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Bioengineering

Preparação e avaliação estrutural de monocamadas de células epiteliais em um dispositivo de cultura microfluídica de tamanho fisiológico

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64148
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

Summary

O protocolo apresentado descreve o desenvolvimento e o uso de uma técnica de coloração de actina filamentosa à base de faloidina com microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) para visualizar a estrutura da camada celular aderente em canais de cultura dinâmica microfluídica e câmaras tradicionais de cultura estática de poço fixo. Essa abordagem auxilia na avaliação da confluência da camada celular, da formação da monocamada e da uniformidade da espessura da camada.

Abstract

A experimentação microfluídica in vitro tem grande potencial para revelar muitos conhecimentos sobre os fenômenos microfisiológicos que ocorrem em condições como a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) e a lesão pulmonar induzida por ventilação mecânica (LIVB). No entanto, estudos em canais microfluídicos com dimensões fisiologicamente relevantes para os bronquíolos terminais do pulmão humano enfrentam atualmente vários desafios, especialmente devido às dificuldades em estabelecer condições adequadas de cultura celular, incluindo taxas de fluxo de meios, dentro de um determinado ambiente de cultura. O protocolo apresentado descreve uma abordagem baseada em imagens para avaliar a estrutura de células epiteliais pulmonares humanas NCI-H441 cultivadas em um canal microfluídico impermeável ao oxigênio com dimensões fisiologicamente relevantes para os bronquíolos terminais do pulmão humano. Usando a coloração de actina filamentosa à base de faloidina, as estruturas citoesqueléticas das células são reveladas por microscopia confocal de varredura a laser, permitindo a visualização de células individuais e em camadas. A quantificação subsequente determina se as condições de cultura celular que estão sendo empregadas estão produzindo monocamadas uniformes adequadas para experimentação posterior. O protocolo descreve métodos de cultura de células e avaliação de camadas em canais microfluídicos e ambientes tradicionais de poço fixo. Isso inclui construção de canais, cultura de células e condições necessárias, fixação, permeabilização e coloração, imagens microscópicas confocais, processamento de imagens e análise de dados.

Introduction

A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é uma condição aguda decorrente de insulto e propagação de lesão no parênquima pulmonar, resultando em edema pulmonar dos alvéolos, trocas gasosas inadequadas e subsequente hipoxemia1. Isso inicia um ciclo de liberação de citocinas pró-inflamatórias, recrutamento de neutrófilos, liberação de mediadores tóxicos e dano tecidual, o que por si só incorre em uma resposta inflamatória adicional2. Além disso, o surfactante pulmonar, que estabiliza as vias aéreas e previne danos causados por recrutamento/desrecrutamento (R/D) repetitivos, pode ser inativado ou tornado disfuncional pelos processos químicos que ocorrem durante a SDRA, resultando em maior estresse e lesão do parênquima circundante3. Se houver danos suficientes, a ventilação mecânica pode ser necessária para garantir oxigenação sistêmica adequada4. No entanto, a ventilação mecânica impõe seus próprios desafios e traumas, incluindo a possibilidade de lesão pulmonar induzida pela ventilação mecânica (LPIV), caracterizada como lesão do parênquima pulmonar causada pelos esforços mecânicos impostos durante a superinsuflação (volutrauma) e/ou pela D/D da interface ar-líquido na via aérea ocluída por líquido (atelectrauma)5. O gradiente de pressão experimentado por células epiteliais expostas a uma interface ar-líquido (como em um bronquíolo ocluído por fluido) no modelo atelectrauma pode resultar em uma resposta obstrutiva originada pela permeabilidade (POOR), levando a um ciclo virtuoso de lesão POOR-get-POORer 6,7,8.

A experimentação in vitro pode fornecer informações em microescala sobre esses fenômenos, mas os estudos atuais em ambientes de canais microfluídicos com dimensões fisiologicamente relevantes enfrentam váriosdesafios9. Por um lado, a otimização das condições de cultura celular representa uma barreira significativa à entrada para a pesquisa em cultura de células em ambientes microfluídicos, pois existe uma interseção estreita dentro da qual os parâmetros de fluxo de meio, duração da cultura e outras condições de cultura permitem a formação ótima da camada celular. Isso inclui as limitações de difusão impostas pela natureza impermeável ao oxigênio do invólucro do canal de cultura microfluídica. Isso requer uma consideração cuidadosa dos parâmetros de fluxo do meio, pois baixas taxas de fluxo podem privar as células de oxigênio, especialmente aquelas mais distantes da entrada; Por outro lado, altas taxas de fluxo podem empurrar as células para fora do canal de cultura ou resultar em desenvolvimento inadequado ou desigual da camada. Limitações de difusão podem ser abordadas com o uso de materiais permeáveis ao oxigênio, como polidimetilsiloxano (PDMS), em um aparelho de cultura de interface ar-líquido (LPA); no entanto, muitos canais de cultura microfluídica convencionais, como os do sistema elétrico cell-substrate impedance sensing (ECIS), são inerentemente impermeáveis ao oxigênio, dada a natureza do gabinete fabricado10. Este protocolo visa fornecer uma técnica para análise de camadas celulares cultivadas em um recinto impermeável ao oxigênio.

