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Artigo de método

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

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DOI:

10.3791/64135

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23 de setembro de 2022

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1College of Life Science, Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, 3Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve a centrifugação diferencial para isolar e caracterizar EVs representativos (exossomos e microvesículas) de CTMs humanas cultivadas. Outras aplicações desses EVs também são explicadas neste artigo.

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas heterogêneas de membrana liberadas pela maioria dos tipos celulares, sendo cada vez mais reconhecidas como reguladoras fisiológicas da homeostase organismal e importantes indicadoras de patologias; Enquanto isso, seu imenso potencial para estabelecer terapêuticas de doenças acessíveis e controláveis está surgindo. As células-tronco mesenquimais (CTMs) podem liberar grandes quantidades de EVs em cultura, o que tem se mostrado promissor para impulsionar a regeneração tecidual eficaz e facilitar aplicações terapêuticas extensivas com boa escalabilidade e reprodutibilidade. Há uma demanda crescente por protocolos simples e eficazes para coleta e aplicação de MSC-EVs. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido com base na centrifugação diferencial para isolar e caracterizar EVs representativos de CTMs, exossomos e microvesículas humanas cultivadas para aplicações futuras. A adaptabilidade desse método é mostrada para uma série de abordagens a jusante, como rotulagem, transplante local e injeção sistêmica. A implementação desse procedimento abordará a necessidade de coleta e aplicação simples e confiável de MSC-EVs em pesquisa translacional.

Introdução

As células-tronco são células pluripotentes indiferenciadas com capacidade de autorrenovação e potencial translacional1. As células-tronco mesenquimais (CTMs) são facilmente isoladas, cultivadas, expandidas e purificadas em laboratório, o que permanece característico das células-tronco após múltiplas passagens. Nos últimos anos, evidências crescentes têm apoiado a visão de que as CTMs atuam de forma parácrina no uso terapêutico 2,3. Especialmente a secreção de vesículas extracelulares (EVs) desempenha um papel crucial na mediação das funções biológicas das CTMs. Como nanopartículas membranosas heterogêneas liberadas da maioria dos tipos celulares, os EVs consistem em subcategorias denominadas exossomos (Exos), microvesículas (MVs) e corpos apoptóticos ainda maiores 4,5. Dentre eles, o Exos é o EV mais estudado, com tamanho de 40-150 nm, de origem endossômica e secretado ativamente em condições fisiológicas. Os MVs são formados por excreção direta da superfície da membrana plasmática celular com diâmetro de 100-1.000 nm, que se caracterizam pela alta expressão de fosfatidilserina e expressão de marcadores de superfície das células doadoras6. Os EVs contêm RNA, proteínas e outras moléculas bioativas, que têm funções semelhantes às células-mãe e desempenham um papel significativo na comunicação celular, resposta imune e reparo de danos teciduais7. As CTM-EVs têm sido amplamente investigadas como uma poderosa ferramenta terapêutica livre de células na medicina regenerativa8.

O isolamento e purificação de EVs derivados de MSC é um problema comum no campo da pesquisa e aplicação. Atualmente, a ultracentrifugação diferencial e gradiente de densidade9, o processo de ultrafiltração 10, a separação imunomagnética11, o cromatógrafo de exclusão molecular 12 e o chip microfluídico13 são métodos amplamente empregados no isolamento e purificação de EVs. Com as vantagens e desvantagens de cada abordagem, a quantidade, a pureza e a atividade dos EVs coletados não podem ser satisfeitas ao mesmo tempo14,15. No presente estudo, o protocolo de centrifugação diferencial de isolamento e caracterização de EVs de CTMs cultivadas é mostrado em detalhes, o que tem apoiado o uso terapêutico eficiente 16,17,18,19,20. A adaptabilidade desse método para uma série de abordagens a jusante, como marcação fluorescente, transplante local e injeção sistêmica, tem sido ainda mais exemplificada. A implementação desse procedimento abordará a necessidade de coleta e aplicação simples e confiável de MSC-EVs em pesquisa translacional.

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Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Quarta Universidade Médica Militar e realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Camundongos C57Bl/6 com oito semanas de idade (sem preferência por fêmeas ou machos) foram utilizados. As CTMs criopreservadas derivadas do cordão umbilical humano (CTMSCs), utilizadas no presente estudo, foram obtidas de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). O uso de células humanas foi aprovado pelo Comitê de Ética da Quarta Universidade Militar de Medicina.

