Isolamento e Reprogramação Neuronal Direta de Astrócitos de Camundongos

Bob A. Hersbach; Tatiana Simon; Giacomo Masserdotti

doi:10.3791/64175

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Artigo de método

Isolamento e Reprogramação Neuronal Direta de Astrócitos de Camundongos

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DOI:

10.3791/64175

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7 de julho de 2022

Bob A. Hersbach¹^,²^,³ , Tatiana Simon² , Giacomo Masserdotti¹^,²

¹Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, ²Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, ³Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para gerar culturas altamente enriquecidas de astrócitos derivados de diferentes regiões do sistema nervoso central de camundongos pós-natais e sua conversão direta em neurônios funcionais pela expressão forçada de fatores de transcrição.

Resumo

A reprogramação neuronal direta é uma abordagem poderosa para gerar neurônios funcionais de diferentes populações de células iniciantes sem passar por intermediários multipotentes. Essa técnica não só mantém grandes promessas no campo da modelagem da doença, como permite converter, por exemplo, fibroblastos para pacientes que sofrem de doenças neurodegenerativas em neurônios, mas também representa uma alternativa promissora para terapias de substituição baseadas em células. Nesse contexto, um grande avanço científico foi a demonstração de que células não neurais diferenciadas dentro do sistema nervoso central, como os astrócitos, poderiam ser convertidas em neurônios funcionais in vitro. Desde então, a reprogramação direta in vitro de astrócitos em neurônios forneceu insights substanciais sobre os mecanismos moleculares subjacentes à conversão de identidade forçada e os obstáculos que impedem a reprogramação eficiente. No entanto, os resultados de experimentos in vitro realizados em diferentes laboratórios são difíceis de comparar devido a diferenças nos métodos utilizados para isolar, cultura e reprogramar astrócitos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolar e cultivar astrócitos com alta pureza de diferentes regiões do sistema nervoso central de camundongos em idades pós-natal através da triagem de células magnéticas. Além disso, fornecemos protocolos para reprogramar astrócitos cultivados em neurônios via transdução viral ou transfecção de DNA. Este protocolo simplificado e padronizado pode ser usado para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à manutenção da identidade celular, o estabelecimento de uma nova identidade neuronal, bem como a geração de subtipos neuronais específicos e suas propriedades funcionais.

Introdução

O sistema nervoso central dos mamíferos (SNC) é altamente complexo, consistindo de centenas de tipos de células diferentes, incluindo um grande número de diferentes subtipos neuronais 1,2,3,4,5,6. Ao contrário de outros órgãos ou tecidos ^7,8,9, o CNS mamífero tem uma capacidade regenerativa muito limitada; a perda neuronal após lesão cerebral traumática ou neurodegeneração é irrev....