Ao comparar a viabilidade das condições de cultura, observações de características específicas da camada, tais como a presença de uma monocamada, topologia de superfície, confluência e uniformidade de espessura de camada, são necessárias para determinar se a camada celular produzida por um determinado conjunto de condições de cultura atende às especificações desejadas e são de fato relevantes para o planejamento experimental. Uma avaliação limitada pode ser realizada por métodos como o ECIS, que utiliza medidas de potencial elétrico (tensão) criado pela resistência à corrente alternada (CA) de alta frequência (impedância) imposta por membranas eletricamente isolantes de células cultivadas em eletrodos de ouro dentro da matriz de fluxo. Ao modular a frequência de CA aplicada às células, propriedades celulares específicas dependentes da frequência das células e das camadas celulares, tais como força de aderência superficial, formação de tight junction e proliferação ou confluência celular, podem ser alvo e examinadas11. No entanto, essas formas indiretas de medidas são um pouco difíceis de interpretar no início de um experimento, e podem não quantificar todos os aspectos relevantes da camada celular. A simples observação da camada celular sob um microscópio de contraste de fase pode revelar a natureza de certas qualidades, tais como confluência; no entanto, muitas características relevantes, como a presença de uma monocamada e uniformidade de espessura de camada, requerem uma avaliação tridimensional (3D), o que não é possível com imagens microscópicas de campo claro, contraste de fase ou fluorescente12.

O objetivo deste estudo foi desenvolver uma técnica de coloração de actina filamentosa para permitir a verificação por imagem de uma monocamada e a avaliação da uniformidade da camada celular usando microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). A actina filamentosa (F-actina) foi considerada um alvo apropriado para o conjugado fluoróforo, devido, em parte, à maneira como a F-actina segue firmemente a membrana celular, permitindo uma aproximação visual de todo o volume celular13. Outro benefício importante do direcionamento da F-actina é a maneira pela qual a coloração da F-actina elucida visualmente as rupturas ou alterações do citoesqueleto impostas pelos estresses e tensões experimentados pelas células. A fixação de ligações cruzadas com formaldeído livre de metanol foi utilizada para preservar a morfologia das células e da camada celular, uma vez que fixadores desidratantes, como o metanol, tendem a achatar as células, distorcendo grosseiramente a camada celular e alterando suas propriedades14,15.

Para determinar a capacidade da técnica de avaliação de camadas em mitigar esses desafios, as células foram cultivadas em câmaras de cultura tradicionais de oito poços, bem como em canais microfluídicos para avaliar as diferenças, se houver, nas camadas celulares produzidas. Para os poços de cultura fixos, foram utilizadas unidades de vidro coberto com câmara de oito poços. Para a cultura microfluídica, matrizes de fluxo (comprimento do canal 50 mm, largura 5 mm, profundidade 0,6 mm) foram otimizadas para o cultivo de células epiteliais do pulmão humano imortalizado (NCI-H441) em um ambiente com dimensões fisiologicamente relevantes para os bronquíolos terminais presentes na zona respiratória do pulmão humano16. Embora este protocolo tenha sido desenvolvido com o ambiente de cultura de matrizes de fluxo ECIS em mente, ele pode ser aplicado a qualquer ambiente de cultura dinâmica impermeável ao oxigênio para o qual a avaliação das características da camada celular cultivada ou das condições de cultura seja necessária.

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Protocol

A linhagem celular epitelial pulmonar humana NCI-H441 foi utilizada para o presente estudo (ver Tabela de Materiais).

