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Artigo de método

Avaliação do Dano Térmico da Craniotomia Robotizada para Cirurgia de Janela de Crânio em Camundongos

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DOI:

10.3791/64188

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11 de novembro de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 2Advanced Platform Technology Center, Louis Stokes Cleveland VA Medical Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

As janelas cranianas tornaram-se uma técnica cirúrgica onipresente para permitir imagens intravitais em camundongos transgênicos. Este protocolo descreve o uso de um robô cirúrgico que realiza perfuração óssea semi-automatizada de janelas cranianas e pode ajudar a reduzir a variabilidade cirurgião-cirurgião e mitigar parcialmente os danos da barreira térmica hematoencefálica.

Resumo

A cirurgia da janela craniana permite a obtenção de imagens de tecido cerebral em camundongos vivos com o uso de multifótons ou outras técnicas de imagem intravitais. No entanto, ao realizar qualquer craniotomia à mão, muitas vezes há dano térmico ao tecido cerebral, que é inerentemente variável de cirurgia para cirurgia e pode ser dependente da técnica individual do cirurgião. A implementação de um robô cirúrgico pode padronizar a cirurgia e levar a uma diminuição do dano térmico associado à cirurgia. Neste estudo, três métodos de perfuração robótica foram testados para avaliar o dano térmico: horizontal, ponto a ponto e pulsado ponto a ponto. A perfuração horizontal utiliza um esquema de perfuração contínua, enquanto a perfuração ponto a ponto faz vários furos que abrangem a janela craniana. O pulsado ponto a ponto adiciona um esquema de perfuração "2 s on, 2 s off" para permitir o resfriamento entre as perfurações. A imagem fluorescente do corante Azul de Evans (EB) injetado por via intravenosa mede os danos ao tecido cerebral, enquanto um termopar colocado sob o local de perfuração mede o dano térmico. Os resultados do termopar indicam uma diminuição significativa na mudança de temperatura no grupo pulsado ponto a ponto (6,90 °C ± 1,35 °C) em comparação com os grupos horizontal (16,66 °C ± 2,08 °C) e ponto a ponto (18,69 °C ± 1,75 °C). Da mesma forma, o grupo pulsado ponto a ponto também mostrou presença significativamente menor de EB após a perfuração da janela craniana em comparação com o método horizontal, indicando menos danos aos vasos sanguíneos no cérebro. Assim, um método de perfuração ponto a ponto pulsado parece ser o esquema ideal para reduzir o dano térmico. Uma furadeira robótica é uma ferramenta útil para ajudar a minimizar o treinamento, a variabilidade e reduzir os danos térmicos. Com a expansão do uso de imagens multifótons em laboratórios de pesquisa, é importante melhorar o rigor e a reprodutibilidade dos resultados. Os métodos abordados aqui ajudarão a informar outros sobre como usar melhor esses robôs cirúrgicos para avançar ainda mais no campo.

Introdução

As janelas cranianas tornaram-se utilizadas de forma ubíqua nos campos da neurociência, engenharia neural e biologia para permitir a visualização direta e a obtenção de imagens do córtex em animais vivos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . A poderosa combinação de camundongos transgênicos e imagens de múltiplos fótons forneceu informações extremamente valiosas sobre a atividade do circuito e outros conhecimentos biológicos no cérebro in vivo 12,13,14,15,16,17,18. Microscópios em miniatura montados no crânio ampliaram ainda mais essas capacidades para permitir gravações em animais acordados e em movimento livre19. O processo de criação de uma janela craniana requer perfurações elétricas para afinar ou remover completamente o osso craniano para produzir craniotomias grandes o suficiente para fixar um pedaço de vidro transparente sobre o córtex20. Polidimetilsiloxano (PDMS) e outros polímeros também têm sido testados como materiais de janela craniana 9,21. Em última análise, a janela craniana ideal é aquela que não altera ou interfere com a atividade endógena normal por baixo. No entanto, é comumente aceito que a perfuração da janela craniana agrava o tecido subjacente, levando a danos ao cérebro, ruptura do ambiente e afetando meninges a ponto de ocluir a profundidade de imagens multifótons22. A neuroinflamação resultante tem uma ampla gama de efeitos que vão desde a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), até a ativação e recrutamento de células gliais ao redor do local do implante23. Portanto, caracterizar métodos de perfuração de janela craniana mais seguros e reprodutíveis é crucial para uma qualidade de imagem consistente e redução dos fatores de confusão.

Enquanto se toma cuidado para minimizar o trauma no tecido subjacente, o ato de perfurar o osso tem o potencial de causar perturbações térmicas e mecânicas ao cérebro24,25. O trauma mecânico decorrente da penetração acidental da broca na dura-máter pode induzir graus variados de lesão cortical24. No estudo de Shoffstall et al.25, o calor da perfuração óssea resultou em aumento da permeabilidade à BHE, como indicado pela presença do corante Azul de Evans (EB) no parênquima cerebral 25. O corante EB, injetado por via intravenosa, liga-se à albumina circulante na corrente sanguínea e, portanto, normalmente não atravessa um BBB saudável em concentrações apreciáveis. Como resultado, o corante EB é comumente usado como um marcador sensível da permeabilidade à BHE26,27. Embora seu estudo não tenha medido diretamente o impacto da permeabilidade da BBB nas sequelas biológicas subsequentes em estudo, estudos anteriores correlacionaram a permeabilidade à BBB a uma resposta neuroinflamatória aumentada a microeletrodos implantados cronicamente e alterações na função motora28.

