Summary
O presente protocolo oferece um método eficiente e flexível para isolar o RNA das frações nucleares e citoplasmáticas usando células cultivadas e, em seguida, validar usando qPCR. Isso efetivamente serve como um substituto para outros kits de preparação de RNA.
Abstract
A separação de componentes intracelulares tem sido uma ferramenta fundamental na biologia celular há muitos anos e tem sido capaz de fornecer informações úteis sobre como sua localização pode afetar sua função. Em particular, a separação do RNA nuclear e citoplasmático tornou-se importante no contexto das células cancerosas e na busca para encontrar novos alvos para drogas. A compra de kits para extração de RNA nuclear-citoplasmático pode ser dispendiosa quando muitos dos materiais necessários podem ser encontrados em um ambiente de laboratório típico. Usando o método atual, que pode substituir kits mais caros ou outros processos demorados, apenas um tampão de lise caseiro, uma centrífuga de bancada e colunas de purificação de isolamento de RNA são necessárias para isolar o RNA nuclear e citoplasmático. O tampão de lise é usado para lisar suavemente a membrana externa da célula sem afetar a integridade do envelope nuclear, permitindo a liberação de seus componentes intracelulares. Em seguida, os núcleos podem ser isolados por uma simples etapa de centrifugação, uma vez que possuem uma densidade maior do que a solução de lise. A centrifugação é utilizada para separar essas áreas com base em suas diferenças de densidade para isolar elementos subcelulares no núcleo daqueles no citoplasma. Uma vez que a centrifugação tenha isolado os diferentes componentes, um kit de limpeza de RNA é utilizado para purificar o conteúdo de RNA, e qPCR é realizada para validar a qualidade da separação, quantificada pela quantidade de RNA nuclear e citoplasmático nas diferentes frações. Níveis estatisticamente significativos de separação foram alcançados, ilustrando a eficácia do protocolo. Além disso, este sistema pode ser adaptado para o isolamento de diferentes tipos de RNA (RNA total, pequeno, etc.), o que permite o estudo direcionado das interações citoplasma-núcleo e auxilia na compreensão das diferenças na função do RNA que residem no núcleo e no citoplasma.
Introduction
O fracionamento celular em componentes subcelulares permite o isolamento e o estudo de domínios bioquímicos definidos e auxilia na determinação da localização de processos celulares específicos e como isso pode afetar sua função1. O isolamento do RNA de diferentes localizações intracelulares pode permitir uma melhor precisão da análise genética e bioquímica dos eventos do nível de transcrição e outras interações entre o núcleo e o citoplasma, que serve como o objetivo principal do protocolo atual2. Este protocolo foi desenvolvido para garantir o isolamento de RNAs citoplasmáticos e nucleares para determinar seus respectivos papéis na exportação nuclear e para entender como a localização subcelular de RNAs no núcleo e citoplasma pode afetar sua função nos processos celulares. Utilizando materiais de um ambiente laboratorial típico, foi possível alcançar o fracionamento nuclear e citoplasmático de forma mais eficaz e menos dispendiosa do que os protocolos previamente estabelecidos, sem comprometer a qualidade dos resultados3.
Além disso, a troca de moléculas entre o citoplasma e o núcleo pode ser estudada diretamente separando essas regiões. Mais especificamente, a compreensão do transcriptoma é essencial para a compreensão do desenvolvimento e da doença. No entanto, os RNAs podem estar em diferentes níveis de maturação a qualquer momento e podem complicar a análise a jusante. Este protocolo permite a capacidade de isolar o RNA das frações subcelulares nucleares e citoplasmáticas, o que pode auxiliar nos estudos de RNA e permitir uma melhor compreensão de um RNA particular de interesse, como a localização de RNAs não codificantes ou a análise de junções de emenda dentro do núcleo.