1. Cultura celular no canal microfluídico

  1. Fabricar o canal microfluídico e realizar o pré-tratamento seguindo os passos abaixo.
    1. Obtenha uma matriz de fluxo de canal único (consulte Tabela de Materiais) e separe a porção superior da placa de base de policarbonato.
    2. Obter uma tampa de vidro retangular #1.5 (espessura 0,17 mm) com dimensões de 60 mm x 22 mm. Limpar as superfícies do vidro de cobertura num banho ultra-sónico e tratar um lado com uma solução de Poli-D-lisina 0,1 mg/ml à temperatura ambiente durante 5 minutos antes de secar a 60 °C durante 30 minutos.
    3. Afixar um adesivo de dupla face de 0,13 mm de espessura (ver Tabela de Materiais), cortado a laser para acomodar as dimensões do topo da matriz de fluxo e do canal de fluxo (50 mm de comprimento, 5 mm de largura), na parte superior da matriz de fluxo, tendo o cuidado de alinhar precisamente os recortes do canal17.
    4. Afixe um espaçador mylar de 0,1 mm de espessura (consulte Tabela de Materiais), cortado a laser para acomodar as dimensões do topo da matriz de fluxo e do canal de fluxo, na tira adesiva, tendo o cuidado de alinhar precisamente os recortes do canal.
    5. Repita os passos 1.1.3 e 1.1.4 até atingir a altura desejada do canal (por exemplo, para uma altura de canal de 0,6 mm, utilize dois espaçadores e três tiras adesivas).
    6. Afixe uma tampa retangular na tira adesiva mais inferior com o lado tratado com Poli-D-lisina voltado para o adesivo. Após a conclusão da montagem, conforme indicado na Figura 1, aplique pressão firme e igual na parte superior e inferior da construção e segure por 1 min.
      NOTA: A construção do gabinete do canal, incluindo vidro de cobertura, adesivos, espaçadores e parte superior da matriz de fluxo, está concluída.
    7. Enxágue o canal com água desionizada usando uma seringa, verificando simultaneamente se há vazamentos.
    8. Esterilizar o compartimento do canal em um esterilizador ultravioleta (UV) por 30 min18.
    9. Usando técnica estéril, tratar o canal com 2,0 μg/mL de fibronectina humana (ver Tabela de Materiais) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubar por pelo menos 30 min a 37 °C19.
  2. Realizar cultura celular no canal microfluídico seguindo os passos abaixo.
    1. Em uma capela de fluxo laminar estéril, use uma micropipeta para transferir uma suspensão uniforme de células NCI-H441 em meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino (FBS) (ver Tabela de Materiais) para semear dois canais microfluídicos, cada um com células a uma densidade de superfície de 150.000 células/cm2.
      1. Para canais de 50 mm x 5 mm x 0,6 mm, use 0,25 mL de uma suspensão de 2,5 x 106 células/mL para preencher cada canal, bem como uma parte dos portos. Verifique se as células foram distribuídas uniformemente dentro dos canais usando um microscópio de campo claro.
    2. Cultivar os dois canais por 24 h e 48 h, respectivamente, a 37 °C com 5% de CO2 usando uma bomba de seringa programável (ver Tabela de Materiais), extraindo mídia gasta do canal e mídia fresca para o canal a partir de um reservatório de meio estéril conectado à entrada do canal composto por uma seringa de 20 mL aberta coberta com filme de parafina.
      1. Após um período de espera de 10 minutos após a semeadura celular, introduzir e bombear meios frescos do reservatório através do canal a uma taxa de fluxo variável começando em 0,2 μL/min e aumentando até 10 μL/min por 4 h, mantendo-se nessa taxa a partir de20.
        NOTA: Esta taxa de fluxo variável fornece condições de cultura que permitem que as células (1) se estabeleçam gravitacionalmente na superfície de cultura, (2) adiram à superfície de cultura e (3) formem uma monocamada confluente.
  3. Realizar fixação celular dentro dos canais microfluídicos utilizando solução de formaldeído.
    CUIDADO: O formaldeído é tóxico e deve ser manuseado em exaustor químico apropriado21.
    1. Em uma capela de fumaça química, prepare soluções de formaldeído usando formaldeído a 4% em PBS (livre de metanol) (ver Tabela de Materiais) para criar duas porções de 4 mL, diluindo a primeira para uma concentração de formaldeído a 1% e a segunda para formaldeído a 2% usando solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS; com Ca 2+ e Mg2+) como diluente. Transfira soluções de formaldeído para separar seringas de 5 mL e rotule de acordo. Extrair 20 ml de DPBS para uma seringa separada de 20 ml.
    2. Remova os canais microfluídicos do aparelho de cultura e coloque-os no exaustor de fumaça química.
    3. Montar o aparelho de fixação e coloração.
      1. Conecte um segmento de 10 cm de tubulação de transferência à porta lateral de uma torneira de três vias por meio de uma trava Luer macho para o adaptador de farpa da mangueira (consulte Tabela de Materiais) e, em seguida, conecte a torneira à porta de entrada da matriz de fluxo.
      2. Em seguida, conecte outro segmento de 10 cm de tubulação de transferência à porta de saída da matriz de fluxo usando o mesmo tipo de adaptador de farpa de mangueira.
      3. Finalmente, fixe as extremidades livres de ambos os tubos de transferência em um recipiente de resíduos químicos e biohazard-appropriate, como um tubo de centrífuga cônica vazio rotulado de 50 mL.
