Um protocolo para quantificação citométrica de fluxo fluorescente de células cancerígenas senescentes induzidas por drogas quimioterápicas em cultura de células ou em modelos de tumores murinos é apresentado. Os procedimentos opcionais incluem co-imunocoloração, fixação de amostras para facilitar a análise de grandes lotes ou pontos de tempo e o enriquecimento de células senescentes viáveis por classificação citométrica de fluxo.
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Artigo de método
Sonda de β-Galactosidase Associada à Senescência Fluorescente Vermelha Distante para Identificação e Enriquecimento de Células Tumorais Senescentes por Citometria de Fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A senescência celular é um estado de parada proliferativa induzido por danos biológicos que normalmente se acumula ao longo de anos em células envelhecidas, mas também pode surgir rapidamente em células tumorais como resposta a danos induzidos por vários tratamentos contra o câncer. A senescência das células tumorais é geralmente considerada indesejável, pois as células senescentes tornam-se resistentes à morte e bloqueiam a remissão do tumor, exacerbando a malignidade do tumor e a resistência ao tratamento. Portanto, a identificação de células tumorais senescentes é de interesse contínuo para a comunidade de pesquisa do câncer. Existem vários ensaios de senescência, muitos baseados na atividade do conhecido marcador de senescência, a beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal).
Normalmente, o ensaio SA-β-Gal é realizado usando um substrato cromogênico (X-Gal) em células fixas, com a enumeração lenta e subjetiva de células senescentes "azuis" por microscopia de luz. Ensaios aprimorados usando substratos SA-β-Gal fluorescentes e permeantes a células, incluindo C12-FDG (verde) e DDAO-Galactoside (DDAOG; vermelho-distante), permitiram a análise de células vivas e permitiram o uso de plataformas de análise fluorescente de alto rendimento, incluindo citômetros de fluxo. C12-FDG é uma sonda bem documentada para SA-β-Gal, mas sua emissão fluorescente verde se sobrepõe à autofluorescência celular intrínseca (FA) que surge durante a senescência devido ao acúmulo de agregados de lipofuscina. Ao utilizar a sonda SA-β-Gal DDAOG de vermelho distante, a autofluorescência celular verde pode ser usada como um parâmetro secundário para confirmar a senescência, adicionando confiabilidade ao ensaio. Os canais de fluorescência restantes podem ser usados para coloração de viabilidade celular ou imunomarcação fluorescente opcional.
Usando citometria de fluxo, demonstramos o uso de DDAOG e autofluorescência de lipofuscina como um ensaio de duplo parâmetro para a identificação de células tumorais senescentes. A quantificação da porcentagem de células senescentes viáveis é realizada. Se desejado, uma etapa opcional de imunomarcação pode ser incluída para avaliar antígenos de superfície celular de interesse. As células senescentes identificadas também podem ser classificadas citometricamente e coletadas para análise a jusante. As células senescentes coletadas podem ser imediatamente lisadas (por exemplo, para imunoensaios ou análise ômica) ou cultivadas posteriormente.
Introdução
As células senescentes normalmente se acumulam em organismos ao longo de anos durante o envelhecimento biológico normal, mas também podem se desenvolver rapidamente em células tumorais como resposta a danos induzidos por vários tratamentos contra o câncer, incluindo radiação e quimioterapia. Embora não proliferem mais, as células tumorais senescentes induzidas pela terapia (TIS) podem contribuir para a resistência ao tratamento e impulsionar a recorrência 1,2,3. Fatores secretados pelas células TIS podem exacerbar a malignidade tumoral, promovendo evasão imune ou metástase
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Protocolo
Todo o trabalho com animais descrito foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago.
1. Preparação e armazenagem de soluções-mãe
NOTA: Se as células forem classificadas por fluxo, todas as soluções devem ser preparadas usando técnicas estéreis e filtradas através de um dispositivo de filtro de 0,22 μm.
- Preparar uma solução-mãe de DDAO-Galactoside a 5 mg/ml em DMSO. Alíquota a 50 μL por tubo (ou volume desejado). Conservar a -20 °C no escuro até 1 ano.