1. Cultura de células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs)

  1. Preparar os acessórios e soluções necessários para o trabalho experimental, incluindo pipetas, ponteiras de pipetas, placa de Petri de 10 cm, equipamento termostático (banho-maria), luvas de borracha, álcool a 75%, meio de cultura (incubado a 37 °C), soro bovino fatal (FBS) e solução de penicilina-estreptomicina (P/S) a 100x (ver Tabela de Materiais).
  2. Preparar o meio essencial mínimo alfa disponível comercialmente (α-MEM) suplementando com 20% FBS e 1% P/S.
    NOTA: Diluir todas as soluções utilizadas para isolamento e análise de EVs em água filtrada ultrapura feita pelo sistema de purificação de água filtrada ultrapura (ver Tabela de Materiais).
  3. Recuperar as CTMs criopreservadas derivadas do cordão umbilical humano (CTMSUs) do nitrogênio líquido, derretendo-as em banho-maria a 37 °C.
  4. Transferir rápida e suavemente a suspensão de células fundidas para um tubo de 15 ml com 5 ml de meio de cultura (passo 1.2). Centrifugar a 4 °C, 500 x g durante 5 min.
  5. Retire o sobrenadante com uma pipeta estéril e retenha o precipitado celular. Adicionar 2 mL de meio de cultura no tubo da centrífuga e ressuspender suavemente as células.
  6. Semeando as células em uma placa de Petri de 10 cm e adicionar 8 mL de meio de cultura, totalizando 10 mL.
  7. Cultivar CTMs a 37 °C em 5% de CO2 na incubadora celular.

2. Centrifugação diferencial para isolamento de Exos e MVs

  1. Quando as CTMs crescerem até >90% de confluência, substitua o meio de cultura por α-MEM suplementado com 20% de SFB depletado de EV e 1% de P/S para 8 mL de cada prato.
    NOTA: Centrífuga FBS a 4 °C, 1,50,000 x g durante a noite para remover EVs e outras impurezas.
  2. Após 48 h de cultura, coletar o meio de cultura (etapa 2.1) em tubos centrífugos de 50 mL.
  3. Centrifugar o meio de cultura MSC a 4 °C, 800 x g por 10 min.
  4. Remova os fragmentos celulares e restos celulares transferindo o sobrenadante para limpar tubos cônicos de 1,5 mL.
    NOTA: O uso de tubos cônicos de 1,5 mL é necessário para aumentar o rendimento do VE.
  5. Centrifugar o sobrenadante a 4 °C, 16.000 x g por 30 min. O pellet é MVs. MVs de cada placa de células foram ressuspendidos com 50 μL de PBS.
  6. Transferir o sobrenadante obtido por centrifugação na etapa 2.5 por pipeta para limpar os tubos de ultracentrífuga. Centrifugar a 1,50.000 x g por 2 h a 4 °C.
  7. Descarte o sobrenadante e colete o resíduo, que é Exos. Ressuspender Exos de sete placas de células em 50 μL de PBS.
    NOTA: Os UCMSCs de sexta passagem são usados para isolamento de EV. Para obter MVs e Exos suficientes para uso experimental, 7-8 placas de células cultivadas são geralmente necessárias. As amostras de EV são utilizadas imediatamente para as etapas seguintes de caracterização ou para aplicação terapêutica, que é melhor não armazenar.
    CUIDADO: Evite o congelamento e o descongelamento repetidos de EVs, e é melhor armazenar EVs a 4 °C a curto prazo e não a -80 °C.

3. Detecção do número de partículas e distribuição de tamanho de EVs de CTMs

NOTA: Para a avaliação da distribuição de tamanho, a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) é realizada por um analisador de rastreamento de nanopartículas disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).

  1. Diluir 1 μL de EVs (da etapa 2.5 e da etapa 2.7) em 1.499 μL de PBS e misturar o suficiente em um tubo de 15 mL.
  2. Opere o analisador de rastreamento seguindo as instruções do fabricante. Em primeiro lugar, inicie o software compatível (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Encha a célula de amostra com água destilada e, em seguida, permita que o instrumento inicie a verificação da célula.
  4. Calibrar o instrumento com uma solução padrão preparada. Certifique-se de que o número de partículas exibido na interface de detecção de software esteja entre 50-400 (de preferência em torno de 200). Clique em OK.
    NOTA: Preparar a solução-padrão reconstituindo 1 μL de solução de calibração (ver Tabela de Materiais) em 1 ml de água destilada para gerar uma solução primária e, em seguida, tomar 100 μL da solução primária e adicionar 25 ml de água destilada para preparar uma solução-padrão (1:250.000). Conservar este reagente de trabalho a 4 °C durante uma semana.
  5. Enxaguar a célula da amostra com 5 mL de água destilada.
  6. Antes da análise da amostra, lave o canal com 1 mL de água destilada. Verifique se o número de partículas exibido na interface de detecção de software é menor que 10.
  7. Injectar 1 ml da amostra de VE preparada no passo 3.1. Realizar o teste da vesícula de acordo com as instruções de operação do instrumento.
    CUIDADO: A amostra e a água destilada são injetadas com uma seringa de 1 mL a uma velocidade constante de 0,5 mL/s sob controle manual cuidadoso.