    4. Gire a torneira para bloquear a porta de entrada do fluxo e limpe a linha de resíduos com DPBS. Em seguida, gire a torneira para bloquear a linha de resíduos e lave lentamente as células com 2 mL de DPBS. Repita sempre a etapa de lavagem usando a nova solução. Uma nova solução (ou concentração de solução) é introduzida no canal.
    5. Empurre lentamente 2 mL de solução fixadora a 1% através do canal e, em seguida, deixe descansar por 5 min22.
    6. Empurre lentamente 2 mL de solução fixadora a 2% através do canal e, em seguida, deixe descansar por 15 minutos.
    7. Lave as células introduzindo lentamente 2 mL de DPBS fresco no canal em três instâncias separadas (5 min cada).
    8. Conclua as etapas 1.3.3-1.3.7 para ambos os canais microfluídicos em paralelo.
  4. Corar, permeabilizar, e adicionar meios de montagem às células no canal microfluídico.
    1. Preparar uma solução de saponina a 0,1% adicionando 1 mg de saponina (ver Tabela de Materiais) por ml de DPBS para produzir 4 ml de solução e vórtice suavemente para misturar23. Introduzir 8 ml de DPBS numa seringa de 20 ml.
    2. Adicionar um reagente de faloidina corante com F-actina e um reagente Hoechst corante de núcleo (ver Tabela de Materiais) à solução de saponina a 0,1%, a duas gotas (0,1 ml) de cada reagente por ml de solução de saponina. Manter preparada a solução de coloração/permeabilização longe da luz, cobrindo com folha de alumínio24.
    3. Lavar a linha com uma pequena quantidade de solução corante/permeabilizante (conforme descrito no passo 1.3.4), introduzir 2 ml da solução no canal microfluídico e cobrir o canal com folha de alumínio antes de deixar descansar à temperatura ambiente durante 30 minutos.
    4. Lavar a solução de coloração/permeabilização duas vezes com 2 mL de DPBS por 5 minutos por lavagem.
    5. Para uma melhor qualidade de imagem, adicione um meio de montagem adequado (com um índice de refração que corresponda ao óleo da objetiva do microscópio e ao vidro da tampa, consulte Tabela de Materiais) no canal.
      1. Usando uma micropipeta, introduza uma quantidade mínima de um suporte antifade soft-set em cada porta do canal microfluídico, garantindo que a superfície inferior esteja completamente coberta e nenhuma bolha fique presa dentro da área de imagem desejada25. Sele as extremidades do canal e verifique a integridade da camada celular observando sob um microscópio de campo claro.
    6. Conclua as etapas 1.4.3-1.4.5 para ambos os canais microfluídicos em paralelo.
      NOTA: Células de imagem o mais rápido possível após a coloração para máxima qualidade de imagem. Se ocorrer fotobranqueamento ou se o armazenamento a longo prazo for desejado, outros meios de montagem com propriedades antifade ou de preservação de amostras podem ser usados. Observe que a mídia de montagem de cura dura distorcerá a estrutura 3D das células e, por extensão, a camada de células; Por essa razão, a mídia de montagem de ajuste suave é preferível26.
  5. Células de imagem no canal microfluídico seguindo as etapas abaixo.
    1. Ajuste as configurações do microscópio confocal (consulte Tabela de Materiais), incluindo potência do laser, ganho, deslocamento e parâmetros de varredura, como velocidade de varredura, área de varredura, formato de varredura, resolução e diâmetro do orifício27.
    2. Teste a localização da imagem fazendo varreduras de referência, bem como pilhas Z até que os parâmetros e condições de imagem desejados tenham sido atendidos. Parâmetros de discagem em objetivas de ampliação sequencialmente mais altas até que a objetiva de imersão em óleo de 40x tenha sido atingida e otimizada28.
    3. Usando a placa de base de matriz de fluxo como referência, construa pilhas Z em cinco locais, na localização do primeiro eletrodo no lado de entrada, a meio caminho entre o centro e o local anterior, o centro, a meio caminho entre o centro e a localização do último eletrodo (no lado de saída), e no último eletrodo, conforme indicado na Figura 2.
  6. Realizar processamento de imagens e análise de dados.
    1. Exporte seções transversais XZ e YZ usando o pacote de software de microscópio confocal (consulte Tabela de Materiais).
    2. Usando um software de processamento de imagem (consulte Tabela de Materiais) com recursos de detecção de borda (valor de limite 15,0), meça a área total da imagem em pixels usando a ferramenta Varinha Mágica fora da imagem e, em seguida, a área excluindo a área transversal total da camada de célula em pixels usando a ferramenta Varinha Mágica na parte da imagem externa à camadade célula 29.
    3. Usando o software de processamento de dados (consulte Tabela de materiais), subtraia o valor de pixel de área externa do valor de pixel de área total para encontrar o valor de pixel de área transversal.
    4. Converta valores de pixel de área transversal para valores de μm2 multiplicando os valores de pixel pelo quadrado do valor de μm/pixel, conforme indicado no software do microscópio para a imagem específica (0,31 μm/pixel para pilhas Z tomadas em resolução de 1024p sem zoom em uma lente de imersão em óleo de 40x).
    5. Calcular médias e desvios-padrão dos dados e resultados gráficos.