Este protocolo foi otimizado para isolar RNAs longos citoplasmáticos e nucleares, incluindo mRNAs, rRNAs e RNAs longos não codificantes (lncRNAs), devido à seletividade de tamanho da coluna de purificação de RNA utilizada, que pode ser modificada para isolar outros RNAs de interesse. Anteriormente, a função de RNAs longos, como mRNAs e lncRNAs, dependia muito de sua respectiva localização dentro da célula 4,5. Portanto, o estudo da exportação do núcleo para os domínios subcelulares tornou-se mais direcionado para a compreensão do papel que a exportação de RNA ou outros componentes celulares pode ter na célula. Os lncRNAs servem como um excelente exemplo disso, pois sua tradução e efeitos subsequentes dependem em grande parte da proximidade e interações com outras formas de RNA6. Além disso, a troca de elementos celulares entre regiões nucleares e citoplasmáticas está ligada a mecanismos de resistência a diversos tratamentos contra o câncer7. O isolamento dos compartimentos intracelulares tem permitido o desenvolvimento de inibidores nucleares de exportação, o que tem diminuído os efeitos dos mecanismos de resistência a diferentes terapias8.
Após a separação do RNA nuclear e citoplasmático, são realizadas etapas para purificar o RNA de interesse. Como os kits de purificação de RNA são comumente encontrados em laboratórios e funcionam para purificar e isolar RNAs longos, eles servem bem ao propósito deste protocolo. Para a purificação de RNA, gerar proporções de 260:280 maiores que 1,8 é fundamental para garantir a qualidade das amostras para sequenciamento de RNA ou outros procedimentos similares que exijam altos níveis de pureza e isolamento. Valores irregulares de 260:280 indicam contaminação por fenol, demonstrando mau isolamento e resultados imprecisos9.
Uma vez que a purificação do RNA esteja completa e os valores de 260:280 estejam confirmados acima de uma faixa aceitável, a qPCR foi utilizada para validar os resultados de isolamento das frações nuclear e citoplasmática. Para tanto, foram utilizados primers específicos para a região de interesse para demonstrar os níveis de fracionamento nuclear e citoplasmático. Nesse protocolo, MALAT1 e TUG1 foram utilizados como marcadores nucleares e citoplasmáticos, respectivamente10. Juntos, eles permitem a demonstração de altos níveis de fracionamento nuclear com MALAT1, enquanto o fracionamento citoplasmático deve ser baixo. Por outro lado, quando o TUG1 é usado, espera-se que os níveis de fracionamento citoplasmático sejam maiores do que os níveis de fracionamento nuclear.
Utilizando este protocolo, foi possível isolar RNAs com base em sua posição de ação dentro da célula. Devido ao amplo acesso a muitos materiais e à utilização de apenas tampão de lise e técnicas de centrifugação baseadas em densidade durante este experimento, a aplicabilidade a outros tipos de RNA e outros componentes celulares é generalizada. Isso pode fornecer informações importantes, lançando luz sobre eventos de expressão específicos do local que, de outra forma, seriam indistinguíveis sem separação.
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Protocol
As células K562 são utilizadas para o presente estudo. Este protocolo foi otimizado para funcionar para 1 x 10 6-5 x 106 milhões de células. No entanto, o procedimento pode ser ampliado para quantidades maiores de células, aumentando os volumes adequadamente.
1. Preparação do tampão de lise 0.25x
- Preparar tampão de lise 0,25x misturando os seguintes componentes fornecidos na Tabela 1A.
NOTA: As amostras requerem aproximadamente 300 μL de tampão de lise 0,25x. Volume recomendado = número de amostras x 300 μL.
2. Separação das frações nuclear e citoplasmática
- Pellet as células usando tubos de 1,5 mL via centrifugação por 5 min a 2000 x g (temperatura ambiente). Rejeitar o sobrenadante utilizando uma pipeta aspirante.
NOTA: As células K562 foram utilizadas durante este protocolo. No entanto, o protocolo pode ser adaptado a várias linhagens celulares. - Ressuscite o pellet em 300 μL de tampão de lise gelado 0,25x.
NOTA: Mantenha no gelo por 2 min e gire o tubo a cada 45 s para garantir a lise adequada das células. - Gire os tubos à velocidade mais alta (12.000 x g) a 4 °C durante 2 minutos.
- Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante e coloque-o em um novo tubo de 1,5 mL. Esta será a fração citoplasmática. Aproximadamente 300 μL da fração citoplasmática serão atingidos.
- O pellet restante será a fração nuclear. Adicionar 500 μL de PBS gelado ao pellet e centrifugar a 2.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
Observação : durante esta etapa, o excesso de DNA é removido.
3. Limpeza de RNA usando um kit de purificação de RNA
NOTA: Este protocolo foi alcançado utilizando um kit de purificação de RNA comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
- Separe as amostras de RNA citoplasmático e as amostras citoplasmáticas nucleares (pois as etapas de fracionamento variam entre elas).
- Para separar a fração citoplasmática, adicione 1.050 μL de tampão de lise RLT de 3,5x (ver Tabela de Materiais) e vórtice brevemente. Em seguida, adicione 750 μL de etanol a 90% e carregue-o na coluna do kit de limpeza de RNA.
NOTA: A solução deve ser bem misturada antes de ser carregada na coluna. - Para separar a fração nuclear, adicione 600 μL de tampão de lise 3,5x e vórtice. Em seguida, adicione 600 μL de etanol a 70%.
- Para separar a fração citoplasmática, adicione 1.050 μL de tampão de lise RLT de 3,5x (ver Tabela de Materiais) e vórtice brevemente. Em seguida, adicione 750 μL de etanol a 90% e carregue-o na coluna do kit de limpeza de RNA.
- Carregue frações citoplasmáticas e nucleares em colunas de RNA (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Para o restante da etapa 3, as amostras citoplasmáticas e nucleares seguem o mesmo procedimento. No entanto, certifique-se de que essas amostras permaneçam independentes umas das outras.- Carregue frações citoplasmáticas e nucleares em colunas de RNA e gire por 30 s a 8.000 x g à temperatura ambiente. Descarte o excesso de fluxo.
- Adicione 350 μL de tampão de lavagem de um kit de purificação comercialmente disponível (tampão RW1, consulte Tabela de Materiais), gire novamente e descarte o fluxo.
- Adicionar solução de DNAse (1U/uL) durante 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 350 μL de tampão de lavagem, gire novamente e descarte o fluxo.
- Adicione 500 μL de tampão de lavagem suave (PSE, consulte Tabela de materiais), gire novamente e descarte o fluxo. Adicione 500 μL de tampão de lavagem suave, gire novamente, mas apenas por 2 min.
- Mova a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 30 μL de água à coluna de spin. Deixe a coluna descansar por 1 minuto antes de girar.
4. Validação da separação nuclear-citoplasmática
- Realizar a síntese de cDNA
- Uma vez que os compartimentos subcelulares do RNA tenham sido extraídos e purificados, confirme a separação dos compartimentos usando qPCR. Para fazer isso, primeiro, converta o RNA em cDNA usando um kit comercialmente disponível seguindo as instruções do fabricante (consulte Tabela de Materiais).
- Prepare o mastermix da transcriptase reversa. Adicione o modelo de RNA. Incubar reações em um termociclador.
NOTA: Para hexâmeros aleatórios, os parâmetros de ciclagem utilizados são fornecidos no Quadro 2A. Utilizar imediatamente a reação da transcriptase reversa ou conservar a -20 °C (Tabela 1B).
- Realizar a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e análise.
- Diluir a síntese de cDNA com água DEPC (ver Tabela de Materiais) para ter uma concentração final de 20 ng/mL.
- Usando uma mistura mestra de PCR, prepare a reação para cada amostra usando instruções manuais, conforme listado abaixo.
- Adquirir sondas comerciais necessárias para detectar o fracionamento citoplasmático e nuclear. Use MALAT1 como marcador nuclear e TUG1 como marcador citoplasmático (ver Tabela de Materiais).