4. Caracterização da morfologia do EV por microscópio eletrônico de transmissão (MET)

  1. Diluir 1 μL de EVs da etapa 2,7 em 199 μL de PBS e misturar o suficiente. Adicione 20 μL de gotas de suspensão EV à malha quadrada revestida de formvar/carbono (ver Tabela de Materiais) e deixe permanecer por 3 min.
  2. Retire o excesso de líquido por um pequeno papel de filtro e deixe por 15 s para secar levemente a superfície.
  3. Corar negativamente amostras de EV com gotículas de ácido fosfotúngstico a 1,5% por 40 s.
  4. Retire o excesso de ácido fosfotúngstico e deixe repousar por 15 s para secar levemente a superfície.
  5. Coloque a amostra contendo malha quadrada revestida de formvar/carbono num prato limpo coberto com papéis de filtro. Observe e capture imagens com um microscópio eletrônico de transmissão.
    Observação : nesse processo, Exos são tomados como um exemplo.

5. Rotulagem de EVs derivados de CTMs

  1. Após a extração dos EVs (etapa 2.5), ressuspender com 250 μL de PBS em um tubo cônico de 1,5 mL.
  2. Utilizar outro tubo cônico de 1,5 mL para preparar a solução de trabalho do corante PKH26; usar 1 μL de reagente de marcação PKH26 diluído com 250 μL de Diluente C (um componente do kit de marcação EV comercialmente disponível usado para o presente estudo, ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Prepare a solução de trabalho imediatamente antes de usar.
    CUIDADO: O corante PKH26 excessivo ou a rotulagem sem pré-diluição correm o risco de danificar os EVs.
  3. Misture os EVs ressuspensos com a solução de trabalho. Deixe repousar à temperatura ambiente durante 5 minutos e, em seguida, adicione 500 μL de FBS empobrecido em EV para parar a reação.
  4. Para MVs, centrifugar a 4 °C, 16.000 x g por 30 min e descartar o sobrenadante por uma pipeta. Adicionar 1 mL de PBS para enxaguar o resíduo.
  5. Centrifugar a 4 °C, 16.000 x g por 30 min e descartar o sobrenadante para remover o corante não ligado.
  6. Ressuspender o resíduo com 200 μL de PBS. Soltar 20 μL de suspensão sobre a lâmina e observá-la sob microscópio de fluorescência.
    Observação : nesse processo, MVs são tomadas como um exemplo.

6. Transplante local e injeção sistêmica de CTM-EVs

NOTA: Para os procedimentos a seguir, coloque os EVs no gelo antes da injeção.

  1. Realize o transplante local seguindo os passos abaixo.
    1. Anestesiar os camundongos com isoflurano a 4% (vol/vol). Manter a anestesia a 1%-3% de isoflurano durante o procedimento.
    2. Antes da cirurgia, administrar 5 mg/kg de carprofeno (IP) para analgesia para minimizar a dor pós-procedimento.
    3. Antes da excisão da ferida, raspar os pelos dorsais e esterilizar a superfície dorsal aplicando 3 rodadas alternadas de iodopovidona a 10% e etanol a 75%.
    4. Usando um punch de biópsia (ver Tabela de Materiais), crie uma ferida de espessura total de 1 cm de diâmetro na pele dorsal.
    5. Ressuspender os EVs derivados das CTM de duas placas em 100 μL de PBS e administrar a injeção na camada subcutânea do leito da ferida, ao redor de cada ferida com quatro locais.
      NOTA: Uma média de 100 μg de EVs por camundongo (EVs de duas placas de células de 10 cm) é injetada. Dez placas de 10 cm de CTMs são necessárias para produzir EVs suficientes para montar um experimento de n = 5 em um modelo murino.
    6. Após o tratamento, envolva os ratos com gaze estéril e coloque-os em almofadas de isolamento térmico (ver Tabela de Materiais) até acordarem.
    7. Certifique-se de que os ratos não sejam deixados desassistidos até que tenham recuperado a consciência suficiente. Não devolva os ratos à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.
    8. Administrar doses adicionais de analgesia no dia 2 e no dia 3 pós-operatório, conforme necessário.
  2. Realizar injeção sistêmica.
    1. Ressuspenda os EVs derivados de CTM em 200 μL de PBS e, em seguida, misture com solução de heparina em uma relação de volume de 10:1.
    2. Coloque os ratos no sistema de imagem da veia caudal (ver Tabela de Materiais). Pressione o interruptor para levantar a alavanca.
    3. Desinfete a veia da cauda usando uma almofada de álcool antes da injeção intravenosa. Em seguida, injetar sistematicamente os camundongos com suspensão preparada na etapa 6.2.1 através da veia caudal. O procedimento é auxiliado por um ilustrador de veias de cauda.
      NOTA: Injetar a suspensão EV imediatamente após a mistura com heparina. Uma média de 100 μg EVs por camundongo (EVs de duas placas de células de 10 cm) é injetada. Dez placas de 10 cm de CTMs são necessárias para produzir EVs suficientes para montar um experimento de n = 5 em um modelo murino.
      CUIDADO: A injeção da veia da cauda do rato é geralmente limitada a 200 μl de volume. A injeção deve ir devagar e parar se você ver um inchaço ou resistência, o que sugere que a agulha está fora da veia. Se os camundongos mostrarem sinais clínicos adversos como enrolar e tremer, isso pode ser uma resposta de choque à injeção de alto volume, injeção rápida ou toxicidade/anafilaxia.

