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Artigo de método

Isolamento e Reprogramação Neuronal Direta de Astrócitos de Camundongos

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DOI:

10.3791/64175

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7 de julho de 2022

 ,  , 
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, 2Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, 3Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para gerar culturas altamente enriquecidas de astrócitos derivados de diferentes regiões do sistema nervoso central de camundongos pós-natais e sua conversão direta em neurônios funcionais pela expressão forçada de fatores de transcrição.

Resumo

A reprogramação neuronal direta é uma abordagem poderosa para gerar neurônios funcionais de diferentes populações de células iniciantes sem passar por intermediários multipotentes. Essa técnica não só mantém grandes promessas no campo da modelagem da doença, como permite converter, por exemplo, fibroblastos para pacientes que sofrem de doenças neurodegenerativas em neurônios, mas também representa uma alternativa promissora para terapias de substituição baseadas em células. Nesse contexto, um grande avanço científico foi a demonstração de que células não neurais diferenciadas dentro do sistema nervoso central, como os astrócitos, poderiam ser convertidas em neurônios funcionais in vitro. Desde então, a reprogramação direta in vitro de astrócitos em neurônios forneceu insights substanciais sobre os mecanismos moleculares subjacentes à conversão de identidade forçada e os obstáculos que impedem a reprogramação eficiente. No entanto, os resultados de experimentos in vitro realizados em diferentes laboratórios são difíceis de comparar devido a diferenças nos métodos utilizados para isolar, cultura e reprogramar astrócitos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolar e cultivar astrócitos com alta pureza de diferentes regiões do sistema nervoso central de camundongos em idades pós-natal através da triagem de células magnéticas. Além disso, fornecemos protocolos para reprogramar astrócitos cultivados em neurônios via transdução viral ou transfecção de DNA. Este protocolo simplificado e padronizado pode ser usado para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à manutenção da identidade celular, o estabelecimento de uma nova identidade neuronal, bem como a geração de subtipos neuronais específicos e suas propriedades funcionais.

Introdução

O sistema nervoso central dos mamíferos (SNC) é altamente complexo, consistindo de centenas de tipos de células diferentes, incluindo um grande número de diferentes subtipos neuronais 1,2,3,4,5,6. Ao contrário de outros órgãos ou tecidos 7,8,9, o CNS mamífero tem uma capacidade regenerativa muito limitada; a perda neuronal após lesão cerebral traumática ou neurodegeneração é irreversível e muitas vezes resulta em déficits motores e cognitivos10. Com o objetivo de resgatar funções cerebrais, diferentes estratégias para substituir neurônios perdidos estão sob intensa investigação11. Entre eles, a reprogramação direta de células somáticas em neurônios funcionais está emergindo como uma abordagem terapêutica promissora12. Reprogramação direta, ou transdiferenciação, é o processo de conversão de um tipo de célula diferenciada em uma nova identidade sem passar por um estado de proliferação intermediária ou pluripotente 13,14,15,16. Pioneiro pela identificação do MyoD1 como fator suficiente para converter fibroblastos em células musculares17,18, este método foi aplicado com sucesso para reprogramar vários tipos celulares em neurônios funcionais 19,20,21.

Os astrócitos, a macroglia mais abundante no CNS22,23, são um tipo celular particularmente promissor para reprogramação neuronal direta por várias razões. Em primeiro lugar, eles são amplamente e uniformemente distribuídos através do CNS, fornecendo uma abundante fonte in loco para novos neurônios. Em segundo lugar, os astrócitos e os neurônios estão intimamente relacionados, pois compartilham um ancestral comum durante o desenvolvimento embrionário, as células gliaisradiais 24. A origem embrionária comum dos dois tipos de células parece facilitar a conversão neuronal em comparação com a reprogramação de células de diferentes camadas germinativas19,21. Além disso, a padronização das informações herdadas pelos astrócitos através de sua origem radial glia também é mantida em astrócitos adultos 25,26,27, e parece contribuir para a geração de subtipos neuronais regionalmente apropriados 28,29,30. Assim, investigar e entender a conversão de astrócitos em neurônios é uma parte importante para alcançar todo o potencial dessa técnica para estratégias de substituição baseadas em células.

