Fremstilling af cytoplasmatiske og nukleare lange RNA'er fra primære og dyrkede celler

Summary

Denne protokol tilbyder en effektiv og fleksibel metode til at isolere RNA fra nukleare og cytoplasmatiske fraktioner ved hjælp af dyrkede celler og derefter validere ved hjælp af qPCR. Dette tjener effektivt som erstatning for andre RNA-præparationssæt.

Abstract

Adskillelsen af intracellulære komponenter har været et centralt værktøj i cellulær biologi i mange år nu og har været i stand til at give nyttig indsigt i, hvordan deres placering kan påvirke deres funktion. Især er adskillelsen af nukleært og cytoplasmatisk RNA blevet vigtig i forbindelse med kræftceller og søgen efter at finde nye mål for lægemidler. Indkøbssæt til nuklear-cytoplasmatisk RNA-ekstraktion kan være dyrt, når mange af de krævede materialer kan findes inden for en typisk laboratorieindstilling. Ved hjælp af den nuværende metode, som kan erstatte dyrere kits eller andre tidskrævende processer, er der kun behov for en hjemmelavet lysisbuffer, en benchtopcentrifuge og RNA-isolationsrensningskolonner for at isolere nukleært og cytoplasmatisk RNA. Lysisbuffer bruges til forsigtigt at lyse cellens ydre membran uden at påvirke integriteten af den nukleare kappe, hvilket muliggør frigivelse af dets intracellulære komponenter. Derefter kan kernerne isoleres ved et simpelt centrifugeringstrin, da de har en højere densitet end lysisopløsningen. Centrifugering anvendes til at adskille disse områder baseret på deres densitetsforskelle for at isolere subcellulære elementer i kernen fra dem i cytoplasmaet. Når centrifugeringen har isoleret de forskellige komponenter, anvendes et RNA-oprydningssæt til at rense RNA-indholdet, og qPCR udføres for at validere separationskvaliteten, kvantificeret ved mængden af nukleært og cytoplasmatisk RNA i de forskellige fraktioner. Der blev opnået statistisk signifikante separationsniveauer, hvilket illustrerer protokollens effektivitet. Derudover kan dette system tilpasses til isolering af forskellige typer RNA (totalt, lille RNA osv.), Hvilket muliggør målrettet undersøgelse af cytoplasma-kerneinteraktioner og hjælper med at forstå forskellene i funktionen af RNA, der befinder sig i kernen og cytoplasmaet.

Introduction

Cellulær fraktionering i subcellulære komponenter muliggør isolering og undersøgelse af definerede biokemiske domæner og hjælper med at bestemme lokaliseringen af specifikke cellulære processer, og hvordan dette kan påvirke deres funktion¹. Isolering af RNA fra forskellige intracellulære steder kan muliggøre forbedret nøjagtighed af genetisk og biokemisk analyse af transkriptionsniveauhændelser og andre interaktioner mellem kernen og cytoplasmaet, hvilket tjener som det primære formål med den nuværende protokol². Denne protokol blev udviklet for at sikre isolering af cytoplasmatiske og nukleare RNA'er for at bestemme deres respektive roller i nuklear eksport og for at forstå, hvordan den subcellulære lokalisering af RNA'er i kernen og cytoplasma kan påvirke deres funktion i cellulære processer. Ved hjælp af materialer fra en typisk laboratorieindstilling var det muligt at opnå nuklear og cytoplasmatisk fraktionering mere effektivt og billigere end tidligere etablerede protokoller uden at bringe kvaliteten af resultaterne^{i fare 3}.

Derudover kan udvekslingen af molekyler mellem cytoplasma og kernen studeres direkte ved at adskille disse regioner. Mere specifikt er forståelse af transkriptomet afgørende for at forstå udvikling og sygdom. RNA'er kan dog være på forskellige modningsniveauer til enhver tid og kan komplicere nedstrømsanalyse. Denne protokol giver mulighed for at isolere RNA fra nukleare og cytoplasmatiske subcellulære fraktioner, hvilket kan hjælpe med undersøgelser af RNA og give mulighed for en bedre forståelse af et bestemt RNA af interesse, såsom lokalisering af ikke-kodende RNA'er eller analyse af splejsningskryds i kernen.