- Preparar uma solução-mãe de Bafilomicina A1 a 1 mM em DMSO. Alíquota a 50 μL po....
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Resultados
Vários experimentos foram realizados para demonstrar a comparabilidade do DDAOG com X-Gal e C12-FDG para a detecção de senescência por SA-β-Gal. Primeiramente, o X-Gal foi utilizado para corar células senescentes de melanoma B16-F10 induzidas por ETO (Figura 2A). Uma cor azul intensa se desenvolveu em um subconjunto de células tratadas com ETO, enquanto outras células exibiram coloração azul menos intensa. A morfologia foi aumentada na maioria das células tratadas com ETO. A color.......
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Discussão
Na última década, a citometria de fluxo tornou-se uma plataforma de ensaio mais comum na pesquisa do câncer devido à popularidade emergente da imunologia tumoral, ao desenvolvimento de citômetros de fluxo de baixo custo e à melhoria das instalações de instrumentação compartilhadas em instituições acadêmicas. Ensaios multicoloridos são agora padrão, já que a maioria dos instrumentos mais recentes são equipados com matrizes ópticas violeta, azul-verde e vermelho a vermelho-distante. Assim, é provável que este protocolo DDA.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar para este estudo.
Agradecimentos
Agradecemos ao Cytometry and Antibody Core Facility da Universidade de Chicago pelo apoio na instrumentação da citometria de fluxo. O Centro de Pesquisa Animal da Universidade de Chicago forneceu alojamento para animais.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bafilomicina A1 | Research Products International | B40500 | |
| Sulfato de bleomicina | Cayman | 13877 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | US Biological | A1380 | |
| Calcein Violet 450 AM corante de viabilidade | ThermoFisher Scientific | 65-0854-39 | eBioscience |
| DPP4 anticorpo, conjugado PE | Biolegend | 137803 | Clone H194-112 |
| Linha celular: A549 adenocarcinoma de pulmão humano | American Type Culture Collection | CCL-185 | |
| Linha celular: B16-F10 melanoma de camundongo | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| Raspador de células | Corning | 3008 | |
| Filtros de células, 100 µ m | Falcon | 352360 | |
| DDAO-Galactoside | Life Technologies | D6488 | |
| DMEM meio 1x | Life Technologies | 11960-069 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| DNAse I | Sigma | DN25 | |
| Doxorrubicina, injeção de cloridrato (USP) | Pfizer | NDC 0069-3032-20 | |
| Doxorrubicina, PEGilado lipossomal (USP) | Sun Pharmaceutical | NDC 47335-049-40 | |
| EDTA 0.5 M | Life Technologies | 15575-038 | |
| Etoposídeo | Cayman | 12092 | |
| FBS | Omega | Reagente bloqueador do receptor FB-11 | |
| Fc | Biolegend | 101320 | Anti-mouse CD16/32 |
| Citômetro de fluxo (analisador de células) | Becton Dickinson (BD) | Vários | LSRFortessa |
| Citômetro de fluxo (classificador de células) | Becton Dickinson (BD) | Vários | FACSAria |
| GlutaMax 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES 1 M | Lonza | BW17737 | |
| Liberase TL | Sigma | 5401020001 | Roche |
| Paraformaldeído 16% | Microscopia Eletrônica Ciências | 15710 | |
| Penicilina/Estreptomicina 100x | Life Technologies | 15140122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x | Corning | MT21031CV | PBS de Dulbecco (sem cálcio e magnésio) |
| Partículas de calibração de arco-íris, kit ultra | SpheroTech | UCRP-38-2K | 3.5-3.9 µ m, 2E6/mL |
| RPMI-1640 meio 1x | Life Technologies | 11875-119 | |
| Cloreto de sódio 0,9% (USP) | Baxter Healthcare Corporation | 2B1324 | |
| Software para aquisição de dados de citômetros, "FACSDiva" | Becton Dickinson (BD) | n/a | Entre em contato com a BD para obter licença |
| Software para análise de dados de citômetros, "FlowJo" | TreeStar | n/a | Entre em contato com a TreeStar para obter a licença |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-114 |
Referências
- Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
- Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: fri....
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Reimpressões e permissões