A conversão de astrócitos in vitro cultivados em neurônios levou a vários avanços no campo da reprogramação neuronal direta, incluindo: i) a identificação de fatores de transcrição suficientes para gerar neurônios a partir de astrócitos 15,19,31, ii) o desenrolar de mecanismos moleculares desencadeados por diferentes fatores de reprogramação no mesmo contexto celular 32 , e iii) destacando o impacto da origem do desenvolvimento dos astrócitos na indução de diferentes subtipos neuronais 28,29,33. Além disso, a conversão direta in vitro de astrócitos desvendou vários obstáculos importantes que limitam a reprogramação neuronal direta34,35, como o aumento da produção de oxigênio reativo (ROS)34 e diferenças entre o proteome mitocondrial de astrócitos e neurônios35. Assim, essas observações apoiam fortemente o uso de culturas primárias de astrócitos como modelo de reprogramação neuronal direta para investigar várias questões fundamentais na biologia12, relacionadas à manutenção da identidade celular, bloqueios nas estradas que impedem mudanças no destino celular, bem como o papel do metabolismo na reprogramação.

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para isolar os astrócitos de camundongos na idade pós-natal (P) com pureza muito alta, como demonstrado pela isolação de astrócitos da medula espinhal murina29. Também fornecemos protocolos para reprogramar astrócitos em neurônios via transdução viral ou transfecção plasmida de DNA. As células reprogramadas podem ser analisadas em 7 dias após a transdução (7 DPT) para avaliar vários aspectos, como eficiência de reprogramação e morfologia neuronal, ou podem ser mantidas na cultura por várias semanas, para avaliar seu amadurecimento ao longo do tempo. É importante ressaltar que este protocolo não é específico para astrócitos da medula espinhal e pode ser facilmente aplicado para isolar astrócitos de várias outras regiões cerebrais, incluindo a matéria cinzenta cortical, o cérebro médio e o cerebelo.

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Protocolo

O procedimento a seguir segue as diretrizes de cuidados com animais do Helmholtz Zentrum Munique de acordo com a diretiva 2010/63/UE sobre a proteção de animais utilizados para fins científicos. Certifique-se de cumprir as diretrizes de cuidado animal da instituição onde a dissecação é realizada.

1. Preparação de dissecção, dissociação e materiais culturais

NOTA: Prepare todos os reagentes de cultura dentro de um armário de segurança biológica e trabalhe usando apenas equipamentos autoclavados ou estéreis. Reagentes de dissecção e dissociação podem ser preparados fora de um gabinete de segurança biológica.

  1. Prepare frascos de cultura revestindo um frasco de cultura T25 com poli-D-lysine (estoque 1 mg/mL; solução de trabalho 20 μg/mL) em H2O por um mínimo de 2h. Depois, enxágue 3x com H2O e ar seco.
  2. Prepare o buffer de dissecção adicionando 5 mL de solução tampão HEPES de 1 M HEPES a 500 mL da solução de sal balanceada (HBSS) da Hank.
  3. Prepare um tubo C (ver Tabela de Materiais) por seis medulas espinhais adicionando 1950 μL de tampão X do kit de dissociação do tecido neural (ver Tabela de Materiais). Guarde gelo durante a dissecção. Prepare a mistura mestre de digestão enzimática adicionando 20 μL de tampão Y e 10 μL de tampão A por tubo C (parte do kit de dissociação do tecido neural; ver Tabela de Materiais). Misture bem e armazene a 4 °C até que seja necessário.
  4. Prepare 1x salina tamponada de fosfato (1x PBS) com cálcio e magnésio e coloque no gelo. Prepare o meio de cultura básica adicionando 5 mL de penicilina-estreptomicina (concentração final, 100 U/mL), 5 mL de 45% D-glicose e 5 mL de suplemento de glutamina (concentração final 2 mM; ver Tabela de Materiais) a 485 mL de DMEM/F12. O meio básico fica estável a 4 °C durante 4 semanas.
  5. Prepare o meio de cultura astrócito adicionando 1 mL de suplemento B27 e 5 mL de soro bovino fetal (FBS) a 44 mL de meio de cultura básica. Suplemento médio com fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento do fibroblasto básico (bFGF) (10 ng/mL cada). Adicione EGF e bFGF pouco antes de usar na quantidade adequada de meio.
  6. Para a dissecção do tecido da medula espinhal, use um par de fórceps grandes com ponta dobrada, um par de fórceps pequenos com ponta dobrada, um par de fórceps pequenos, um par de tesouras pequenas e uma pequena espátula.