Denne protokol er optimeret til isolering af cytoplasmatiske og nukleare lange RNA'er, herunder mRNA'er, rRNA'er og lange ikke-kodende RNA'er (lncRNA'er) på grund af størrelseselektiviteten af den anvendte RNA-oprensningskolonne, som kan modificeres for at isolere andre RNA'er af interesse. Tidligere var funktionen af lange RNA'er, såsom mRNA'er og lncRNA'er, stærkt afhængig af deres respektive lokalisering i cellen ^4,5. Derfor er undersøgelsen af eksporten fra kernen til subcellulære domæner blevet mere målrettet mod at forstå den rolle, som eksport af RNA eller andre cellulære komponenter kan have på cellen. lncRNA'er tjener som et glimrende eksempel på dette, da deres oversættelse og efterfølgende virkninger i vid udstrækning afhænger af nærhed og interaktioner med andre former for RNA⁶. Desuden er udvekslingen af cellulære elementer mellem nukleare og cytoplasmatiske regioner knyttet til resistensmekanismer over for forskellige kræftbehandlinger⁷. Isoleringen af intracellulære rum har muliggjort udviklingen af nukleare eksporthæmmere, hvilket har mindsket virkningerne af resistensmekanismer over for forskellige terapier⁸.

Efter adskillelse af nukleært og cytoplasmatisk RNA udføres trin for at rense RNA'et af interesse. Da RNA-oprensningssæt almindeligvis findes i laboratorier og fungerer til at rense og isolere lange RNA'er, tjener de formålet med denne protokol godt. For RNA-oprensning er generering af 260:280-forhold større end 1,8 afgørende for at sikre kvaliteten af prøver til RNA-sekventering eller andre lignende procedurer, der kræver høje niveauer af renhed og isolering. Uregelmæssige værdier på 260:280 indikerer phenolkontaminering, hvilket viser dårlig isolering og giver unøjagtige resultater⁹.

Når RNA-oprensning er afsluttet, og 260: 280-værdier er bekræftet at være over et acceptabelt interval, blev qPCR brugt til at validere isolationsresultaterne af nukleare og cytoplasmatiske fraktioner. Dermed blev primere, der var specifikke for interesseområdet, brugt til at demonstrere de nukleare og cytoplasmatiske fraktioneringsniveauer. I denne protokol blev MALAT1 og TUG1 anvendt som henholdsvis nukleare og cytoplasmatiske markører¹⁰. Sammen giver de mulighed for demonstration af høje niveauer af nuklear fraktionering med MALAT1, mens cytoplasmatisk fraktionering forventes at være lav. Omvendt, når TUG1 anvendes, forventes cytoplasmatiske fraktioneringsniveauer at være højere end nukleare fraktioneringsniveauer.

Ved hjælp af denne protokol var det muligt at isolere RNA'er baseret på deres virkningsposition i cellen. På grund af udbredt adgang til mange materialer og anvendelse af kun lysisbuffer og densitetsbaserede centrifugeringsteknikker under dette eksperiment er anvendelighed til andre RNA-typer og andre cellulære komponenter udbredt. Dette kan give vigtige oplysninger ved at kaste lys over placeringsspecifikke udtrykshændelser, der ellers ikke ville kunne skelnes uden adskillelse.

Protocol

K562-celler anvendes til denne undersøgelse. Denne protokol er optimeret til at fungere for 1 x 10 6-5 x 10⁶ millioner celler. Proceduren kan dog skaleres op til større cellemængder ved at øge volumenerne korrekt.

1. Fremstilling af 0,25x lysisbufferen

1. Der fremstilles 0,25x lysisbuffer ved at blande følgende komponenter i tabel 1A.
   BEMÆRK: Prøver kræver ca. 300 μL 0,25x lysisbuffer. Anbefalet volumen = antal prøver x 300 μL.