NOTA: As sequências para MALAT1 e TUG1 são fornecidas na Tabela 3. - Calcular o volume de cada componente multiplicando cada componente por 3 para cada uma das repetições técnicas para a amostra individual.
- Para cada amostra nuclear e citoplasmática, adquirir as seguintes misturas para cada uma: (a) Fração nuclear com MALAT1, (b) Fração citoplasmática com MALAT1, (c) Fração nuclear com TUG1 e (d) Fração citoplasmática com TUG1 (Tabela 1C).
- Vórtice brevemente para misturar soluções e transferir 20 μL da mistura para cada poço de uma placa de reação óptica (ver Tabela de Materiais).
- Cubra a placa com uma película adesiva transparente utilizada para qPCR (ver Tabela de Materiais) e centrifugar a placa brevemente para eliminar as bolhas de ar e, em seguida, girar a amostra para baixo a 300 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
- Usando um software de projeto e análise (consulte Tabela de Materiais), selecione a curva padrão para os parâmetros de ciclagem (Tabela 2B).
- Usando o software qPCR, selecione Configurar execução (Figura 1 Suplementar).
- Na página Propriedades do Arquivo de Dados, selecione Método e parâmetros do ciclo de entrada na Tabela 2B (Figura 2 Suplementar).
- Depois de inserir os parâmetros do ciclo, selecione a guia Placa e insira as amostras a serem executadas (Figura 3 Suplementar). Selecione Iniciar Execução.
NOTA: As etapas descritas foram executadas em uma máquina qPCR usando um master mix comercialmente disponível (consulte Tabela de Materiais).
- Realizar análise de dados
- Após a conclusão da execução, crie uma planilha de dados com o nome da amostra, o nome do destino e o ciclo de quantificação (Cq) (Tabela Suplementar 1).
- Comece com as amostras MALAT1 para calcular a fração nuclear. Subtraia a fração citoplasmática MALAT1 da fração nuclear MALAT1 (Tabela 4).
- Em seguida, calcule o ΔCq (2^(-value)) (Tabela 5).
- Continue com as amostras de MALAT1 para calcular a fração citoplasmática, subtraia a fração nuclear MALAT1 da fração citoplasmática MALAT1 e, em seguida, calcule o ΔCq (2^(-value)) (Tabela 6).
NOTA: Olhando para o ΔCq, observa-se que a fração MALAT1 nuclear (destaque verde) tem um marcador MALAT1 maior do que o citoplasma (realce vermelho), mas agora a confirmação é necessária para garantir que a fração citoplasmática é predominantemente citoplasmática e que a fração nuclear não contém contaminação citoplasmática. - Com amostras de TUG1, execute o mesmo cálculo acima (etapas 4.3.2-4.3.4) (Tabela 7).
NOTA: Olhando para o ΔCq, observa-se que a fração citoplasmática TUG1 (destaque verde) possui um marcador TUG1 maior que a fração nuclear (realce vermelho), confirmando assim uma boa separação das frações citoplasmática e nuclear (Tabela 8, Figura 1).
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Representative Results
Para garantir que o isolamento nuclear e citoplasmático tivesse sido alcançado, uma qPCR foi realizada para validar os resultados. Para tanto, foram utilizados primers específicos da região de interesse para demonstrar os níveis de fracionamento nuclear e citoplasmático. Neste estudo, MALAT1 e TUG1 foram utilizados como primers nucleares e citoplasmáticos, respectivamente. Juntos, eles permitem a demonstração de altos níveis de fracionamento nuclear com MALAT1 como um controle positivo para elementos nucleares, enquanto o fracionamento citoplasmático é esperado para ser baixo. Por outro lado, quando o TUG1 está presente como um controle positivo para elementos citoplasmáticos, espera-se que os níveis de fracionamento citoplasmático sejam maiores do que os níveis de fracionamento nuclear. Isso pode ser visto na Figura 2, um exemplo de um resultado positivo confirmando a separação do RNA Nuclear e Citoplasmático.