2. Isolamento de astrócito

  1. Isolar astrócitos da medula espinhal de camundongos pós-natais para realizar sua reprogramação direta em neurônios funcionais (Figura 1A). Para este protocolo, colete tecido medular de camundongos no dia 2-3 após o nascimento. Colete de seis a oito medulas espinhais para isolamento de astrócitos. Use este mesmo protocolo para isolar astrócitos de outras regiões do sistema nervoso, como o córtex, o cérebro médio e o cerebelo. Para essas regiões, obtenha células de cinco a sete dias após o nascimento.
    NOTA: Ao se ter como objetivo isolar os astrócitos de regiões que não são mencionadas neste protocolo, a idade e o material de entrada devem ser determinados experimentalmente.

3. Dissecção do tecido medular

NOTA: A dissecação do tecido pode ser realizada fora de um armário de segurança biológica.

  1. Sacrificar ratos em P2-P3 por decapitação sem anestesiar o animal. Coloque o tronco em uma placa de Petri de 35 mm e mantenha no gelo.
  2. Abra a pele com uma tesoura, remova a vértebra com uma tesoura pequena, extraia a medula espinhal e coloque-a no tampão de dissecção no gelo. Sob um microscópio de dissecção estereotática com ampliação de 2x, remova as meninges das medulas espinhais isoladas usando fórceps e transfira tecido medular dissecado e limpo para um tubo C.

4. Classificação celular ativada magnética (MACS)

  1. Adicione 50 μL de enzima P do kit de dissociação do tecido neural (ver Tabela de Materiais) e 30 μL de mistura de enzima previamente preparada a cada tubo C. Inverta os tubos C e coloque-os em um dissociador aquecido (ver Tabela de Materiais), certificando-se de que todo o tecido seja coletado na tampa do tubo.
  2. Execute o programa de dissociação 37_NTDK_1 com um tempo de execução de aproximadamente 22 min. Pouco antes do final do programa, coloque um coador de 70 μm (ver Tabela de Materiais) em um número de tubos de 15 mL iguais ao número de tubos C usados e pré-molhado o coador com 2 mL de PBS gelado. Armazene 1x PBS no gelo durante todo o procedimento macs.
  3. Após a conclusão do programa, remova os tubos C e centrifuá-los brevemente para coletar o tecido na parte inferior dos tubos. Transfira o tecido dissociado dos tubos C para os tubos de 15 mL preparados passando-o pelo coador. Deixe o filtro em tubos de 15 mL.
  4. Enxágüe o tubo C com 10 mL de 1x PBS para coletar restos de tecido e colecioná-lo no mesmo tubo de 15 mL passando pelo coador mais uma vez. Centrifugar os tubos de 15 mL contendo tecido dissociado a 300 x g por 10 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Esfrie a centrífuga até 4 °C após esta etapa.
  5. Remova o supernatante sem perturbar a pelota celular antes de reutilizar as células em 80 μL de 1x PBS; adicionar 10 μL de reagente de bloqueio do kit de microesfera anti-ACSA-2 do mouse (ver Tabela de Materiais). Misture suavemente por pipetação.
  6. Incubar a 4 °C por 10 min no escuro (geladeira). Adicione 10 μL de antígenos de superfície anti-astrócitos de superfície de células 2 acoplados (ver Tabela de Materiais) e misture suavemente por pipetação. Incubar por 15 min a 4 °C no escuro.
  7. Lave as células adicionando 3 mL de 1x PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min a 4 °C. Enquanto centrifuga, monte um separador magnético (ver Tabela de Materiais) colocando o número apropriado de colunas de triagem magnética (ver Tabela de Materiais) no separador com um tubo de coleta de 15 mL por baixo. Enxágüe as colunas com 500 μL de 1x PBS.
  8. Remova o supernasciente e resuspense as células em 500 μL de 1x PBS antes de transferir as suspensões celulares para as colunas magnéticas. Deixe drenar pela gravidade. Lave os tubos de 15 mL com 500 μL de PBS 1x e aplique na coluna. Lave as colunas com 500 μL de 1x PBS para mais duas lavagens.
  9. Células elutes removendo a coluna do separador, adicionando 800 μL de meio de cultura astrócito e empurrando células para fora da coluna com o êmbolo incluído.
  10. Células de placa nos frascos de cultura previamente preparados adicionando 4,2 mL de cultura de astrócitos complementadas com EGF e bFGF e cultura a 37 °C e 5% de CO2.
    NOTA: Os frascos de cultura de revestimento não são necessários para astrócitos isolados de outras regiões cerebrais, mas fornecem um melhor substrato para astrócitos isolados da medula espinhal.
  11. Células de cultura por aproximadamente 7 dias até a confluência (80%-90%). Se as células não estiverem confluentes após 7 dias, espere até 10 dias antes de emplacá-las. Após 10 dias, as células não proliferam mais, e a eficiência de reprogramação diminui.