2. Adskillelse af nukleare og cytoplasmatiske fraktioner

1. Ppellet cellerne ved hjælp af 1,5 ml rør via centrifugering i 5 minutter ved 2000 x g (stuetemperatur). Supernatanten kasseres med en sugepipette.
   BEMÆRK: K562-celler blev brugt under denne protokol. Protokollen kan dog tilpasses forskellige cellelinjer.
2. Resuspender pellet i 300 μL iskold 0,25x lysisbuffer.
   BEMÆRK: Hold på is i 2 minutter og drej røret hver 45. s for at sikre korrekt lysering af cellerne.
3. Drej rørene ved højeste hastighed (12.000 x g) ved 4 °C i 2 min.
4. Efter centrifugeringen fjernes supernatanten forsigtigt og anbringes i et nyt 1,5 ml glas. Dette vil være den cytoplasmatiske fraktion. Ca. 300 μL af den cytoplasmatiske fraktion opnås.
5. Den resterende pellet vil være den nukleare fraktion. Tilsæt 500 μL iskold PBS til pelleten og centrifuger ved 2.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
   BEMÆRK: I løbet af dette trin fjernes overskydende DNA.

3. RNA-oprydning ved hjælp af et RNA-rensningssæt

BEMÆRK: Denne protokol blev opnået ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt RNA-oprensningssæt (se materialetabel).

1. Adskil de cytoplasmatiske RNA-prøver og de nukleare cytoplasmatiske prøver (da fraktioneringstrinnene varierer mellem dem).
   1. For at adskille den cytoplasmatiske fraktion tilsættes 1.050 μL 3,5x RLT-lysisbuffer (se materialetabel) og hvirvel kort. Derefter tilsættes 750 μL 90% ethanol og lægges på søjlen fra RNA-oprydningssættet.
      BEMÆRK: Opløsningen skal blandes godt, inden den lægges på søjlen.
   2. For at adskille den nukleare fraktion tilsættes 600 μL 3,5x lysisbuffer og hvirvel. Derefter tilsættes 600 μL 70% ethanol.
2. Indlæs både cytoplasmatiske og nukleare fraktioner på RNA-søjler (se materialetabel).
   BEMÆRK: I resten af trin 3 følger både de cytoplasmatiske og nukleare prøver den samme procedure. Sørg dog for, at disse prøver forbliver uafhængige af hinanden.
   1. Læg både cytoplasmatiske og nukleare fraktioner på RNA-søjler og drej i 30 s ved 8.000 x g ved stuetemperatur. Kassér det overskydende flow igennem.
   2. Tilsæt 350 μL vaskebuffer fra et kommercielt tilgængeligt rensningssæt (RW1-buffer, se materialetabellen), drej igen, og kassér gennemstrømningen.
   3. Tilsæt DNAse-opløsning (1U/uL) i 15 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt derefter 350 μL vaskebuffer, drej igen, og kassér gennemstrømningen.
   4. Tilsæt 500 μL mild vaskebuffer (RPE, se materialetabel), drej igen, og kassér gennemløbet. Tilsæt 500 μL mild vaskebuffer, drej igen, men kun i 2 min.
   5. Flyt søjlen til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og tilsæt 30 μL vand til centrifugeringssøjlen. Lad søjlen sidde i 1 min, inden den snurrer ned.