Dependendo dos objetivos do estudo, a magnitude dos danos térmicos e mecânicos pode contribuir como fonte de erro experimental, afetando negativamente o rigor e a reprodutibilidade do estudo. Existem dezenas de métodos citados para a confecção de janelas cranianas, cada um utilizando diferentes equipamentos de perfuração, velocidades, técnicas e usuários 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 relataram que a variação observada nos resultados de aquecimento foi atribuída à variabilidade na força aplicada, taxa de alimentação e ângulo de aplicação da broca, entre outros aspectos que não podem ser controlados durante a perfuraçãomanual25. Acredita-se que sistemas de perfuração automatizados e outros equipamentos estereotáxicos possam melhorar a reprodutibilidade e a consistência dos resultados, mas estudos de métodos publicados não avaliaram rigorosamente a temperatura ou a permeabilidade à BHE como um dos desfechos. Portanto, há necessidade de métodos mais reprodutíveis e consistentemente aplicados para produzir janelas cranianas, bem como métodos rigorosamente aplicados para avaliar o impacto da perfuração da janela craniana no tecido neural subjacente.

O foco deste estudo é determinar e desenvolver métodos de perfuração consistentes e seguros para janelas cranianas. O tamanho da craniotomia para instalação da janela craniana é significativamente maior do que as craniotomias padrão para microeletrodos implantados no cérebro. Tais craniotomias não podem ser completadas com um único orifício de broca quando se utiliza equipamento padrão, introduzindo maior variabilidade da técnica intercirurgião quando realizadasmanualmente20. Robôs de perfuração cirúrgica têm sido introduzidos no campo, mas ainda não têm sido amplamente adotados 1,6,29. A automação da perfuração oferece controle sobre as variáveis que contribuem para a variação experimental-a-experimental, sugerindo que o uso do equipamento pode reduzir os efeitos inter e intra-cirurgião. Isso é de particular interesse dada a dificuldade adicional da craniotomia maior necessária para a colocação da janela craniana. Embora se possa supor que haja benefícios claros para o controle proporcionado pela automação da perfuração, há pouca avaliação da implementação desses equipamentos. Embora lesões visíveis não tenham sidoobservadas5, o teste de maior sensibilidade com o uso da EB é desejado.

Aqui, a permeabilidade BBB é medida usando um robô de perfuração cirúrgica disponível comercialmente com software correspondente, que permite a programação de coordenadas estereotáxicas, planejamento/mapeamento de craniotomia e uma seleção de estilos de perfuração ("ponto-a-ponto" vs "horizontal"), referindo-se ao caminho roteado da broca. Inicialmente, são perfurados oito pontos de "semente" (Figura 1A), delineando a janela craniana. A partir daqui, o espaço entre as sementes é recortado usando o método de broca "ponto a ponto" ou "horizontal". "Ponto a ponto" realiza cortes de furo piloto verticais (semelhante a uma prensa de perfuração CNC), enquanto "horizontal" realiza cortes horizontais ao longo da circunferência da janela craniana que delineia o furo (semelhante a um roteador CNC). O resultado para ambos os métodos é um pedaço de crânio que pode ser removido para revelar a janela craniana. Para isolar os danos da perfuração, a janela craniana não é removida fisicamente, de modo a evitar qualquer dano adicional. Uma combinação de corante EB acoplado a imagens fluorescentes é usada para medir a permeabilidade à BHB após a realização de craniotomias em camundongos, e um termopar inserido é usado para medir diretamente a temperatura da superfície cerebral durante a perfuração (Figura 1B,C). Observações anteriores indicaram que a perfuração pulsada liga/desliga com intervalos de 2 s foi suficiente para mitigar o aquecimento da broca25 e, portanto, está incorporada à abordagem experimental para o robô cirúrgico.

A intenção do trabalho apresentado é demonstrar métodos de avaliação de danos térmicos decorrentes da perfuração de craniotomias. Embora os métodos sejam apresentados no contexto da perfuração automatizada, tais métodos também podem ser aplicados a esquemas de perfuração manual. Esses métodos podem ser usados para validar o uso de equipamentos e/ou esquemas de perfuração antes de adotar como procedimento padrão.

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Figura 1: Esquema de pipeline experimental. Esquema demonstrando o processo a que os animais foram submetidos para quantificação da EB pós-janela craniana. (A) Configuração esquemática do mouse com a armação estereotáxica e broca robótica cirúrgica. Um exemplo de janela craniana é mostrada sobre o córtex motor com pontos de semente (verde) e pontos de borda (azul). (B) A configuração de perfusão inclui a injeção de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) em todo o animal para remover qualquer sangue, seguida de extração do cérebro. (C) O cérebro é então colocado na câmara do sistema de imagem fluorescente EB para conduzir imagens fluorescentes no corante azul de Evans. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

Todos os procedimentos e práticas de cuidados com os animais foram revisados, aprovados e realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center.