Um resultado negativo pode ser observado na Figura 3, na qual são observados níveis de fracionamento citoplasmático na amostra com MALAT1. Isso indica contaminação do RNA isolado da fração nuclear, potencialmente devido a concentrações de lise que são muito baixas ou muito altas. Este estudo também testou outros primers, mas MALAT1 e TUG1 apresentaram a maior correlação com a separação nuclear e citoplasmática, confirmada por meio de western blot e eletroforese de RNA, que confirmou a pureza e a qualidade das amostras (Figura 4 e Figura 5).
Além disso, a pureza dos extratos nuclear e citoplasmático pode ser demonstrada por um western blot utilizando a lamina como marcador para a fração nuclear e a alfa-tubulina como marcador positivo para a fração citoplasmática10, como mostra a Figura 4. Há uma expressão clara de lamina apenas dentro da fração nuclear, com uma expressão clara de alfa-tubulina dentro da fração citoplasmática, indicando pureza relativa dentro de cada amostra.
Devido à tendência do RNA de se degradar durante o processo de qPCR, é necessário confirmar a qualidade do rendimento de RNA usando eletroforese de RNA. A eletroforese de RNA foi realizada e demonstrou alta qualidade de RNA devido à presença de um pico na subunidade de RNAr 32S, que é uma característica presente apenas em frações nucleares. A presença deste pico indica pureza nuclear e fracionamento suficiente. Por outro lado, não foi observado pico na eletroforese do RNA citoplasmático, demonstrando alta qualidade e pouca ou nenhuma contaminação na amostra de RNA citoplasmático11 (Figura 5).
Figura 1: Esquema das etapas do protocolo. Depois que as células são tratadas, elas são lisadas e centrifugadas para isolamento. Em seguida, o isolamento de RNA é realizado e o cDNA é gerado antes da validação do isolamento utilizando qPCR. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dados de resultados positivos. A figura destaca o sucesso do protocolo exibido por altos níveis de separação de componentes nucleares e citoplasmáticos. MALAT1, um primer de RNA nuclear, exibiu níveis estatisticamente significativos mais elevados da fração nuclear. No TUG1, um primer de RNA citoplasmático, foram observados níveis estatisticamente mais elevados de fração citoplasmática. Alta significância estatística foi observada em ambas as amostras pelo teste t. p < 0,0001. As barras de erro indicam desvio padrão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dados de resultados negativos. A figura destaca um exemplo de resultados negativos usando protocolo exibidos por altos níveis de separação de componentes nucleares e citoplasmáticos. MALAT1, um primer de RNA nuclear, exibiu níveis de fração citoplasmática causados por contaminação nuclear. Não são observadas diferenças na significância estatística entre as frações via teste t. As barras de erro indicam desvio padrão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Western Blot demonstrando a pureza das frações citoplasmáticas e nucleares. A figura destaca uma mancha ocidental das frações nuclear e citoplasmática. A lamina foi usada para verificar a pureza da amostra nuclear, enquanto a alfa-tubulina foi usada para demonstrar a pureza da fração citoplasmática. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Confirmação da pureza do RNA das Frações Citoplasmática e Nuclear via eletroforese de RNA. (A) Eletroforese de RNA da fração nuclear. Arrow demonstra o rRNA 32S, que só é observado em frações nucleares. (B) Eletroforese de RNA da fração citoplasmática. A ausência de um pico de 32S indica a pureza do RNA da fração citoplasmática. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Composição do tampão de lise, misturas de reação e amostras. (A) Composição do tampão de lise 0,25x. (B) Composição da mistura de transcriptase reversa utilizada durante a transcrição do RNA para o cDNA. (C) Composição de amostras nucleares e citoplasmáticas utilizando um kit de transcriptase reversa. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Parâmetros cíclicos. (A) Os parâmetros de ciclagem para o termociclador. Esses parâmetros foram utilizados durante a qPCR para amplificação da sequência alvo. (B) Os parâmetros de ciclagem para amostras nucleares e citoplasmáticas. Esses parâmetros foram utilizados durante a qPCR para amplificação da sequência alvo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 3: Sequências de marcadores nucleares e citoplasmáticos. A tabela inclui as sequências dos marcadores utilizados para confirmar a separação nuclear e citoplasmática. