Artigo de método

Estudo das Funções e Atividades do Co-Transportador Neuronal K-Cl KCC2 Usando Western Blotting

DOI:

10.3791/64179

⸱

9 de dezembro de 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo destaca a aplicação da técnica de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K-Cl KCC2. O protocolo descreve a investigação da fosforilação de KCC2 em sítios reguladores de quinase Thr906/1007 via western blotting. Além disso, métodos adicionais para confirmar a atividade do KCC2 são brevemente destacados neste texto.

Resumo

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Os cotransportadores de cloreto de potássio 2 (KCC2) são um membro da família de transportadores de solutos 12 (SLC12) dos cotransportadores de cloreto de catião (CCCs), encontrados exclusivamente no neurônio e são essenciais para o bom funcionamento da Cl-homeostase e, consequentemente, da inibição funcional do GABAérgico. A falha na regulação adequada da KCC2 é deletéria e tem sido associada à prevalência de várias doenças neurológicas, incluindo epilepsia. Houve avanços consideráveis no que diz respeito à compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, credenciados ao desenvolvimento de técnicas que permitam aos pesquisadores estudar suas funções e atividades; por meio de investigações diretas (avaliando a fosforilação dos sítios reguladores da quinase) ou indiretas (observando e monitorando a atividade do GABA). Aqui, o protocolo destaca como investigar a fosforilação de KCC2 em locais reguladores de quinase - Thr906 e Thr1007 - usando a técnica de western blotting. Existem outros métodos clássicos usados para medir diretamente a atividade do KCC2, como o ensaio de absorção de íons rubídio e íons tálio. Outras técnicas, como patch-clamp-electrophysiology são usadas para medir a atividade GABA; portanto, refletindo indiretamente KCC2 ativado e/ou inativado, conforme informado pela avaliação da homeostase intracelular de íons cloreto. Algumas dessas técnicas adicionais serão brevemente discutidas neste manuscrito.

Introdução

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Os cotransportadores de cloreto de potássio 2 (KCC2) são membros da família de transportadores de solutos 12 (SLC12) dos cotransportadores de cloreto de cátions (CCCs), encontrados exclusivamente no neurônio e são essenciais para o bom funcionamento da Cl-homeostase e, consequentemente, para a inibição funcional do GABAérgico 1,2,3,4. A manutenção da baixa concentração intraneuronal de Cl- ([Cl-]i) a 4-6 mM pelo KCC2 facilita a hiperpolarização do ácido γ-aminobutírico (GABA)/glicina e a inibição sináptica no cérebro e na medula espinhal5. A falha na regulação adequada da KCC2 tem sido associada à prevalência de várias doenças neurológicas, incluindo a epilepsia4. Além disso, a diminuição da extrusão de Cl− mediada por KCC2 e as correntes hiperpolarizantes hiperpolarizantes GABAA e/ou mediadas pelo receptor de glicina têm sido implicadas na epilepsia, dor neuropática e espasticidade 6,7. O KCC2 neuronal é modulado negativamente via fosforilação de resíduos reguladores chave dentro de seu domínio intracelular C-terminal pelo complexode sinalização 1 da quinase com não-lisina (WNK)-STE20/SPS1-related proline/alanine-rich (SPAK)/Oxidative stress-responsive (OSR), o que facilita a manutenção da atividade despolarizada do GABA em neurônios imaturos 2,8,9 . O WNK-SPAK/OSR1 fosforila os resíduos de treonina 906 e 1007 (Thr906/Thr1007) e, posteriormente, regula negativamente a expressão gênica de RNAm do KCC2, levando a uma consequente deterioração de sua função fisiológica 8,10. Mais importante, no entanto, já é um fato que o complexo quinase WNK-SPAK/OSR1 é conhecido por fosforilar e inibir a expressão de KCC2 1,2,4,11,12, e que a inibição das vias de sinalização do complexo quinase para o fosforilato Thr906/Thr1007 tem sido associada ao aumento da expressão do gene mRNA KCC2 13,14,15 . É importante ressaltar que a regulação da expressão neuronal de KCC2 e Na+-K+-2Cl-cotransportadores 1 (NKCC1) via fosforilação proteica funciona concomitantemente e em padrões inversos 1,4,16.