Figure 1
Figura 1: Esquema de visão explodida da construção do canal microfluídico. O elemento superior é a porção superior da matriz de fluxo, os elementos cinzentos finos são tiras adesivas, os elementos azuis finos são espaçadores mylar e o elemento inferior é o vidro de cobertura retangular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Cinco locais de imagem ao longo da região consistentemente produtora de camadas do canal de cultura microfluídica. Os locais de aquisição de imagens são os seguintes: lado de entrada, próximo de onde o primeiro eletrodo estaria no arranjo de fluxo intacto; a meio caminho entre a localização do lado da entrada e o centro do canal; centro do canal; a meio caminho entre o centro e o lado da saída, e o lado da saída, perto de onde o último eletrodo estaria na matriz de fluxo intacta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Cultura celular na tampa de oito poços com câmara

  1. Realizar o pré-tratamento do vidro de cobertura com câmara de oito poços.
    1. Obter um vidro de cobertura estéril com câmara de oito poços fabricado com um vidro de cobertura #1.5 e tratamento de superfície que aumenta a aderência celular (Figura 3, consulte a Tabela de Materiais).
    2. Usando técnica estéril, tratar a superfície dos poços de cultura com 2,0 μg/mL de fibronectina humana em PBS e incubar por pelo menos 30 min a 37 °C19.
  2. Realizar cultura celular na tampa da câmara seguindo os passos abaixo.
    1. Em uma capela de fluxo laminar estéril, transfira porções de 0,5 mL de soluções de células NCI-H441 uniformemente suspensas em meio RPMI 1640 com FBS de 10% nas densidades volumétricas de 81.000, 162.000 e 324.000 células/mL para semear os poços de cultura nas densidades superficiais de 45.000, 90.000 e 180.000 células/cm2, respectivamente. Verifique se as células foram distribuídas uniformemente dentro dos poços usando um microscópio de campo claro.
    2. Células de cultura por 24 h, 48 h e 96 h a 37 °C com 5% de CO2, substituindo os meios diariamente.
  3. Realizar a fixação com formaldeído no vidro de cobertura com oito poços.
    CUIDADO: O formaldeído é tóxico e deve ser manuseado em exaustor químico apropriado21.
    1. Em uma capela de fumo químico, prepare soluções de formaldeído fazendo duas porções de formaldeído a 4% em PBS (livre de metanol), diluindo a primeira a uma concentração de formaldeído a 1% e a outra a formaldeído a 2% usando solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS; com Ca 2+ e Mg2+) como diluente.
    2. Retire o vidro de cobertura com câmara de cultura de oito poços da incubadora e coloque-o no exaustor de fumaça química.
    3. Lave suavemente as células com 0,5 mL de DPBS usando uma micropipeta, introduzindo lentamente o líquido ao longo da porção superior do canto de cada poço.
    4. Remova o líquido existente em cada poço extraindo-o lentamente do canto dos poços usando uma micropipeta. Usando o método de introdução de líquidos (passo 2.3.3), introduzir 0,5 mL de solução fixadora a 1% em cada poço e deixá-lo descansar por 5 min22.
    5. Remover o líquido existente em cada poço utilizando o método de extracção de líquidos mencionado no ponto 2.3.4. Usando o método de introdução de líquidos mencionado na etapa 2.3.3, introduzir 0,5 mL de solução fixadora a 2% em cada poço e deixá-lo descansar por 15 min.
    6. Usando os métodos de introdução e extração de líquidos (etapas 2.3.3 e 2.3.4), lave as células introduzindo e removendo 0,5 mL de DPBS fresco em cada poço em três instâncias separadas por 5 min cada.
  4. Execute a adição de manchas, permeabilização e mídia de montagem no vidro de cobertura com câmara de oito poços.
    1. Preparar solução de saponina a 0,1% adicionando 1 mg de saponina por ml de DPBS e vórtice suavemente para misturar23.
    2. À solução de saponina a 0,1%, adicionar duas gotas (0,1 mL) cada de um reagente faloidina corante com F-actina e um reagente Hoechst corante para núcleo por mL de solução de saponina. Mantenha a solução preparada longe da luz, cobrindo com papel alumínio24.
    3. Introduzir 0,2 mL de solução corante/permeabilizante em cada poço e cobrir o vidro de cobertura com folha de alumínio antes de deixá-lo descansar à temperatura ambiente por 30 min.
    4. Eliminar a solução corante/permeabilizante duas vezes com 0,5 mL de DPBS.
    5. Para uma melhor qualidade de imagem, adicione um meio de montagem adequado (com um índice de refração que corresponda ao óleo da objetiva do microscópio e ao vidro da tampa) nos poços.
      1. Usando uma micropipeta, introduza uma quantidade mínima de um suporte antifade suave em cada poço, garantindo que a superfície inferior esteja completamente coberta e nenhuma bolha fique presa dentro da área de imagem desejada25. Verifique a integridade da camada celular observando sob um microscópio de campo claro.
        NOTA: Células de imagem o mais rápido possível após a coloração para máxima qualidade de imagem. Se ocorrer fotobranqueamento ou se o armazenamento a longo prazo for desejado, outros meios de montagem com propriedades antifade ou de preservação de amostras podem ser usados. Observe que a mídia de montagem de cura dura distorcerá a estrutura 3D das células e, por extensão, a camada de células, de modo que a mídia de montagem de ajuste suave é preferível26.
  5. Realize imagens no vidro de cobertura com câmara de oito poços.
    1. Ajuste as configurações do microscópio confocal, incluindo potência do laser, ganho, deslocamento e parâmetros de varredura, como velocidade de varredura, área de varredura, formato de varredura, resolução e diâmetro do orifício27.
    2. Teste a localização da imagem fazendo varreduras de referência, bem como pilhas Z até que os parâmetros e condições de imagem desejados tenham sido atendidos. Parâmetros de discagem em objetivas de ampliação sequencialmente mais altas até que a objetiva de imersão em óleo de 40x tenha sido atingida e otimizada28.
    3. Construa pilhas Z de três locais aleatórios em cada correspondência de densidade de semeadura/duração da cultura.
  6. Realizar processamento de imagens e análise de dados.
    1. Exporte seções transversais XZ e YZ usando o pacote de software de microscópio confocal.
    2. Usando um software de processamento de imagem com recursos de detecção de borda (valor limite 15.0), meça a área total da imagem em pixels usando a ferramenta Varinha Mágica fora da imagem e, em seguida, a área excluindo a área transversal total da camada de célula em pixels usando a ferramenta Varinha Mágica na parte da imagem externa à camada de célula29.
    3. Usando um software de processamento de dados, subtraia o valor de pixel de área externa do valor de pixel de área total para encontrar o valor de pixel de área transversal.
    4. Converta valores de pixel de área transversal para valores de μm2 multiplicando os valores de pixel pelo quadrado do valor de μm/pixel, conforme indicado no software do microscópio para a imagem específica (0,31 μm/pixel para pilhas Z tomadas em resolução de 1024p sem zoom em uma lente de imersão em óleo de 40x).
    5. Calcule médias e desvios-padrão e resultados gráficos.