5. Semeadura de astrócitos para reprogramação

NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas sob um gabinete de segurança biológica com nível de segurança 1 (SL1).

  1. Prepare placas de 24 poços com tampas de vidro revestidas de poli-D-lisina da mesma forma que os frascos de cultura foram preparados anteriormente. Para determinar o número de placas necessárias, considere que os astrócitos são banhados a uma densidade de 5-5,5 x 104 células por poço em uma placa de 24 poços. Normalmente, isolar seis medulas espinhais de camundongos P2 produz em torno de 1 x 106 células.
  2. Aspirar mídia dos frascos da cultura T25 contendo os astrócitos cultivados e lavar uma vez com 1x PBS. Retire os astrócitos do frasco de cultura adicionando 0,5 mL de 0,05% Trypsin/EDTA e incubar a 37 °C por 5 min. Toque suavemente na lateral do frasco para liberar células da superfície do frasco de cultura e verifique o desprendimento sob um microscópio de campo brilhante usando uma ampliação de 10X.
  3. Pare a trippsinização com 2,5 mL de cultura astrócito média e colete suspensão celular em tubos de 15 mL. Centrifugar a 300 x g por 5 min, aspirar supernasce, e células resuspend em 1 mL de meio de cultura de astrócito. Calcule a concentração celular usando um hemoocítômetro ou um sistema automatizado de contagem de células.
  4. Com base no número de células, diluir a suspensão celular com meio de astrócito fresco para obter uma solução de 1-1,1 x 105 células por mL. Suplementar o meio com EGF e bFGF a 10 ng/mL por fator. Adicione 500 μL de suspensão celular, equivalente a 5-5,5 x 104 células, a cada poço das placas de 24 poços previamente preparadas e células de cultura a 37 °C e 5% de CO2.

6. Expressão forçada de fatores de transcrição

NOTA: Antes de prosseguir com o protocolo, é essencial projetar adequadamente o experimento. Em particular, é importante sempre incluir um controle negativo para a reprogramação, ou seja, uma condição em que nenhum fator de reprogramação é expresso. Por exemplo, ao usar vetores que carregam o cDNA para o fator de reprogramação e um repórter (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), DsRed), o controle negativo é representado pelo mesmo vetor que carrega apenas o repórter. Ao expressar múltiplos fatores que carregam diferentes repórteres, o controle negativo deve ser ajustado em conformidade.