Houve avanços consistentes e consideráveis no que diz respeito à compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do KCC2, credenciados ao desenvolvimento de técnicas que permitam aos pesquisadores estudar suas funções e atividades; por meio de investigações diretas (avaliando a fosforilação dos sítios reguladores da quinase) ou indiretas (observando e monitorando a atividade do GABA). O protocolo aqui apresentado destaca a aplicação de técnicas de western blotting para estudar as funções e atividades do co-transportador neuronal K+-Cl- KCC2, investigando a fosforilação do cotransportador em sítios reguladores de quinase Thr906/1007.

Western blot é um método usado para detectar proteínas específicas de interesse de uma amostra de tecido ou célula. Este método primeiro separa as proteínas por tamanho através de eletroforese. As proteínas são então transferidas eletroforeticamente para um suporte sólido (geralmente uma membrana) antes que a proteína-alvo seja marcada usando um anticorpo específico. Os anticorpos são conjugados a diferentes tags ou anticorpos conjugados com fluoróforos que são detectados usando métodos colorimétricos, quimioluminescência ou fluorescência. Isso permite que uma proteína-alvo específica seja detectada a partir de uma mistura de proteínas. Essa técnica tem sido utilizada para caracterizar sítios fosfoespecíficos de KCCs1 e tem sido utilizada para identificar inibidores de quinase que inibem a fosforilação de KCC3 Thr991/Thr104817. Seguindo este protocolo, pode-se detectar especificamente KCC2 total e fosforilado a partir de lisatos celulares / teciduais. Em princípio, a detecção de anticorpos conjugados com proteínas por esta técnica é altamente instrumental, pois ajuda a melhorar a compreensão das atividades cooperativas nos fosfo-locais do KCC2, o que lança luz sobre os mecanismos moleculares envolvidos em suas regulações fisiológicas. A análise quantitativa da expressão proteica total é representativa da função e atividade do KCC2. Existem outros métodos clássicos usados para medir diretamente a atividade do KCC2, como o ensaio de absorção de íons rubídio e íons tálio. Outras técnicas, como patch-clamp-electrophysiology são usadas para medir a atividade GABA; portanto, refletindo indiretamente KCC2 ativado e/ou inativado, conforme informado pela avaliação da homeostase intracelular de íons cloreto.

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Protocolo

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NOTA: O protocolo descreve o método de western blotting para detectar proteínas específicas de interesse.

1. Cultura celular e transfecção

  1. Aquecer todos os reagentes no banho de grânulos (37 °C) antes do procedimento de cultura celular. Preparar o meio de cultura, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% cada de 2mM de L-glutamina, 100x aminoácido não essencial, piruvato de sódio 100 mM e 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina.
  2. Descongelar as células 293 do rim embrionário humano do rato KCC2b transfectado de forma estável (HEK293 rnKCC2b)18 completamente no banho de grânulos (37 °C). Transfira as células do tubo criovial para um tubo de centrífuga contendo 5 mL de meio fresco. Gire a célula a 1200 ×g por 3-5 min.
  3. Use uma pipeta aspiradora (fixada a uma bomba de vácuo) para aspirar o sobrenadante e adicione 10 mL de meio fresco para ressuspender as células. Transfira a suspensão da célula para uma placa de prato de 10 cm.
  4. Coloque o prato na incubadora e deixe-o crescer por 48 h a 37 ° С em uma atmosfera umidificada a 5% de CO2 . Monitore o período de incubação para garantir o crescimento celular saudável. Dividimos ainda mais as células quando elas atingiram mais de 90% de confluência após o período de incubação.
  5. Aspirar o meio antigo para fora do prato de células e enxaguar suavemente as células com 2 mL de solução salina tampão fosfato (PBS). Adicione 2 mL de tripsina e incube por cerca de 1-2 min à temperatura ambiente.
  6. Use 2 mL de meio completo para lavar suavemente as células tripsinizadas no prato. Adicione 9 mL de mídia fresca a novos pratos e adicione 1 mL de solução do prato antigo a cada um dos novos. Transfira os pratos de células divididas de volta para a incubadora por 48 h para atingir ≥ de 90% de confluência.
  7. Trate as células com dimetilsulfóxido (DMSO) como controle, estaurosporina 8 μM ou N-etilmaleimida (NEM) 0,5 mM por 15 minutos antes de colher as células em tampão de lise.