1. Configuração do hardware do robô cirúrgico

  1. Antes da cirurgia, siga o manual do robô cirúrgico (consulte Tabela de Materiais) e o guia para configurar o hardware e o software. Execute a calibração do quadro conforme detalhado no manual. Se a broca ou o quadro forem movidos, recomenda-se recalibrar a broca para garantir a precisão.

2. Preparação do software

  1. Navegue até o software cirúrgico (consulte Tabela de materiais) e crie um novo projeto selecionando Iniciar com um projeto limpo. Defina o assunto como Mouse na parte superior para designar as coordenadas de perfuração a serem usadas.
  2. Selecione Iniciar novo projeto.
  3. A partir daqui, clique em Planejamento no canto inferior esquerdo para navegar até a tela de planejamento de coordenadas de perfuração. Criar o esquema de perfuração para a técnica de janela craniana a ser executada.
    1. Para fazer isso, clique em qualquer lugar no atlas estereotáxico. Use Bregma como referência e insira as seguintes coordenadas para o córtex motor: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Pressione Enter no teclado para atualizar as coordenadas selecionadas.
      NOTA: As coordenadas Dorso-Ventral (DV) denotam a profundidade de perfuração e, portanto, não precisam de uma entrada aqui.
    2. Clique em Destino da Loja para salvar essas coordenadas e inserir um nome apropriado. A partir daqui, clique no botão Mover no canto inferior esquerdo para navegar de volta para a tela de perfuração principal.
  4. Clique em Ferramentas > Projeto > Salvar como para reutilizar este projeto de modelo para projetos posteriores. Isso manterá automaticamente as coordenadas de perfuração para uso posterior.

3. Preparo para a cirurgia

  1. Anestesiar camundongos PrismPlus30,31 (ver Tabela de Materiais) em câmara de isoflurano (3,5% em 1,5 L/min O2). Aplique lubrificante ocular para evitar o ressecamento dos olhos, raspe a cabeça usando cortadores e corte as unhas para evitar que os ratos risquem as suturas.
    NOTA: Camundongos PrismPlus são um tipo de espécie fluorescente transgênica usada em imagens multifótons. Os camundongos heterozigotos PrismPlus não possuem os genes fluorescentes e, portanto, foram usados aqui para reduzir o desperdício animal de outros estudos em andamento, e uma vez que não há imagens de multifótons neste estudo. Espera-se que camundongos selvagens apresentem resultados semelhantes.
  2. Administrar injeções subcutâneas dos antibióticos cefazolina (24 mg/kg), carprofeno analgésico (5 mg/kg) e buprenorfina (0,05-0,10 mg/kg) aos camundongos anestesiados. Antes de qualquer incisão, administrar uma única injeção subcutânea de marcaína (0,25%, 100 μL) abaixo do local da incisão (1 polegada ao longo da linha média do crânio começando atrás dos olhos).
    OBS: Os medicamentos utilizados seguem protocolos previamente estabelecidos pela IACUC. No entanto, recomenda-se considerar EMLA creme como um anestésico tópico para um efeito multimodal antes da cirurgia e injeção da veia caudal, bem como Meloxicam SR no lugar de Carprofeno. EMLA e Meloxicam SR podem ser administrados antes da anestesia com isoflurano.
  3. Montar o animal na estrutura estereotáxica do robô cirúrgico, utilizando barras auriculares fornecidas, e manter a anestesia com isoflurano a 0,5%-2% por inalação através de um cone nasal.
  4. Certifique-se de que a profundidade anestésica seja monitorada de perto por um técnico ou equipe veterinária treinada, com base na capacidade de resposta do mouse, respiração (~55-65 respirações/min), frequência cardíaca (300-450 bpm) e cor (rosa). O bigode e a pinça regular dos dedos dos pés também podem ser usados como uma medida para determinar a profundidade da anestesia. Os valores dos sinais vitais são determinados pelos regulamentos institucionais da IACUC.
  5. Mantenha a temperatura corporal do animal em uma almofada de água circulante e monitore os sinais vitais usando um sistema de medição de oxigênio no sangue e frequência cardíaca.
  6. Esfregar a área cirúrgica com gluconato de clorexidina (CHG) e isopropanol a 70% para esterilização. Para manter a esterilidade durante a cirurgia, coloque um filme plástico estéril sobre o mouse e armação estereotáxica.
    OBS: Embora esses protocolos tenham sido desenvolvidos para cirurgias de sobrevida, os dados apresentados refletem o uso de animais não sobreviventes, pois o foco foi testar e determinar os métodos de protocolos de perfuração apropriados.