  1. No dia seguinte ao revestimento, inspecione as placas de 24 poços para garantir que as células tenham aderido às tampas.
  2. Com base no objetivo experimental e nos recursos disponíveis, a expressão forçada de fatores de reprogramação pode ser alcançada por transdução viral (ver passo 6.3) ou transfecção de DNA (ver passo 6.4).
    NOTA: O uso de retrovírus ou lentivírus requer a aprovação das autoridades governamentais e deve ser realizado sob um gabinete de segurança biológica dentro de um laboratório com nível de segurança 2 (SL2).
  3. Reprograme os astrócitos transduzindo as células com o retrovírus ou lentivírus carregando as informações genéticas para expressar o fator de reprogramação de interesse conforme descrito abaixo.
    1. Transdutor células com um alto titulante do vírus de 1 x 1010-1 x 1012 partículas/mL adicionando 1 μL da suspensão celular diretamente ao meio de astrócito. Isso garante uma alta taxa de infecção. Cultue as células com o meio astrócito contendo partículas virais a 37 °C por 24-36 h antes de prosseguir com a seção 7 ou seção 8, dependendo da finalidade do experimento.
      NOTA: Diferentes promotores podem ser usados para impulsionar a expressão dos transgenes (ver também Resultados Representativos). Promotores constitutivos (por exemplo, CMV, CAG) induzem a expressão do transgene mais cedo do que os promotores indutíveis; no entanto, ambos os tipos de promotores têm sido usados com sucesso para reprogramar células em neurônios.
  4. Plasmídeos de DNA também podem ser introduzidos em astrócitos através de transfecção de DNA como descrito abaixo.
    NOTA: Isso pode ser feito sob um gabinete de segurança biológica aprovado para SL1.
    1. Antes da transfecção, obtenha o reagente de transfecção, um DNA plasmídeo dos construtos desejados, meio astrócito fresco e meio reduzido por soro (ver Tabela de Materiais). Calcule a quantidade necessária de meio reduzido por soro (ver Tabela de Materiais) considerando que cada poço de uma placa de 24 poços requer 300 μL de meio reduzido por soro. Adicione a quantidade apropriada de meio reduzido de soro a um tubo de 50 mL e aqueça-o a 37 °C.
    2. Quando o meio de soro reduzido estiver quente, aspire meio astrócito de todos os poços e colete-o em um tubo de 50 mL. Filtre o meio astrócito coletado com um filtro de seringa de 0,45 μM para remover células separadas.
    3. Adicione um volume igual de meio de astrócito fresco ao meio filtrado para obter uma solução suficiente para adicionar 1 mL de meio de astrócito por poço. Mantenha o meio condicionado ao astrócito na incubadora a 37 °C até o uso (etapa 6.4.9).
      NOTA: O meio de cultura é reutilizado, pois contém vários fatores secretados que suportam a viabilidade da cultura.
    4. Adicione 300 μL de meio pré-aquecido reduzido de soro para cada poço e coloque a placa de 24 poços de volta à incubadora.
    5. Prepare a solução A, consistindo em DNA e meio reduzido por soro. Para cada poço, use um total de 0,6 μg de DNA e adicione-o a 50 μL de meio reduzido por soro. Armazene a solução A à temperatura ambiente até o uso.
      NOTA: Normalmente, considera-se um triplicado técnico por condição. Portanto, é preparado um mix suficiente para a reação de 3,5 (por exemplo, 2,1 μg de DNA total diluído em 175 μL de meio reduzido por soro) para garantir material suficiente para transfectar três poços de uma placa de 24 poços.
    6. Preparar a solução B, composta pelo reagente de transfecção e meio reduzido por soro. Para cada poço, adicione 0,75 μL de reagente de transfecção a 50 μL de meio reduzido por soro. Como esta solução é comum a todas as condições de transfecção, prepare-a a granel para reduzir a variabilidade entre as transfecções.
    7. Incubar a solução B em temperatura ambiente por 5 minutos. Adicione a solução B à solução Uma gota a gota a uma proporção de 1:1 e misture suavemente. Não vórtice. Incubar a solução A+B por 20-30 min em temperatura ambiente sob o capô.
    8. Repita o passo 6.4.5-6.4.7 para todas as condições de transfecção. Depois de 20-30 min, adicione a solução A+B a cada poço gota a gota para um volume final de 100 μL. Agite suavemente a placa e coloque as células de volta na incubadora a 37 °C por 4h.
    9. Após 4h, retire o meio de transfecção e adicione 1 mL do meio condicionado pré-aquecido preparado na etapa 6.4.3. Mantenha as células por 36-48 h antes de prosseguir com a seção 7 ou seção 8, dependendo da finalidade do experimento.