Figure 3
Figura 3: Diagrama do vidro de cobertura com câmara de oito poços usado para o experimento de cultura, coloração e imagem de poço fixo, comparando os efeitos da densidade inicial de semeadura celular e da duração do cultivo na formação de camadas celulares. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Representative Results

O método apresentado permite a visualização de camadas de células epiteliais cultivadas em canais de cultura microfluídica e utiliza como validação uma demonstração em ambientes tradicionais de cultura celular de poço fixo. As imagens adquiridas existirão em um espectro de qualidade, intensidade de sinal e especificidade do alvo celular. As imagens bem sucedidas demonstrarão alto contraste, permitindo a análise das imagens e a quantificação dos dados para posterior avaliação estatística. As imagens malsucedidas serão fracas, difusas, borradas ou inutilizáveis para avaliação subjetiva ou quantitativa. Algumas imagens podem ser adequadas para a determinação subjetiva das características da camada sem deixar de ser de qualidade insuficiente para análise quantitativa. Assim, o grau e o cuidado com que o protocolo é seguido impactarão diretamente na adequação de uma determinada imagem para servir como fonte de dados para análise estatística.

A Figura 4 representa o uso bem-sucedido da técnica no contexto de um ambiente de cultura dinâmica microfluídica e mostra a aquisição de imagens na entrada e saída de dois dispositivos microfluídicos. A Figura 4A,B fornece exemplos de camadas cultivadas por 24 h, e a Figura 4C,D apresenta exemplos de camadas cultivadas por 48 h. A Figura 5 ilustra os dados associados coletados do experimento de canal microfluídico, incorporando três amostras de cada um dos cinco locais de imagem de canais microfluídicos indicados na Figura 2 de cada duração de cultura. As barras de erro significam desvios padrão.

A Figura 6 mostra uma imagem 2D do plano XY no centro do canal microfluídico, e a Figura 7 mostra uma visão 3D do mesmo local com codificação de cores de profundidade. A Figura 8 representa a aquisição bem-sucedida de imagens dentro de um experimento de densidade-duração analisando os efeitos da densidade inicial de semeadura celular e da duração da cultura na formação da camada celular NCI-H441 no ambiente de vidro de oito poços com câmara. A Figura 8A-C indica as durações das culturas de 24 h, 48 h e 96 h, respectivamente. A Figura 8X-Z indica densidades iniciais de semeadura celular de 180.000, 90.000 e 45.000 células/cm2, respectivamente. A Figura 9 apresenta dados quantitativos coletados do experimento de vidro coberto com câmara de oito poços, incluindo amostras de três locais em cada confronto densidade-duração. As barras de erro representam os desvios-padrão e testes de p-valor foram realizados para determinar diferenças estatisticamente significativas entre valores aparentemente próximos.

Esses dois experimentos representativos dentro dos ambientes microfluídico dinâmico e estático de oito poços são exemplos distintos de casos de uso que demonstram como a técnica pode contextualizar os achados experimentais confirmando visualmente a presença ou ausência de monocamadas fisiologicamente relevantes.

Figure 4
Figura 4: Camadas de células NCI-H441 cultivadas no canal microfluídico por 24 e 48 h, fotografadas nos locais de entrada e saída, conforme ilustrado na Figura 2. (A) 24 h, lado de entrada. (B) 24 h, lado de saída. (C) 48 h, entrada. (D) 48 h, saída-lado. O azul representa a coloração dos núcleos e o verde representa a coloração da actina filamentosa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Representação gráfica dos dados coletados durante o experimento de imagem de canal microfluídico de 24-48 h. Isso inclui seis amostras de área de secção transversal de cada um dos cinco locais ao longo do comprimento relevante do canal microfluídico (conforme ilustrado na Figura 2). As barras de erro representam desvios padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Imagem 2D obtida no plano XY em um local central dentro do canal microfluídico. O azul representa a coloração dos núcleos e o verde representa a coloração da actina filamentosa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Modelo 3D da mesma localização do canal microfluídico da Figura 6. A codificação de cores representa dados de profundidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Camadas de células NCI-H441 cultivadas no vidro de cobertura com câmara de oito poços. Para 24 h (A), 48 h (B) e 96 h (C) nas densidades iniciais de semeadura de 180.000 (X), 90.000 (Y) e 45.000 (Z) células/cm2. O azul representa a coloração dos núcleos e o verde representa a coloração da actina filamentosa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Representação gráfica dos dados coletados durante o experimento de cultivo de oito poços com densidade-duração. Isso inclui seis amostras de área de secção transversal de cada confronto densidade-duração. As barras de erro representam desvios padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo apresentado descreve a cultura, fixação de reticulação, coloração, permeabilização e visualização microscópica confocal de células epiteliais pulmonares humanas NCI-H441 no ambiente dinâmico de um arranjo de fluxo microfluídico de canal único, bem como no ambiente estático de uma cobertura tradicional de oito poços. Com qualquer protocolo de cultura de células microfluídicas, as condições de fluxo do meio de cultura celular são de suma importância, pois o fluxo de alta taxa tem o potencial de lavar as células ou interferir na montagem normal da monocamada celular. Enquanto isso, o fluxo de baixa velocidade tem o potencial de "morrer de fome" ou "sufocar" (disponibilidade insuficiente de nutrientes e oxigênio, respectivamente) a camada celular devido às limitações de difusão impostas pela natureza impermeável do canal microfluídico, bem como pelas características do fluxo30. Começando com um período de espera de 10 min (durante o qual as células permanecem suspensas no mesmo meio que originalmente preencheu o canal), depois avançando para uma taxa de fluxo de 0,2 μL/min, antes de finalmente aumentar para 10 μL/min ao longo de 4 h, essas necessidades concorrentes são equilibradas para promover a adesão e a sobrevivência celular.