4. Preparo do crânio

  1. Usando uma lâmina de bisturi, realize uma incisão de 1 polegada na linha média do crânio, começando na parte de trás dos olhos.
  2. Puxe a pele para trás para expor o crânio e (opcionalmente) use afastadores para manter a janela cirúrgica. Remova qualquer tecido residual e membrana usando aplicadores estéreis com ponta de algodão.
  3. Secar e limpar o crânio usando peróxido de hidrogênio a 3% com aplicadores com ponta de algodão.
    NOTA: Isso tornará as suturas do crânio visíveis. Bregma e Lambda devem ser facilmente vistos. Caso contrário, aplique mais peróxido de hidrogênio ou aumente o tamanho da incisão.
  4. Permita a funcionalidade de "parada automática" conectando o cabo do clipe do jacaré da configuração de perfuração do robô cirúrgico ao mouse, de acordo com as recomendações do fabricante. "Auto-stop" funciona detectando uma mudança na impedância, portanto, uma vez que a broca entra em contato com o líquido cefalorraquidiano (LCR) em vez de osso, a broca irá parar de perfurar, evitando assim danos ao cérebro.

5. Injeção da veia da cauda azul de Evans

CUIDADO: A EB é um possível carcinógeno. Use luvas ao manusear.

  1. Para preparar a cauda para uma injeção fácil, limpe com um lenço com álcool. Opcionalmente, o óleo wintergreen pode ser aplicado topicamente para dilatar a veia35.
  2. Segure a cauda em uma mão enquanto manuseia a seringa contendo EB na outra mão. Usando o polegar e o indicador, dobre a cauda para expor a veia da cauda em cima da curvatura da cauda. Inserir a seringa (1 ou 2 mL, seringa de insulina 30 G) paralelamente à veia e injetar lentamente o volume de EB. A EB (4% p/v) é administrada na concentração de 2 mL/kg de peso corporal por injeção na veia caudal.
    NOTA: A resistência mínima ou nula ao fluxo da seringa para a cauda pode ser sentida se a agulha for inserida corretamente. Se houver resistência ou o corante EB aparecer na cauda, mova-se para baixo na cauda e tente novamente.
  3. Uma vez injetado, aguarde 5 min para permitir que o EB circule por todo o mouse antes do início da perfuração. A injeção bem-sucedida é imediatamente verificada quando as extremidades do mouse e a janela cirúrgica ficam azuis.