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 4: Procedimento de subtração das frações nuclear e citoplasmática MALAT1. Um exemplo de folha de dados utilizada para subtrair a fração nuclear MALAT1 - fração citoplasmática MALAT1. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Quadro 5: Procedimento de cálculo do ΔCq (2^(-value). Um exemplo da folha de dados utilizada para calcular o ΔCq (2^(-value)). Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 6: Procedimento para o cálculo da fração citoplasmática. Um exemplo da folha de dados utilizada para calcular a fração citoplasmática. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Quadro 7: Procedimento de cálculo da fracção nuclear. Um exemplo da folha de dados utilizada para calcular a fração nuclear. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 8: Procedimento para confirmação do resultado bem-sucedido do fracionamento. Um exemplo de folha de dados utilizada para verificar o fracionamento bem-sucedido. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Figura 1 Suplementar: Imagem do software de projeto e análise de máquinas qPCR. Uma imagem demonstrando o funcionamento da máquina qPCR. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 suplementar: Imagem do qPCR "Propriedades do arquivo de dados". Uma imagem demonstrando o procedimento para configurar parâmetros para execução de qPCR. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 3 suplementar: Imagem do carregamento de amostras na máquina qPCR. Uma imagem demonstrando o procedimento para adicionar amostras ao software qPCR para análise. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela 1 suplementar: Folha de dados de nome de exemplo. Um exemplo de folha de dados com o nome do exemplo, o nome do destino e o valor Cq. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Ao longo do protocolo, algumas medidas foram tomadas para otimizar os elementos para serem mais eficazes para a linhagem celular de interesse. Embora as etapas dentro do protocolo sejam relativamente simples, análises e pequenos ajustes durante aspectos críticos do protocolo podem ser necessários. A etapa mais crítica do protocolo é modificar a concentração do tampão de lise para uma concentração adequada com base na linhagem celular de interesse e no alvo celular. Como a utilização do tampão de lise depende em grande parte da ruptura das membranas celulares, há uma variação natural na eficácia do tampão de lise em diferentes linhagens celulares, pois há pequenas diferenças na fragilidade celular e na permeabilidade da membrana entre diferentes linhagens celulares12. Começando com uma linha de base de tampão de lise 1x, as etapas do protocolo foram realizadas enquanto diminuíam gradualmente a concentração do tampão de lise para 0,25x, o que justificava resultados mais eficazes. Como o experimento visa isolar um grande número de componentes subcelulares, garantir que a concentração de tampão de lise seja otimizada para a linhagem celular de interesse é fundamental para alcançar o maior rendimento e os melhores resultados.
Além do ajuste das concentrações do tampão de lise, é importante notar a fragilidade do RNA e a cautela do estresse durante o isolamento do RNA. O RNA é mais vulnerável à degradação do que o DNA e muitos outros elementos celulares, pois seu grupo hidroxila 2' pode servir como um ponto de ligação para as RNases, uma família de enzimas que podem degradar o RNA e levar a maus resultados. As RNases são altamente capazes de degradação do RNA, mesmo quando apresentadas em pequenas quantidades13. Como as RNases são liberadas das células durante e após as etapas de lise, deve-se ter cautela para evitar a contaminação, o que pode levar à degradação indesejada do RNA14. As etapas incluem o uso de luvas durante o experimento e a troca frequente para evitar a transmissão de RNases do ambiente ou superfícies para amostras. Além disso, soluções livres de RNase devem ser utilizadas e um espaço de trabalho separado deve ser usado ao manipular o RNA. Finalmente, uma vez que a RNase pode ser muito resistente ao tampão de lise e à desnaturação, os inibidores da RNase podem ser utilizados para mitigar seus efeitos negativos no isolamento do RNA15.