Outra etapa crítica do protocolo é a preparação adequada do canal microfluídico, incluindo a construção e o pré-tratamento. Deve-se tomar cuidado para garantir que o vidro da tampa seja montado corretamente na construção da câmara para evitar vazamentos e possíveis contaminações. A fixação adequada do vidro de cobertura também é necessária para garantir que a altura do canal seja consistente e reproduzida com precisão entre ensaios sucessivos usando diferentes unidades construídas. Menor variabilidade pode ser introduzida pela tolerância na espessura das tiras adesivas utilizadas, bem como pela compressibilidade relativa. Minimizar qualquer variabilidade ajudará na consistência dos resultados experimentais. O pré-tratamento adequado do canal construído é importante para garantir que as células possam aderir e iniciar a proliferação na superfície de vidro. A limpeza ultra-sônica do vidro melhora a aderência da Poli-D-lisina, promovendo a aderência à fibronectina. A adição de fibronectina, uma glicoproteína naturalmente sintetizada e secretada por células epiteliais humanas, promove ainda mais a aderência das células NCI-H441 à superfície de vidro de cobertura, permitindo o desenvolvimento normal da monocamada celular31.

Além disso, um dos aspectos mais importantes desse protocolo é a localização das imagens. Apesar do preparo cuidadosamente controlado, devido ao volume colunar disponível nas regiões das duas aberturas dos canais, mais células estarão presentes na superfície do vidro da cobertura na área diretamente abaixo e adjacente a essas aberturas, mesmo aderindo a técnicas adequadas de cultura celular. Por esta razão, as regiões próximas às aberturas não devem ser consideradas como parte da camada celular cultivada "normal", pois haverá multicamadas/empilhamento de células significativas ocorrendo lá. Em vez disso, a região central do canal microfluídico é uma área apropriada para a obtenção de imagens, pois essa localização não é perturbada pelo erro imposto pela variação da altura do canal perto das aberturas. A localização dos eletrodos na matriz de fluxo pode ser usada para guiar os locais de imagem e, como regra geral, todas as varreduras destinadas a capturar camadas verdadeiramente representativas das condições do canal microfluídico devem ser tomadas em locais análogos dentro dos limites dos dois eletrodos mais distantes na matriz de fluxo. Além disso, no protocolo descrito, a objetiva de aumento de 40x é especificada para uso; no entanto, isso pode ser modificado para atender às necessidades do usuário. A ampliação de 40x foi escolhida como a ampliação ideal devido à sua capacidade de oferecer imagens de alta resolução e alta magnificação, mantendo um número suficiente de células para servir como uma amostra estatisticamente válida.

Uma modificação que pode ser feita no canal microfluídico inclui a alteração da altura do canal, que pode ser obtida variando-se o número de espaçadores e adesivos usados para construir o canal microfluídico. A alteração da altura do canal provavelmente exigirá o ajuste dos parâmetros de fluxo para garantir que a tensão de cisalhamento não remova as células durante a alimentação. Como tal, qualquer variação na altura do canal afetará a taxa inicial ideal, a taxa de ramp-up e a taxa final de fluxo de mídia. O protocolo descrito neste artigo pode servir como um meio pelo qual taxas de fluxo adequadas podem ser derivadas experimentalmente, em conjunto com métodos indiretos, como o ECIS. Além disso, as vazões podem ser modificadas para atender às necessidades de diferentes linhagens celulares, o que pode exigir adaptação para estabelecer condições ideais. Outra modificação que pode ser feita, com alguns acréscimos às etapas deste protocolo, é expandir o caso de uso da técnica descrita para além da comparação relativa da área de secção transversa das camadas celulares. Com calibração apropriada usando microesferas ou microesferas de dimensões conhecidas, medidas precisas de área de secção transversal, volumétrica, topológica e absoluta podem ser tomadas. A calibração usando um objeto de referência é necessária neste caso devido à resolução Z limitada do microscópio confocal e ao potencial de sobreamostragem ou subamostragem na dimensão Z devido ao controle manual sobre o tamanho do passo da pilha Z que os sistemas de varredura confocal oferecem32.