6. Procedimento cirúrgico de perfuração do robô

  1. Uma vez que o crânio esteja preparado para perfuração, navegue de volta para o software cirúrgico. Abra o projeto de modelo definido na etapa 2.4 onde as coordenadas para perfuração foram designadas.
    1. Siga Ferramentas > Projeto > Novo > Selecione um projeto de modelo e escolha o projeto de modelo que foi designado na etapa 2 (preparação de software).
    2. Selecione Elementos do mesmo protocolo > Planejamento (pontos de destino) > Parâmetros de perfuração para transferir para este novo projeto.
    3. Clique em Iniciar novo projeto.
  2. Em seguida, corrija a broca e o quadro para levar em conta a inclinação e a escala do crânio do rato do animal atual. Clique em Ferramentas e selecione Correto para inclinação e dimensionamento... para abrir a tela de correção. Na parte superior da tela, verifique se a broca está ativa (não a seringa), clicando no botão Drill vermelho claro.
    NOTA: Uma vez ativado, o botão Drill ficará vermelho escuro/brilhante. O botão da seringa pode ser ignorado, pois não é utilizado neste protocolo.
    1. Primeiro, corrija a Escala, o Pitch e o Yaw definindo onde Bregma e Lambda estão localizados no animal atual. Utilize os controles do teclado ou os controles na tela para mover a broca. Uma vez que a broca estiver localizada sobre Bregma, abaixe-a até que esteja apenas tocando o crânio e clique em Set Bregma. Repita isso para a Lambda.
    2. Em seguida, ajuste para o rolo específico do crânio. Clique no botão Ir para o ponto médio para ajustar a broca automaticamente para o centro do crânio. Clique em 2 mm para a esquerda e, em seguida, abaixe lentamente a broca até tocar o crânio. Clique em Definir Ponto Esquerdo.
    3. Repita o passo 6.2.2 para o lado direito do cérebro. Agora, o sistema está configurado para esse crânio específico.
      NOTA: A correção aqui é fundamental para garantir coordenadas e profundidade de perfuração adequadas. O mouse precisa ser montado o mais próximo possível da reta para reduzir ao máximo a necessidade de correção. Se grandes correções forem necessárias, isso pode resultar em baixa precisão de perfuração.
  3. Após a correção ter sido executada, saia da janela de correção clicando em Fechar no meio inferior da tela. Navegue até a tela de perfuração clicando em Ferramentas e, em seguida, selecionando Broca... para iniciar o procedimento de perfuração.
    1. Certifique-se de que Craniotomy-Shape seja escolhido no menu suspenso Drill na parte superior da tela. Em seguida, clique em Selecionar forma de centro de perfuração & e escolha o destino predefinido que foi nomeado na etapa 2.3.1. Nesta tela, selecione Círculo como a forma para o alvo e insira 2,60 mm como o diâmetro2 do círculo. Clique em Mostrar.
      NOTA: O diâmetro da janela craniana é criado usando o centro da broca como o centro dos pontos de semente. Uma broca pequena (diâmetro = 0,6 mm ou o tamanho de broca recomendado fornecido pelo fornecedor) é usada para minimizar o diâmetro extra adicionado como resultado do uso de uma broca maior. Brocas especiais são usadas especificamente para o robô cirúrgico. Os oito pontos de semente e pontos de borda agora aparecerão no crânio como pontos verdes e azuis, respectivamente.
    2. Clique na janela principal e use o atalho de teclado Control + Shift + D para abrir o menu Drill Points no lado direito da tela. Isso permite a visualização de profundidades e status específicos do ponto de perfuração.
    3. Antes do início da perfuração, personalize o recurso de parada automática, se necessário, clicando no botão ao lado da caixa de seleção Parada automática . Esse botão tem como padrão Médio, que corresponde à sensibilidade do recurso de parada automática.
      NOTA: Isso pode ser testado de antemão para encontrar a sensibilidade certa para os animais. Neste protocolo, a maior sensibilidade foi usada para garantir uma perfuração mínima através do cérebro.
    4. Depois que o recurso de parada automática estiver habilitado e personalizado, inicie a perfuração do ponto de semente. Clique em Auto Scan para que a broca comece automaticamente na Semente 1. Uma vez que a broca toca o LCR, o recurso de parada automática detectará uma mudança na impedância, levando a uma parada na perfuração e retração da broca do crânio.
    5. Fique de olho na perfuração caso a parada automática não detecte alterações. A tecla Escape pode ser pressionada para cancelar manualmente a perfuração. O círculo rosa localizado na parte inferior do menu Drill e à direita dos valores de impedância também pode ser clicado para iniciar ou parar a perfuração.
      NOTA: A broca perfurará automaticamente até uma profundidade igual à espessura estimada do crânio (ou até que o recurso de parada automática seja ativado).
    6. Se a parada automática não for ativada antes que a profundidade estimada seja atingida, uma tela aparecerá solicitando ao usuário: 1) Continue perfurando e descendo # mm adiante, 2) Marque na profundidade atual e continue, 3) Ignore o ponto atual e continue, ou 4) Pare o processo (pode ser continuado mais tarde). Escolha uma das opções descritas abaixo.
      1. Para Continuar perfurando e descendo # mm adiante, insira uma distância para que a broca avance. Por padrão, 0,1 mm é usado. Uma distância menor pode ser sugerida para evitar a penetração acidental do cérebro.
      2. Se acredita-se que a dura-máter foi atingida nesta tela, selecione a opção Marcar na profundidade atual e continuar para que o sistema marque a dura-máter nessa profundidade e passe para a próxima semente.
      3. Use a opção Ignorar o ponto atual e continuar e Parar o processo (pode ser continuado mais tarde) para solucionar problemas ou limpar a broca e retornar quando a parada automática estiver funcionando novamente.
    7. Uma vez que todos os pontos de semente tenham sido perfurados, se algum não tiver sido terminado usando o recurso de parada automática, verifique a profundidade do furo manualmente usando uma dura-máter. Isso garantirá que a profundidade perfurada penetre através do crânio.
    8. Antes de iniciar a perfuração do ponto de borda, decida que tipo de 'corte de borda' é desejado selecionando a lista suspensa ao lado do texto Corte de borda no menu Perfuração. As duas opções são Ponto a Ponto e Horizontalmente.
      1. Selecione Ponto a Ponto para perfurar cada ponto de borda individualmente e até uma profundidade determinada pelas profundidades do ponto de semente adjacente. Ajuste o dimensionamento, se necessário, por meio do botão Edge Scaling... abaixo, embora o padrão de No Scaling geralmente seja suficiente.
      2. Selecione Horizontalmente para iniciar a perfuração no Edge Point 1 e use um movimento de perfuração contínuo para contornar toda a circunferência do círculo de perfuração. Por padrão, o corte horizontal cortará em intervalos de 100 μm, indo até a circunferência da janela antes de avançar mais 100 μm mais fundo. Se necessário, altere a profundidade do intervalo e a velocidade de perfuração no botão Opções de corte... abaixo.
      3. Use o deslocamento de corte automático (abaixo da caixa Edge-Cut) para ajustar a profundidade de corte automático tomando um deslocamento predeterminado dos pontos de semente adjacentes. Nesse protocolo, foi utilizado um deslocamento autocortado de 20 μm. Testes adicionais podem ser feitos para determinar um deslocamento ideal por animal.
    9. Depois que as configurações de corte de borda tiverem sido determinadas, inicie a perfuração do ponto de borda clicando no botão Corte automático no meio do menu Perfuração. Para perfuração ponto a ponto, uma vez que a última borda tenha sido perfurada, o procedimento de perfuração é concluído. Para a perfuração horizontal, continue até que o crânio tenha sido perfurado o suficiente para liberar a janela craniana.
      NOTA: Embora a perfuração seja realizada até que a janela possa ser liberada, a janela não é liberada fisicamente aqui para evitar qualquer dano ao tecido subjacente. É importante isolar os danos resultantes apenas da perfuração para avaliar diferentes esquemas de perfuração.
      1. Quando a perfuração horizontal atingir a profundidade de um ponto de semente, clique com o botão direito do mouse nessa semente (ou selecione vários pontos primeiro) no menu Pontos de perfuração e clique em Bloquear profundidade. Isso permitirá que o corte horizontal continue sem cortar mais profundamente para essa área (evitando assim penetrar no cérebro).
        NOTA: Se houver pontos de semente com diferentes profundidades de dura-máter, isso pode causar diferenças na profundidade necessária para o procedimento de perfuração horizontal.
    10. Se o recurso de parada automática não estiver funcionando corretamente, certifique-se de que a broca esteja totalmente limpa de quaisquer detritos ou sangue potencial, soro fisiológico, etc., pois isso pode afetar a impedância da base da broca. Além disso, escolha uma das várias opções de perfuração manual descritas abaixo caso a parada automática não funcione de forma consistente.
      1. No menu Drill, navegue manualmente até cada semente clicando com o botão direito do mouse na semente ou borda e escolhendo Ir para Entrada. Há também opções para limpar as profundidades marcadas, redefinir o furo e outras opções que podem auxiliar no procedimento de perfuração.
      2. Controle manualmente o avanço da profundidade de perfuração selecionando uma profundidade na lista suspensa localizada ao lado do texto Avançar: próximo à parte superior do menu Perfuração. Clique no botão Avançar logo abaixo para avançar a broca na distância definida.
        NOTA: Este recurso pode ser usado em conjunto com os botões Definir dura e Definir superfície abaixo do botão Avançar para informar manualmente ao sistema onde a superfície do crânio e da dura estão localizadas. Use a função de parada automática sempre que possível, mas se necessário, essas opções manuais também são suficientes.
      3. Se perfurar manualmente, tome mais cuidado entre cada intervalo de profundidade de perfuração para garantir que a broca não exceda a dura-máter. Verifique o furo perfurado usando uma dura-máter entre intervalos de profundidade para confirmar se a dura-máter foi atingida. Uma vez que toda a perfuração manual de sementes esteja concluída, continue o procedimento de corte de borda normalmente conforme descrito acima.
    11. Método do pulso
      1. Para realizar a perfuração manual do pulso, desative o recurso de parada automática desmarcando a caixa de seleção ao lado da opção Parada automática no menu Perfuração. Este deve estar desligado para permitir o controle quando a broca está desligada para o pulso.
        NOTA: A perfuração por pulso segue um padrão de 2 s de perfuração seguido por 2 s de nenhuma perfuração para permitir que o crânio esfrie.
      2. No menu Perfuração, selecione 100 μm como o avanço da profundidade da perfuração, isso equivalerá a ~2 s de perfuração para baixo.
      3. Depois de pronto, clique em Avançar para iniciar a perfuração.
        NOTA: Esteja pronto para parar rapidamente a broca assim que ela avançar 100 μm, pois a broca continua a girar na profundidade até que o escape seja pressionado (gerando calor desnecessário).
      4. Uma vez que a broca tenha avançado 100 μm, pressione Escape duas vezes para parar a broca. Após 2 s, repita este ciclo para a profundidade do crânio.
        NOTA: Somente o método ponto a ponto pode ser executado usando o método pulsado devido a restrições mecânicas e de software. A perfuração horizontal contínua não pode ser realizada desta forma.
      5. Perfure todos os pontos de semente e borda usando este método detalhado acima. Certifique-se de definir Dura usando o botão no menu Drill uma vez que a dura tenha sido atingida.