2. Preparação de lisados celulares e carregamento de amostras

  1. Aspirar a mídia no prato de cultura (a partir de procedimentos de transfecção). Coloque a cultura celular no gelo e lave as células com PBS gelado.
  2. Aspirar o PBS e, em seguida, adicionar 1,0 ml de tampão de lise gelado contendo 50 mM de ácido tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de etilenoglicol-bis(éter β-aminoetílico)-N,N,N,N′,N′-tetraacético (EGTA), 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 50 mM de fluoreto de sódio, 5 mM de pirofosfato de sódio, 10 mM de sódio-β-glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sódio, 1% (p/v) de Tritão X-100, 0,27 M de sacarose, 1 mM de benzamina, 0,1% (v/v) de 2-mercaptoetanol e 2 mM de fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) para o prato.
    NOTA: O volume de tampão de lise durante a colheita celular varia com o tamanho do prato, por exemplo, 1 mL de tampão de lise é adequado por 1 x 107 células/prato de 100 mm/frasco de 150 cm 2, enquanto 0,5 mL é adequado por frasco de 5 x 106 células/60 mm/balão de 75 cm2.
  3. Use um raspador de células de plástico frio para raspar as células do fundo do prato e, em seguida, use suavemente uma pipeta para transferir a suspensão da célula para um tubo de microcentrífuga já no gelo. Agite constantemente o tubo durante 30 minutos a 4 °C.
  4. Gire a célula lisada em uma centrífuga fria (4 °C) a 16.000 x g por 20 min, remova o tubo suavemente da centrífuga e coloque-o no gelo. Recolha o sobrenadante num tubo fresco pré-arrefecido e descarte o pellet.
    NOTA: Pode ser necessário variar a força de centrifugação e o tempo, dependendo do tipo de célula. No entanto, as diretrizes gerais incentivam a centrifugação a 16.000 x g por 20 min. No entanto, isso deve ser determinado para cada experimento. Por exemplo, células delicadas como leucócitos precisam de uma velocidade de centrifugação muito leve.

3. Preparação de imunoprecipitantes a partir de lisados celulares

  1. Pipetar 300 μL de proteína-G-sefarose para um tubo de microcentrífuga. Gire a solução a 500 x g durante 2 min e elimine o sobrenadante.
  2. Adicione 500 μL de PBS e vortex a solução bem. Gire a solução a 500 x g durante 2 min e elimine o sobrenadante. Repita esta etapa.
  3. Misture 1 mg de anticorpos anti-KCC2 Thr906 e anti-KCC2 Thr1007 com 200 μL de esferas de proteína G-sefarose e compense o volume até 500 μL com PBS. Agitar sobre uma plataforma vibratória ou roda rotativa durante 2 h a 4 °C. Lave 2x com PBS.
  4. Realizar a quantificação de proteínas em todos os lisados celulares e adicionar 1 mg do lisado celular às contas lavadas. Incubar suavemente num rotador de ponta a ponta durante 2 h a 4 °C. Gire as contas e lave-as 3x com PBS contendo cloreto de sódio (NaCl) a 150 mM.
  5. Lavar os imunoprecipitantes (miçangas) 3x com 200 μL de PBS. Ressuscite o pellet final em 100 μL de 1x tampão de amostra de dodecil sulfato de lítio (LDS).
  6. Agitar os tubos num agitador de rotor à temperatura ambiente durante 5 minutos e incubá-los num bloco de aquecimento a 75 °C durante 10 minutos. Centrifugar a amostra de carga a 11.000 x g durante 2 min e utilizar o sobrenadante para o carregamento do gel.