Uma limitação desse protocolo é a falta de mensuração volumétrica verdadeira devido à falta de etapas verticais de calibração. A calibração mencionada acima e a técnica de verificação utilizando microesferas fluorescentes de dimensões conhecidas podem ser usadas para escalonamento real. Além disso, o presente protocolo envolve o uso de colorações pré-preparadas e prontas para uso. A coloração por imunofluorescência usando anticorpos primários e secundários geralmente requer um protocolo de vários dias que é mais envolvido do que o discutido neste artigo. No entanto, é provável que seja possível utilizar a coloração por imunofluorescência dessa maneira, embora algumas experimentações possam ser necessárias para otimizar o fluxo de trabalho. Dadas as etapas adicionais envolvidas nos protocolos de coloração por imunofluorescência, deve-se tomar cuidado para evitar o cisalhamento da camada celular cultivada durante as inúmeras etapas de lavagem, pois isso pode alterar as propriedades da camada celular avaliada e, portanto, invalidar quaisquer conclusões que se seguiriam. Desenvolvimentos adicionais dessa técnica podem incluir a automação da análise de imagens e dados, incluindo detecção e quantificação da região de interesse (ROI) para a determinação da área de secção transversal. Além disso, expandir esta técnica para incluir diferentes estruturas alvo intra e extracelulares (talvez coloração para alvos como proteínas de junção apertada) pode ampliar o caso de uso deste método para a co-localização 3D dentro de dispositivos de cultura de células microfluídicas.

Para produzir as camadas celulares fisiologicamente mais representativas, as células epiteliais pulmonares devem ser cultivadas em canais microfluídicos com uma interface ar-líquido (LPA) na superfície de cultura, o que é tipicamente realizado usando polidimetilsiloxano (PDMS), um material flexível tornado permeável pela introdução de poros em escala μm. As condições de cultivo da LPA permitem a formação de camadas celulares que mais se assemelham às características fisiológicas do epitélio pulmonar in vivo 33. Embora tecnicamente possível, o uso de ECIS em um ambiente de cultura de LPA com uma superfície de cultura de PDMS em um ambiente microfluídico dinâmico é impraticável e inacessível para a maioria dos pesquisadores, pois não há equipamentos comercialmente disponíveis para uma montagem de cultura celular tão complexa34. Uma razão para essa dificuldade pode ser a necessidade paradoxal de uma superfície de cultura permeável que ainda seja capaz de atuar como um eletrodo sólido para fins de medidas de ECIS. Como tal, atualmente existe a necessidade de um método para verificar visualmente as características e a relevância fisiológica de camadas celulares cultivadas em ambientes de cultura impermeáveis ao oxigênio, como aqueles presentes em matrizes de fluxo ECIS.

Este método expande o método tradicional de garantir a confluência adequada usando microscopia bidimensional, permitindo a visualização 3D, o que amplia muito o número de características da camada celular que podem ser observadas, quantificadas e analisadas. Além disso, isso permite uma determinação subjetiva da presença de uma monocamada, uniformidade de camada e outras propriedades consideradas relevantes para fins experimentais. Este protocolo é importante porque serve como um meio para a verificação visual e avaliação das camadas celulares que estão sendo produzidas em muitos ambientes impermeáveis ao oxigênio, como em experimentos ECIS avaliando propriedades de função de barreira de células epiteliais expostas ao atelectrauma. Isso também serve como um método que pode ser usado em trabalhos futuros para determinar se um conjunto de condições dinâmicas de cultura microfluídica produz camadas celulares relevantes e apropriadas para experimentação posterior.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores agradecem a Alan Shepardson por projetar o padrão de corte para o adesivo 3M e a folha de mylar usados na construção de canais microfluídicos e por testar a taxa de fluxo do meio de cultura celular e a programação da bomba de seringa. O financiamento foi fornecido pelo NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 e Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

Materials

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A1R HD25 Confocal Microscope System Nikon A1R HD25 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) Invitrogen R37110 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered 3M 468MP https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes Air-Tite RL5 14-817-53 https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet BAISDY AS022 https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath Branson Ultrasonics 15-336-100 https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, Human Fisher Scientific CB-40008 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array Applied BioPhysics 1F8x10E PC https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White Enterprise Technology Solutions 50-211-1163 https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes Thermo Scientific 4642090 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes Fisher Scientific 06-443-21 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) Fisher Scientific 12-544-GP https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-458 https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 Medium Gibco 11875093 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) Invitrogen FB002 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ Fiji ImageJ ImageJ Fiji https://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 cc Nikon MXA22168 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel Thermo Scientific 3950 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System Laxco LMC3BF1 https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK Masterflex ZY-45505-31 https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
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UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft Excel Microsoft 0016 https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable Syringes Thermo Scientific 03-377-24 https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells American Type Culture Collection (ATCC) HTB-174 https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1600 https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements AR Nikon NIS Elements AR https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Scientific 155411 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping Film Fisher Scientific S37441 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch PendoTech ZY-19406-49 https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 Gibco 10010023 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-Lysine Gibco A3890401 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Aluminum Wrap Foil Reynolds 458742928317 https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
Saponin Millipore Sigma (Sigma Aldrich) 47036 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant Invitrogen S36917-5X2ML https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package Thermo Scientific 13-100-752PM https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft Cole-Parmer EW-95702-01 https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

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