtrada ultrapuraMilli-QIQ 7000Preparação de água ultrapura
Solução de calibração de eletrônico de transmissão

Referências

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  1. Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619(2020).
  2. Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S.

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Etiquetas

Mesenchymal Stem CellsExtracellular VesiclesDifferential CentrifugationMicrovesicle IsolationExosome CharacterizationNanoparticle TrackingFluorescence MicroscopyPKH26 LabelingSystemic InjectionTissue Regeneration

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