4. Realizando o western blot

  1. Montar o aparelho de fundição e deitar o gel de separação a 8% preparado na hora (ver Tabela 1 para a receita/preparação) para fundir o gel que permita cerca de 2 cm de espaço a partir da parte superior do vidro de fundição. Adicione 200 μL de isopropanol absoluto à configuração e deixe-a repousar à temperatura ambiente durante 60 minutos.
    NOTA: A receita em gel de poliacrilamida para eletroforese em gel de dodecilamida sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) depende do tamanho da proteína de interesse (Tabela 2). Portanto, anote o tamanho da proteína antes de determinar a porcentagem de gel desejada.
  2. Use uma pipeta para remover o isopropanol e lave cuidadosamente o gel com cerca de 200 μL de água destilada. Adicionar gel de empilhamento a 6% preparado na hora (ver Tabela 1 para receita/preparação) para preencher o espaço de aproximadamente 2 cm na configuração de fundição. Encaixe suavemente no pente do poço e deixe repousar à temperatura ambiente durante 30 minutos.
  3. Fixe o gel fundido no tanque de eletroforese.
  4. Dissolva 30,3 g de base Tris, 144,1 g de glicina e 10 g de SDS em 1000 mL de água destilada para preparar 10x tampão de transferência. Prepare 1x tampão de corrida adicionando 10 mL de SDS de 10% e 100 mL de tampão de transferência de 10x a 890 mL de água destilada.
  5. Despeje 1x buffer de corrida no tanque. Carregar 5 μL de marcador de peso molecular no primeiro poço e uma quantidade igual de proteína em cada poço do gel SDS-PAGE (entre 18-30 μL, dependendo do tamanho do pente utilizado). Encha os poços vazios com 1x LDS e execute o gel por cerca de 90-120 min a 120 V.
  6. Dissolver 58,2 g de base Tris e 29,3 g de glicina em 1000 mL de água destilada para preparar 10x tampão de transferência. Ative a membrana de nitrocelulose com 1x tampão de transferência contendo 20% de metanol. Lave o gel e a membrana com o tampão de transferência e espalhe-os suavemente na pilha de preparação.
    NOTA: Não há necessidade de ajustar o pH dos tampões de corrida e transferência, pois eles devem estar no pH ideal necessário. Além disso, é aconselhável preparar esses buffers e armazená-los à temperatura ambiente antes do experimento para economizar tempo.
  7. Organize o sanduíche a ser transferido nesta ordem: eletrodo negativo (moldura preta / extremidade) - espuma de sanduíche - papel de filtro - gel SDS-PAGE enxaguado - membrana de nitrocelulose enxaguada - papel de filtro - espuma de sanduíche - eletrodo positivo (quadro vermelho). Empilhe o sanduíche montado no tanque de transferência e corra a 90 V por 90 min ou 30 V por 360 min.

5. Coloração de anticorpos e desenvolvimento de imagem

  1. Retire a membrana e deixe secar. Bloqueie a membrana por 1 h à temperatura ambiente usando um tampão de bloqueio feito de 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. Incubar as membranas com diluições adequadas do anticorpo primário 8,15,19 e da beta-actina (controlo de carga) em tampão de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Lave a membrana em três lavagens de 1x TBS-T por 5 min cada.
    NOTA: A incubação da membrana separada com controles de carga, como beta-actina, alfa-tubulina ou anticorpos gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase é para normalizar os outros resultados de western blotting durante a quantificação subsequente. A diluição recomendada para cada anticorpo primário está disponível no manual do fabricante.
  3. Incubar a membrana lavada com anticorpo secundário diluído 5000 vezes em tampão de bloqueio durante 60 min à temperatura ambiente. Novamente, lave a membrana 3x em 1x TBS-T por 5 min cada.
    NOTA: É altamente recomendável que o anticorpo secundário seja levantado contra a espécie em que o anticorpo primário é levantado. Por exemplo, se o anticorpo primário do KCC2 total for anti-KCC2 do rato, então o anticorpo secundário para o anti-rato deve ser utilizado.
  4. Coloque a membrana lavada na placa de imagem. Misture volumes iguais de cada reagente de quimioluminescência (ECL) aprimorado e espalhe suavemente a solução mista na membrana para desenvolver sinais.