4. Validering af nuklear cytoplasmatisk separation

1. Udfør cDNA-syntese
   1. Når subcellulære rum af RNA er blevet ekstraheret og renset, skal du bekræfte adskillelsen af rummene ved hjælp af qPCR. For at gøre dette skal du først konvertere RNA'et til cDNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt efter producentens anvisninger (se materialetabel).
   2. Forbered omvendt transkriptase mastermix. Tilføj skabelon-RNA. Inkubere reaktioner i en termocykler.
      BEMÆRK: For tilfældige hexamerer er de anvendte cykelparametre angivet i tabel 2A. Der anvendes straks den omvendte transkriptasereaktion, eller den opbevares ved -20 °C (tabel 1B).
2. Udfør den kvantitative polymerasekædereaktion (qPCR) og analyse.
   1. Fortynd cDNA-syntesen med DEPC-vand (se materialetabellen) for at opnå en slutkoncentration på 20 ng/ml.
   2. Brug en PCR-masterblanding til at forberede reaktionen for hver prøve ved hjælp af manuelle instruktioner som anført nedenfor.
   3. Erhverv kommercielle sonder, der er nødvendige for at detektere cytoplasmatisk og nuklear fraktionering. Brug MALAT1 som den nukleare markør og TUG1 som den cytoplasmatiske markør (se materialetabel).
      BEMÆRK: Sekvenser for MALAT1 og TUG1 er angivet i tabel 3.
   4. Hver komponents volumen beregnes ved at gange hver komponent med 3 for hver af de tekniske replikater for den enkelte prøve.
   5. For hver nuklear og cytoplasmatisk prøve erhverves følgende blandinger for hver: (a) nuklear fraktion med MALAT1, (b) cytoplasmatisk fraktion med MALAT1, (c) nuklear fraktion med TUG1 og (d) cytoplasmatisk fraktion med TUG1 (tabel 1C).
   6. Vortex kort for at blande opløsninger og overføre 20 μL af blandingen til hvert hul i en optisk reaktionsplade (se materialetabel).
   7. Dæk pladen med en klar klæbende film, der anvendes til qPCR (se materialetabellen), og centrifuger pladen kort for at fjerne luftbobler, og drej derefter prøven ned ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
   8. Brug design- og analysesoftware (se materialetabel) til at vælge standardkurven for cykelparametrene (tabel 2B).
   9. Brug qPCR-software til at vælge Konfigurer kørsel (supplerende figur 1).
   10. På siden Egenskaber for datafil skal du vælge Metode - og inputcyklusparametre fra tabel 2B (supplerende figur 2).
   11. Når du har indtastet cyklusparametre, skal du vælge fanen Plade og indtaste de prøver, der skal køres (supplerende figur 3). Vælg Start Kør.
       BEMÆRK: De beskrevne trin blev udført i en qPCR-maskine ved hjælp af en kommercielt tilgængelig masterblanding (se materialetabel).
3. Udfør dataanalyse
   1. Når kørslen er fuldført, skal du oprette et dataregneark med eksempelnavn, målnavn og kvantificeringscyklus (Cq) (supplerende tabel 1).
   2. Begynd med MALAT1-prøverne for at beregne den nukleare fraktion. Træk MALAT1 cytoplasmatisk fraktion fra MALAT1 nuklear fraktion (tabel 4).
   3. Beregn derefter ΔCq (2^(-værdi)) (tabel 5).
   4. Fortsæt med MALAT1-prøverne for at beregne den cytoplasmatiske fraktion, træk MALAT1-kernefraktionen fra MALAT1-cytoplasmatisk fraktion, og beregn derefter ΔCq (2^ (-værdi)) (tabel 6).
      BEMÆRK: Når man ser på ΔCq, observeres det, at den nukleare MALAT1-fraktion (grøn fremhævning) har en større MALAT1-markør end cytoplasmaet (rød fremhævning), men nu kræves bekræftelse for at sikre, at den cytoplasmatiske fraktion overvejende er cytoplasma, og at den nukleare fraktion ikke indeholder cytoplasmatisk forurening.
   5. Med TUG1-prøver udføres den samme beregning som ovenfor (trin 4.3.2-4.3.4) (tabel 7).
      BEMÆRK: Når man ser på ΔCq, observeres det, at den cytoplasmatiske TUG1-fraktion (grøn fremhævning) har en større TUG1-markør end den nukleare fraktion (rød fremhævning), hvilket bekræfter god adskillelse af cytoplasmatiske og nukleare fraktioner (tabel 8, figur 1).

Representative Results

For at sikre, at nuklear og cytoplasmatisk isolering var opnået, blev der udført en qPCR for at validere resultaterne. Dermed blev primere, der var specifikke for interesseområdet, brugt til at demonstrere de nukleare og cytoplasmatiske fraktioneringsniveauer. I denne undersøgelse blev MALAT1 og TUG1 anvendt som henholdsvis nukleare og cytoplasmatiske primere. Sammen giver de mulighed for demonstration af høje niveauer af nuklear fraktionering med MALAT1 som en positiv kontrol for nukleare elementer, mens cytoplasmatisk fraktionering forventes at være lav. Omvendt, når TUG1 er til stede som en positiv kontrol for cytoplasmatiske elementer, forventes cytoplasmatiske fraktioneringsniveauer at være højere end nukleare fraktioneringsniveauer. Dette kan ses i figur 2, et eksempel på et positivt resultat, der bekræfter nuklear og cytoplasmatisk RNA-separation.