7. Perfusão e extração cerebral

  1. Uma vez terminada a perfuração da semente e dos pontos de borda, manter o animal sob anestesia com isoflurano por mais 1 h para permitir que o corante EB circule e extravase através da BHE danificada. Realizar perfusão cardíaca para remover qualquer sangue ou fluidos dos vasos e, em seguida, remover o cérebro para imagens e análises, conforme descrito abaixo.
    1. Após o período de 1 h de circulação da EB após a criação da janela craniana, injetar um coquetel de quetamina (160 mg/kg) e xilazina (20 mg/kg) por via intraperitoneal no animal. Uma vez sem resposta, realizar uma perfusão cardíaca.
    2. Abra o abdômen do mouse usando uma tesoura e exponha o coração cortando verticalmente através da caixa torácica e horizontalmente através do diafragma. Retraia a caixa torácica para ver o coração claramente. Insira uma agulha de borboleta no ventrículo esquerdo do coração e comece a infundir 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) em todo o corpo. Corte uma pequena porção do átrio direito do coração para liberar o acúmulo de pressão.
    3. Após 25 mL de 1x PBS ter perfundido por todo o corpo, parar a perfusão e decapitar o camundongo como um meio secundário de eutanásia.
      NOTA: Certifique-se de realizar o método aprovado institucionalmente de eutanásia e/ou perfusão final para o animal isolar o cérebro.
    4. A partir daqui, extraia o cérebro do crânio, removendo o osso e o tecido com rongeurs.
    5. Imagem do cérebro extraído com um sistema de imagem fluorescente para observar a quantidade de EB localizada no cérebro ao redor dos locais de perfuração.
      NOTA: A BE liga-se à albumina circulante. Se ocorrer dano vascular no cérebro, a EB vazará e se ligará ao tecido cerebral, levando a um indicador visual claro de dano.