6. Aquisição de imagens utilizando um sistema de imagem e quantificação de dados

  1. Transfira a placa de imagem para o compartimento apropriado no sistema de imagem para geração de imagens. Abra o software de imagem no computador para processamento de imagem.
  2. Na barra de ferramentas, clique em Novo Protocolo e escolha Canal Único. Clique em Selecionar na caixa de diálogo de imagem/aplicativo em gel, role até Blot e selecione Chemi Hi Sensitivity ou Chemi Hi Resolution. Em seguida, clique em Configuração de acumulação de sinal para definir a duração e o número de imagens a serem adquiridas.
  3. Clique em Position Gel na configuração do protocolo e ajuste o gel no sistema de imagem, se necessário. Clique em Executar protocolo para adquirir as imagens.
  4. Clique com o botão direito do mouse em uma das imagens adquiridas sob a caixa do catálogo de imagens para salvar as imagens no computador. Navegue até a imagem desejada e clique em Selecionar imagem e continuar na caixa de diálogo Executar.
  5. Clique no ícone Transformação de imagem para ajustar o contraste e a saturação de pixels da imagem. Clique no ícone Captura de tela na barra de ferramentas geral para salvar a imagem no computador, dependendo do formato de imagem desejado.
  6. Meça as densidades de banda usando o software ImageJ e analise usando ferramentas estatísticas apropriadas.

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Resultados

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Aqui, o resultado representativo apresentado na Figura 1 investigou o impacto da estaurosporina e do NEM na fosforilação mediada por WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 e NKCC1 em linhagens celulares de HEK293 expressando de forma estável KCC2b (HEKrnKCC2b)18 utilizando a técnica de western blotting. Detalhes abrangentes sobre os resultados representativos são discutidos em Zhang et al.15. Semelhante ao NEM, a estaurosporina é um inibidor...