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Resultados

MVs e Exos de UCMSCs humanas cultivadas são isolados seguindo o fluxo de trabalho experimental (Figura 1). Os resultados da NTA demonstram que o tamanho dos Exos de CTMs humanas varia de 40 nm a 335 nm com um tamanho de pico de cerca de 100 nm, e o tamanho de MVs varia de 50 nm a 445 nm com um tamanho de pico de 150 nm (Figura 2). A caracterização morfológica dos Exos derivados das CTM exibe uma forma típica de taça (Figura 3). Os E...

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Discussão

Os EVs estão emergindo para desempenhar um papel importante em diversas atividades biológicas, incluindo apresentação de antígenos, transporte de material genético, modificação do microambiente celular, entre outros. Além disso, sua ampla aplicação traz novas abordagens e oportunidades para o diagnóstico e tratamento de doenças21. A implementação de aplicações terapêuticas de EVs baseia-se no sucesso do isolamento e caracterização. No entanto, devido à falta de métodos padronizados de isolamento e...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32000974, 81930025 e 82170988) e da Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2019M663986 e BX20190380). Somos gratos pela assistência do National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) e do Laboratório Central de Análises e Testes do Centro de Inovação Médica Militar da Universidade Médica da Força Aérea.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10% de iodopovidona (Betadine)Weizhenyuan10053956954292desinfecção de feridas
Particle Metrix110-0020Calibre o instrumento NTA
CarprofenoSigma53716-49-7Medicina analgésica
Gerador de imagens de veias caudais KEW Life ScienceKW-XXYCentrífuga de veia caudal
Eppendorf5418RCentrifugação
Soro bovino fatalCorning35-081-CVCultura de UCMSCs
Formvar/malha quadrada revestida de carbonoPBL Assay Science 24916-25Microscópio eletrônico de transmissão
Almofada de aquecimentoZhongke Life ScienceZ8G5JBMzCuidados pós-tratamento de animais
Solução de heparinaStemCell7980Injeção sistêmica
IsofluranoRWD Life ScienceR510-22Anestesia
animal Mínimo Essencial Médio Alfa básico (1x)GibcoC12571500BTCultura de UCMSCs
Analisador de rastreamento de nanopartículasParticle MetrixZetaView PMX120Análise de rastreamento de nanopartículas
PBS (1x)MeilunbioMA0015Ressuspender EVs
Penicilina / EstreptomicinaProcell Life SciencePB180120Cultura de UCMSCs
Ácido fosfotúngsticoSolarbio12501-23-4Microscópio
PipetaEppendorf3120000224
PKH26 Kit de Ligação de Células Fluorescentes VermelhasSigma-AldrichMINI26Rotulagem EVs
Punção de biópsia de peleAcuderm69038-10-50Defeitos de pele
Software ZetaViewParticle MetrixVersão 8.05.14 SP7 
Equipamento termostáticoGrantv-0001-0005Banho-maria
Microscópio eletrônico de transmissãoHITACHIHT7800Microscópio eletrônico de transmissão
UCMSCsBai'ao UKK220201Comercialmente UCMSCs
UltracentrífugaBeckmanXPN-100Centrifugação
Sistema de purificação de água filtrada ultrapuraMilli-QIQ 7000Preparação de água ultrapura
Solução de calibração de eletrônico de transmissão

Referências

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Reimpressões e permissões

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Centrifugação DiferencialIsolamento de MicrovesículasCaracterização de ExossomosRastreamento de NanopartículasMicroscopia de FluorescênciaMarcação com PKH26Injeção SistêmicaRegeneração Tecidual
Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas
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