Embora as etapas durante o protocolo tenham produzido resultados altamente bem-sucedidos, existem algumas limitações. Para começar, enquanto o RNA e os componentes citoplasmáticos podem ser amplamente isolados um do outro, os dois não podem ser totalmente separados sem comprometer a qualidade do RNA para estudo. Devido a isso, qualquer conclusão baseada em diferenças na atividade ou função de moléculas dessas regiões separadas pode ser ligeiramente distorcida pela incapacidade de derivar amostras totalmente isoladas. Também é importante ressaltar que, se o protocolo for adaptado a outras moléculas celulares, como proteínas, algumas proteínas ou outros elementos celulares podem ser degradados durante a separação dos extratos nucleares, levando a uma perda de atividade e afetando os resultados16. Também é importante ressaltar que, durante esse protocolo, a qPCR das frações nuclear e citoplasmática utilizando MALAT1 e TUG1 foi realizada simplesmente como validação da pureza e qualidade das amostras. Para expandir essa ideia, as proporções relativas de RNA nuclear e citoplasmático não foram analisadas ou comparadas durante este protocolo, pois foi utilizado apenas para fins de validação. Esse protocolo pode ser adaptado, no entanto, a outros usos, como a comparação das proporções relativas das frações nuclear e citoplasmática, mas esses valores devem ser normalizados para a quantidade de RNA total para uma análise ou comparação precisa. As etapas para normalização das frações citoplasmáticas e nucleares para os níveis de RNA total já foram descritas anteriormente em outros protocolos11.
No entanto, como mencionado anteriormente, este método utiliza materiais de laboratório comuns para gerar extratos de RNA de alta qualidade de forma econômica. Além disso, este método de estudo das interações nucleares e citoplasmáticas prova estar entre os procedimentos mais eficazes no tempo. O uso de kits de pureza de RNA leva a uma limpeza de RNA muito eficaz e ajuda a garantir altos níveis de isolamento de RNA de diferentes regiões celulares, levando a amostras mais eficazes para estudar. Finalmente, a adaptabilidade deste protocolo apresenta-se como uma vantagem fundamental, uma vez que a modificação da concentração do tampão de lise pode dar acesso ao estudo de muitas linhagens celulares diferentes, e uma técnica de separação de densidade, como a centrifugação, pode levar ao isolamento de vários elementos celulares diferentes. À medida que os estudos sobre interações citoplasmáticas e nucleares se tornam mais difundidos, o impacto da localização nos componentes celulares pode se tornar melhor compreendido. A troca entre o citoplasma e o núcleo pode ser analisada, indicando se determinadas moléculas durante essas trocas podem levar ao desenvolvimento do câncer, como têm indicado estudos sobre proteínas nucleares como aXPO1 17.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Apoiado por doações da Sociedade Americana de Hematologia, da Fundação Robert Wood Johnson, da Fundação de Caridade Doris Duke, da Fundação Edward P. Evans e do Instituto Nacional do Câncer (1K08CA230319).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent Tapestation | Agilent | G2991BA | The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples. |
| 0.5% Nonidet P-40 | Thermo-Fischer | 28324 | Used in the making of lysis buffer |
| 50 mM Tris-Cl pH 8.0 | Thermo-Fischer | 15568025 | Used in the making of lysis buffer |
| MALAT1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00273907_s1 | Utilized for confirmation of Nuclear fraction. |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode | Thermo-Fischer | 4326659 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo-Fischer | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR |
| PBS | Gibco | 20012-023 | Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents. |
| Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol. |
| QuantStudio 6 | Thermo-Fischer | A43180 | qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | Lysis Buffer from RNA clean-up kit |
| RPE Buffer | Qiagen | 1018013 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| RW1 Buffer | Qiagen | 1053394 | Wash Buffer from RNA clean-up kit |
| Taqman Gene Expression Assays | Thermo-Fischer | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves. |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo-Fischer | 4305719 | TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time. |
| TUG1 GE Assay | Thermo-Fischer | Hs00215501_m1 | Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction. |
| UltraPure DEPC-Treated Water | Thermo-Fischer | 750024 | UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered. |
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