7. Reprogramação de astrócitos (7 dias de análise)

  1. Prepare o meio de diferenciação neuronal adicionando 1 mL de suplemento B27 a 49 mL de meio de cultura básica (ver passo 1.4). Após 24-48 h, dependendo se as células foram transduzidas ou transfectadas (ver etapas 6.3 e 6.4, respectivamente), substituir o meio astrócito por 1 mL de meio de diferenciação neuronal por poço e células de cultura a 37 °C e 9% de CO2.
    NOTA: As células também podem ser mantidas a 5% de CO2 se não houver incubadora de CO2 de 9%. No entanto, a reprogramação neuronal é mais eficiente nessas condições.
  2. Opcional: Para aumentar a eficiência de reprogramação, suplementar o meio de diferenciação neuronal com Forskolin (concentração final de 30 μM) e Dorsomorphin (concentração final de 1 μM) ao substituir o meio de astrócito para o meio de diferenciação. Ao optar por tratar células com Forskolin e Dorsomorphin, forneça uma segunda dose de Dorsomorphin 2 dias após o tratamento inicial. Adicione este segundo tratamento diretamente ao meio da cultura.
  3. A reprogramação direta de astrócitos murinos em células neuronais normalmente ocorre dentro de 7 dias após a mudança do meio. Assim, 7 dias após o início da reprogramação neuronal, fixar ou coletar células para análise a jusante.

8. Reprogramação de astrócitos em neurônios maduros (culturas de longo prazo)

  1. Prepare o meio de diferenciação neuronal adicionando 1 mL de suplemento B27 a 49 mL de meio de cultura básica (ver passo 1.4). Depois das 24-48 h, dependendo se as células foram transduzidas ou transfeinadas (ver etapas 6.3 e 6.4, respectivamente), substituir o meio astrócito por 1 mL de diferenciação neuronal complementada com Forskolin (concentração final de 30 μM) e Dorsomorphin (concentração final de 1 μM) por bem e células de cultura a 37 °C e 9% CO2.
    NOTA: As células também podem ser mantidas a 5% de CO2 se não houver incubadora de CO2 de 9%. No entanto, a reprogramação neuronal é mais eficiente nessas condições.
  2. Repita o tratamento de Dorsomorphin 2 dias após o tratamento inicial adicionando-o diretamente ao meio de diferenciação neuronal.
  3. Após 7 dias do início da reprogramação neuronal, prepare o meio de maturação adicionando 6 μL de N2, 1,2 μL de NT3 (estoque 20 μg/mL), 1,2 μL de BDNF (estoque 20 μg/mL), 1,2 μL de GDNF (estoque de 20 μg/mL) e 1,2 μL de cAMP (estoque de 100 mM) a 189,2 μL de meio de diferenciação neuronal. Suplemento de diferenciação neuronal médio presente em cada poço com 200 μL de meio de maturação.
    NOTA: O meio de maturação é suplementado apenas para o primeiro tratamento. Todos os tratamentos subsequentes são feitos substituindo parcialmente o meio de diferenciação neuronal conforme descrito abaixo.
  4. Repita o tratamento com pequenas moléculas removendo 200 μL de meio de diferenciação neuronal e adicionando 200 μL de maturação fresca média duas vezes por semana por até 6 semanas. Durante a maturação, use células para experimentos eletrofisiológicos (tipicamente, no dia 21 ou posterior) ou fixação para análise a jusante (por exemplo, imunofluorescência).