8. Imagem e análise Evans Blue

  1. Inicialização de hardware
    1. Ligue o computador conectado ao sistema de imagem de fluorescência EB e inicie o software de imagem (consulte Tabela de Materiais) enquanto outros itens estão sendo preparados. Ligue a fonte de luz, a plataforma e a câmera, nessa ordem.
    2. Navegue até o software de geração de imagens e clique em Inicializar no Painel de Controle de Aquisição. O sistema e a câmara sinalizarão de vermelho para verde assim que a inicialização for concluída.
      NOTA: Inicialize o sistema de imagem fluorescente EB 30 minutos antes de qualquer imagem para permitir que a temperatura da fonte de luz atinja níveis ideais.
  2. Imagem do cérebro
    1. Coloque o cérebro explantado em um prato claro no centro do palco para geração de imagens.
    2. No Painel de Controle de Aquisição, ajuste as configurações da imagem. Selecione o tempo de exposição: 1 s; Binning: Médio; F/Paragem: F1; Excitação: 535 a 675 nm; Emissão: Cy 5,5; Nível da lâmpada: Alto; e FOV: 5 cm. Deixe o filtro bloqueado e a sobreposição de fotografia e fluorescência verificada. Essas configurações são baseadas na experiência laboratorial anterior e em outros métodos publicados de geração de imagens do EB36.
  3. Carregue imagens do sistema de imagem fluorescente EB em software de processamento de imagem de acesso aberto (consulte Tabela de Materiais) e gere três regiões de interesse à mão livre (ROIs) para encontrar a intensidade fluorescente da EB medindo a radiância média sobre o fundo, todo o cérebro e janela craniana.
    1. Normalize as medidas da janela craniana e de todo o cérebro contra a ROI de fundo correspondente.
    2. Imagem de cada cérebro sob diferentes filtros de excitação (535-675 nm) para encontrar o comprimento de onda com a maior relação sinal/ruído (605 nm foi escolhido) entre os grupos experimentais para o controle salino.
      1. Isole a radiância média sob o comprimento de onda e a média apropriados para obter a radiância média ou intensidade fluorescente média para todo o cérebro e ROIs da janela craniana.
  4. Localizar e normalizar a radiância média média sobre a área da janela craniana para cada grupo em relação ao controle salino.

9. Avaliação do termopar

  1. Meça as mudanças de temperatura do crânio e do cérebro usando um termopar (ver Tabela de Materiais) em combinação com os três diferentes esquemas de perfuração. O termopar é conectado a um sistema de aquisição de dados (DAQ) que permite que a medição seja lida no MATLAB.
  2. Monte um mouse cadáver na estrutura estereotáxica e na configuração da broca robótica. Faça manualmente um pequeno orifício (mesmo tamanho do ponto de semente) ~2 mm de distância de onde a janela craniana será feita na lateral do crânio25. Esse orifício permitirá que o termopar seja deslizado para a posição sob a qual ocorre a perfuração da janela craniana (Figura 2D).
    NOTA: Ratos cadáveres são usados porque a perfuração aberta na lateral do crânio é necessária para deslizar o termopar sobre a região de perfuração da janela craniana. Este camundongo cadáver é um animal diferente do usado anteriormente para análise do Evans Blue.
  3. Inicie o processo de perfuração para cada um dos três esquemas conforme feito anteriormente (etapa 6). À medida que a broca passa pelo crânio, haverá picos de mudança de temperatura, indicando que o aquecimento ocorre perto do cérebro.
  4. Registre e plote os resultados no MATLAB para calcular a diferença de temperatura máxima. Isso deve ser feito separadamente para a perfuração de sementes e a perfuração de borda para avaliar a perfuração horizontal versus ponto a ponto, juntamente com o método de perfuração manual pulsada.

10. Estatística

  1. Realizar análise estatística para imagens fluorescentes de termopar e EB em R usando o teste da soma de postos de Kruskal-Wallis com correção de Benjamini-Hochberg seguido de comparações pareadas usando o teste exato da soma de postos de Wilcoxon25.

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Resultados

Avaliação térmica
O potencial de dano térmico foi avaliado medindo-se a mudança de temperatura em relação à linha de base devido à perfuração usando métodos horizontal (Figura 2A), ponto a ponto (Figura 2B) e pulsado ponto a ponto (Figura 2C). A Figura 2D mostra o arranjo experimental para a obtenção de dados térmicos. Um tamanho de amostra de N = 4 janelas cranianas foi utilizado pa...