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Discussão

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Muitos métodos têm sido utilizados para medir as atividades do SLC12 de CCCs que são expressos nos neurônios, incluindo o KCC2. Muitas dessas técnicas provaram aprimorar o conhecimento científico sobre a análise da relevância funcional desses transportadores e seus padrões de estrutura-função em diferentes mutações relacionadas à doença. Criticamente, há vantagens e ressalvas para os vários métodos21. No entanto, o protocolo explicado acima, delineou como avaliar a fosforilação do KCC2 em locais r...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094), e uma Commonwealth Ph.D. Scholarship.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
40% de acrilamidaSigma-AldrichA2917Usado para fazer gel de separação e empilhamento para SDS-PAGE 
Amônio por sulfatoSigma-Aldrich248614Usado para fazer gel de separação e empilhamento para SDS-PAGE 
anti pSPAKDundee UniversityS670BUsado como anticorpo primário para western blotting
anti-KCC2Dundee UniversityS700CUsado como anticorpo primário para western blotting
anti-KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678Usado como anticorpo primário para western blotting
anti-KCC2 pThr1007Dundee UniversityS961CUsado como anticorpo primário para western blotting
anti-KCC2 pThr906Dundee UniversityS959CUsado como anticorpo primário para western blotting
anti-mouseTecnologia de sinalização celular66002Usado como anticorpo secundário para western blotting
anti-NKCC1Dundee UniversityS841BUsado como anticorpo primário para western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212Universidade de DundeeS763BUsado como anticorpo primário para
tecnologia de sinalização celularanti-coelhoC29F4Usado como anticorpo secundário para western blotting
anti-sheepabcamab6900Usado como anticorpo secundário para western blotting
anti-SPAKDundee UniversityS669DUsado como anticorpo primário para western blotting
anti-β-Tubulina IIISigma-AldrichT8578Usado como anticorpo primário para western blotting
BenzamineMerck UK135828Usado como componente do tampão de lise
Beta-mercaptoetanolSigma-AldrichM3148Usado como componente do tampão de carga e tampão de lise
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209Usado para quantificação de proteínas lisadas
Aparelho de fundiçãoAtto WSE-1165WUsado para executar eletroforese de página SDS
CentrífugaEppendorf5804Usado na preparação de lisado
CentrífugaVWRMicroStar 17RUsado para fiação de amostras
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLUsado para experimento de cultura de células
Leite desnatado desnatado desidratadoMarvelN / AUsado para fazer bloqueio tampão
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - glicose altaSigma-AldrichD6429Usado para reagente ECL de cultura celular
Perkin ElmerORTT755/2655Usado para desenvolver imagem para western blotting
EDTAFisher ScientificD/0700/53Usado como componente do tampão de lise
EGTASigma-Aldriche4378Usado como componente de lise tampão
Electroforese Fonte de AlimentaçãoBioRadPowerPAC HCPara fornecer energia para executar a eletroforese SDS-page
EtanolThermoFisherE/0650DF/17Usado para preparar equipamentos esterilizados e ambiente
Soro Bovino Fetal -  inativado por calorMerck Life Sciences UKF9665Usado para cultura de células
FumehoodWalkerA7277Usado para cultura de células
Blotting em Gel - WhatmanGE Healthcare 10426981Usado em western blotting para fazer sanduíche de transferência
GlycineSigma-Aldrich15527Usado para fazer buffers
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USAVersão 6.0Usado para plotar gráficos e analisar dados para  western blotting
HClAcros Organics10647282Usado para fazer gel de separação e empilhamento para SDS-PAGE 
Bloco de aquecimentoGrantQBT1Usado para aquecer amostras de carregamento WB
Células HEK293Merck UK12022001-1VLLinha celular para experimento de cultura
ImageJ SoftwareWayne Rasband e Colaboradores; NIH, EUA ImageJ 1.53eUsado para medir intensidades de banda a partir de imagens de western blotting
Sistema de imagemBioRadChemiDoc MPUsado para tirar imagens de western blotting
IncubadoraLEECLEEC precisão 190DUsado para cultura de células
IsopropanolHoneywell24137Usado em gel de fundição para eletroforese
Solução de L-glutaminaSigma-AldrichG7513Usado para cultura de células
Lítio dodecil sulfato (LDS)NovexNP0008Usado como tampão de carregamento para western blotting
MEM Aminoácido não essencial Merck Life Sciences UKM7145Usado para cultura de células
MicrocentrífugaEppendorf5418Usado para preparar lisados para WB
Leitor de microplacasBioRadiMarkUsado para leitura de concentração de proteína lisada
Microsoft PowerpointMicrosoft, EUAPowerPoint2016Usado para editar imagens de western blotting
Marcador de peso molecularBioRad1610373Usado para western blotting
N-etilmaleimidaThermo Fisher Scientific23030Usado para experimento de cultura de células
Membrana de nitroceluloseFisher Scientific45004091Usado para western blotting
Penicilina-estreptomicinaGibco15140122Usado para cultura de células
Medidor de pHMettler ToledoSeven compact s210Usado para monitorar o pH de soluções tampão
Fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF)Sigma-AldrichP7626Usado como componente do tampão de lise
Tampão de fosfato SalinoSigma-AldrichD8537Usado para cultura de células
PKCδ pThr505Tecnologia de sinalização celular9374Usado como anticorpo primário para western blotting
Proteína Gde SepharoseGeneronPG50-00-0002Usado para imunoprecipitação
Cloreto de sódioSigma-AldrichS7653Usado como componente do tampão de lavagem
Cloreto de sódioSigma-AldrichS7653Usado para preparar tampão TBS-T
Dodecil Sulfato de SódioSigma-AldrichL5750Usado para fazer gel de separação e empilhamento para SDS-PAGE 
ortovanadato de sódioSigma-AldrichS6508Usado como componente do tampão de lise
Piruvato de sódioSigma-AldrichS8636Usado para cultura de células
sódio-β-glicerofosfatoMerck UKG9422Usado como componente do tampão de lise
Staurosporine (de Streptomyces sp.)Suprimentos de Laboratório Científico, Reino UnidoS4400-1MGUsado para experimento de cultura de células
SucroseScientifc Suprimentos de LaboratórioS0389Usado como componente do tampão de lise
TEMEDSigma-AldrichT7024Usado para fazer gel de separação e empilhamento para SDS-PAGE 
Câmara de TransferênciaBioRad1658005EDUUsado em western blotting para transferir proteína na membrana
TrisSigma-AldrichT6066Usado para fazer gel de separação e empilhamento para SDS-PAGE 
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Usado como componente do tampão de lise
Solução de tripsina-EDTAMerck Life Sciences UKT4049Usado para cultura
de células Tween-20Sigma-AldrichP3179Usado como tampão TBS-T
Bomba de vácuoCharles AustenDymax 5Usado para cultura de células
VortexScientific IndustriesK-550-GEUsado na preparação de amostras
Misturador de vórticeScientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GEUsado para misturar amostras resolvidas
Grant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5Usado para incubar soluções
de western blotting de

Referências

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