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Resultados

As culturas primárias dos astrócitos normalmente atingem 80%-90% de confluência entre 7 e 10 dias após a classificação e o revestimento mac (Figura 1B). Geralmente, um único frasco de cultura T25 produz em torno de 1-1,5 x 106 células, o que é suficiente para 20-30 tampas quando as células de semeadura a uma densidade de 5-5,5 x 104 células por poço. No dia seguinte ao revestimento, as células normalmente cobrem 50%-60% da superfície de deslizamento de cobertura (

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Discussão

Culturas primárias de astrócitos murinos são um notável sistema de modelo in vitro para estudar a reprogramação neuronal direta. De fato, apesar de estarem isoladas em um estágio pós-natal, as células expressam marcadores astrócitos típicos29, retêm a expressão de genes padronizados28,29 e mantêm a capacidade de proliferação, semelhante aos astrócitos in vivo aos38 anos. Após o isolamento mediado p...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Ines Mühlhahn pela clonagem das construções para reprogramação, Paulina Chlebik pela produção viral, e Magdalena Götz e Judith Fischer-Sternjak pelos comentários sobre o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% Tripsina / EDTALife Technologies25300054
4 ', 6-Diamidino-2-fenindol, dilactato (DAPI)Sigma-AldrichD9564
anti-mouse IgG1 Alexa 647Thermo FisherA21240
anti-mouse IgG1 BiotinaSouthernbiotechCat # 1070-08; RRID: AB_2794413
anti-mouse IgG2b Alexa 488Thermo FisherA21121
anti-coelho Alexa 546Thermo FisherA11010
Aqua Poly/MountPolysciencesCat# 18606-20
B27 SuplementoLife Technologies17504044
BDNFPeprotech450-02
bFGFLife Technologies13256029
Albumina de Soro Bovino (BSA)Sigma-AldrichCat# A9418
cAMPSigma AldrichD0260
C-TubesMiltenyi Biotec130-093-237
DMEM/F12Life Technologies21331020
DorsomorphinSigma AldrichP5499
EGFLife TechnologiesPHG0311
Soro Fetal BovinoPAN BiotechP30-3302
ForskolinSigma AldrichF6886
GDNFPeprotech450-10
gentleMACS Octo DissociatorMiltenyi Biotec130-096-427
GFAPDakoCat# Z0334; RRID: AB_100013482
GlicoseSigma AldrichG8769
GlutaMaxLife Technologies35050038
HBSSLife Technologies14025050
HepesLife Technologies15630056
Lipofectamine 2000 (Reagente de transfecção)Thermo FisherCat# 11668019
MACS SmartStrainer 70µ mMiltenyi Biotec130-098-462
MiniMACS SeperatorMiltenyi Biotec130-042-102
Kit de MicroBeat anti-ACSA-2 para mouse Miltenyi Biotec130-097-678
Mouse IgG1 anti-Sinaptofisina 1Sistemas SinápticosCat# 101 011 RRID:AB_887824)
Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (β III-tub)Sigma AldrichT8660
MS colunasMiltenyi Biotec130-042-201
N2 SuplementoLife Technologies17502048
Kit de Dissociação de Tecido Neural Miltenyi Biotec130-092-628
NT3Peprotech450-03
octoMACS SeparadorMiltenyi Biotec130-042-109
OptiMEM • ndash; GlutaMAX (meio com soro-reduzido)Thermo FisherCat# 51985-026
Penicilina/EstreptomicinaLife Technologies15140122
Poli-D-LisinaSigma AldrichP1149
Coelho anti-RFPRocklandCat# 600-401-379; RRID: AB_2209751
Coelho anti-Sox9Sigma-AldrichCat # AB5535; RRID:AB_2239761
Streptavidin Alexa 405Thermo FisherCat# S32351
Triton X-100Sigma-AldrichCat# T9284

Referências

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  2. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
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