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Discussão

O uso de corante EB e imagens é simples, rápido e útil para avaliar o dano vascular no cérebro para novos métodos e técnicas. Seja usando um robô cirúrgico ou confirmando métodos atualmente feitos em laboratório, é importante validar métodos cirúrgicos para isolar os efeitos de tratamentos experimentais versus impacto cirúrgico e melhorar o bem-estar animal. Uma configuração de termopar também é útil na avaliação de métodos de perfuração para garantir que nenhum aquecimento ocorra. Sabe-se que o aumento da temperatura de...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar. O conteúdo não representa as opiniões do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA, dos Institutos Nacionais de Saúde ou do Governo dos Estados Unidos.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado em parte pelos Prêmios de Revisão de Mérito GRANT12418820 (Capadona) e GRANTI01RX003420 (Shoffstall/Capadona), e pelo Prêmio de Cientista de Carreira de Pesquisa # GRANT12635707 (Capadona) do Serviço de Pesquisa e Desenvolvimento de Reabilitação do Departamento de Assuntos de Veteranos dos Estados Unidos (EUA). Além disso, este trabalho também foi apoiado em parte pelo National Institute of Health, pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke GRANT12635723 (Capadona) e pelo National Institute for Biomedical Imaging and Bioengineering, T32EB004314, (Capadona/Kirsch). Este material é baseado em trabalho apoiado pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship sob o número GRANT AWARD12635723. Quaisquer opiniões, descobertas e conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1x Tampão com Fosfato Salino
Tipo: Reagente		VWRMRGF-6235Para Diluição Evans Blue
Aura Software
Tipo: Ferramenta		Spectral Instruments Softwarede processamento de imagens de acesso aberto para sistemas de imagem Lumina
Buprenorfina
Tipo: Medicamento		Proveniente de Instalações de Animais
Broca de Carboneto, 0,6mm (Broca Robotizada)
Tipo:		Estoeltingde ferramentas 58640-1
Carprofeno
Tipo: Medicamento		proveniente de Biotério
Cefazolina
Tipo: Medicamento		Proveniente de Biotério
Evans Blue Dye
Tipo: Reagente		Millipore SigmaE2129Reconstituído em 1x solução salina tamponada com fosfato
Isoflurano
Tipo: Medicamento		Proveniente do Biotério
IVIS Lumina II
Tipo: Ferramenta		Perkin ElmerCLS136334IVIS Lumina III atualmente no lugar do Lumina II no mercado
Termômetro Linearizador Jenco
Tipo: Ferramenta		Jenco765JFPara configuração
termopar Cetamina
Tipo: Medicamento		Proveniente do Biotério
LivingImage
Tipo: Ferramenta		Software Perkin Elmerpara IVIS Lumina III
Marcaine
Tipo: Medicamento		Proveniente de Animal Facility
Neurostar Software
Tipo: Armazenamento		deVem com compra de robô cirúrgico
Physiosuite com MouseSTAT® Oxímetro de pulso e Monitor de Freqüência Cardíaca
Tipo: Ferramenta		Kent ScientificPS-03Usado para monitorar os sinais vitais
Ratos PrismPlus
Tipo: Animal		Jackson Labortory031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Macho, ~8 meses de idadeAnimais usados para o estudo
Broca de Armazenamento e Robô de Injeção para Instrumentos Estereotáxicos Motorizados
Tipo: Ferramenta		Stoelting58640Broca robótica principal com estrutura estereotáxica
Tipo de termopar
: Ferramenta		TC Direct206-557Para configuração de termopar
USB-6008 E/S multifuncional DAQ
Tipo: Ferramenta		National InstrumentsUSB-6008Para configuração de termopar
Xilazina
Tipo: Medicamento		proveniente de Animal Facility
do Ferramentas

Referências

  1. Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678(2020).
  2. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  3. Augustinaite, S., Kuhn, B. Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100779(2021).
  4. Wang, X., et al. A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 15, 673740(2021).
  5. Wang, Y., Xi, L. Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review. Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15(2021).
  6. Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protocols. 1 (3), 100194(2020).
  7. Kunori, N., Takashima, I. An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging. Micromachines. 10 (11), 789(2019).
  8. Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
  9. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  10. Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).
  11. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  12. Sundaram, G. S., et al. Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice. Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).
  13. Spires, T. L., et al. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).
  14. Price, D. L., et al. High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders. Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).
  15. Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).
  16. Hyman, B. T. The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).
  17. Korzhova, V., et al. Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice. Communications Biology. 4 (1), 1368(2021).
  18. Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).
  19. Courtin, J., et al. A neuronal mechanism for motivational control of behavior. Science. 375 (6576), (2022).
  20. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).
  21. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100(2021).
  22. Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study. Biomaterials. 195, 111-123 (2019).
  23. Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001(2015).
  24. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  25. Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001(2018).
  26. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385(2015).
  27. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Scientific Reports. 4, 6588(2014).
  28. Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7 (1), 15254(2017).
  29. Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007(2021).
  30. Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores. PLoS One. 7 (7), 40511(2012).
  31. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).
  32. Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature. Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).
  33. Eriksson, A. R., Albrektsson, T. Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit. The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).
  34. Bonfield, W., Li, C. H. The temperature dependence of the deformation of bone. Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).
  35. Hrapkiewicz, K., Medina, L. Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).
  36. McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat. Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).
  37. Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments. (123), e52642(2017).

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