Et negativt resultat kan ses i figur 3, hvor niveauer af cytoplasmatisk fraktionering observeres i prøven med MALAT1. Dette indikerer forurening af RNA isoleret fra den nukleare fraktion, potentielt på grund af lysiskoncentrationer, der er for lave eller for høje. Denne undersøgelse testede også andre primere, men MALAT1 og TUG1 udviste den højeste korrelation med nuklear og cytoplasmatisk separation, som bekræftet gennem en vestlig blot- og RNA-elektroforese, som bekræftede renheden og kvaliteten af prøverne (figur 4 og figur 5).

Derudover kan renheden af nukleare og cytoplasmatiske ekstrakter påvises ved en western blot, der bruger lamin som markør for nuklear fraktion og alfa-tubulin som en positiv markør for den cytoplasmatiske fraktion¹⁰, som vist i figur 4. Der er et klart udtryk for lamin udelukkende inden for den nukleare fraktion med et klart udtryk for alfa-tubulin inden for den cytoplasmatiske fraktion, hvilket indikerer relativ renhed inden for hver prøve.

På grund af RNA's tendens til at nedbrydes under qPCR-processen er det nødvendigt at bekræfte kvaliteten af RNA-udbyttet ved anvendelse af RNA-elektroforese. RNA-elektroforese blev udført og demonstrerede en høj kvalitet af RNA på grund af tilstedeværelsen af en top ved 32S rRNA-underenheden, som er en funktion, der kun er til stede i nukleare fraktioner. Tilstedeværelsen af denne top indikerer nuklear renhed og tilstrækkelig fraktionering. Omvendt blev der ikke observeret nogen top i den cytoplasmatiske RNA-elektroforese, hvilket viste høj kvalitet og ringe eller ingen forurening i den cytoplasmatiske RNA-prøve¹¹ (figur 5).

Figur 1: Skematisk oversigt over protokoltrin. Efter at cellerne er behandlet, lyseres de og centrifugeres til isolering. Dernæst udføres RNA-isolering, og cDNA genereres før validering af isolation ved hjælp af qPCR. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Data for positive resultater. Figuren fremhæver protokolsucces udstillet ved høje niveauer af adskillelse af nukleare og cytoplasmatiske komponenter. MALAT1, en nuklear RNA-primer, udviste statistisk signifikante højere niveauer af den nukleare fraktion. I TUG1, en cytoplasmatisk RNA-primer, blev statistisk signifikante højere niveauer af cytoplasmatisk fraktion observeret. Høj statistisk signifikans blev observeret i begge prøver via t-test. p < 0,0001. Fejlbjælker angiver standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Data for negative resultater. Figuren fremhæver et eksempel på negative resultater ved anvendelse af protokol udstillet ved høje niveauer af adskillelse af nukleare og cytoplasmatiske komponenter. MALAT1, en nuklear RNA-primer, udviste cytoplasmatiske fraktionsniveauer forårsaget af nuklear forurening. Der observeres ingen forskelle i statistisk signifikans mellem fraktionerne via t-test. Fejlbjælker angiver standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Western Blot, der demonstrerer renheden af cytoplasmatiske og nukleare fraktioner. Figuren fremhæver en vestlig blottelse af de nukleare og cytoplasmatiske fraktioner. Lamin blev brugt til at verificere kerneprøvens renhed, mens alfa-tubulin blev brugt til at demonstrere renheden af den cytoplasmatiske fraktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Bekræftelse af RNA-renhed af cytoplasmatiske og nukleare fraktioner via RNA-elektroforese. (A) RNA-elektroforese af den nukleare fraktion. Pil demonstrerer 32S rRNA, som kun observeres i nukleare fraktioner. (B) RNA-elektroforese af den cytoplasmatiske fraktion. Fraværet af en 32S-top indikerer RNA-renhed af cytoplasmatisk fraktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sammensætning af lysisbuffer, reaktionsblandinger og prøver. (A) Sammensætning af 0,25x lysisbuffer. (B) Sammensætning af revers transkriptaseblanding anvendt under transkription af RNA til cDNA. C) Sammensætning af nukleare og cytoplasmatiske prøver ved anvendelse af et revers transkriptasesæt. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Cykliske parametre. (A) Cykelparametrene for termocykliske. Disse parametre blev brugt under qPCR til forstærkning af målsekvensen. B) Cyklusparametrene for nukleare og cytoplasmatiske prøver. Disse parametre blev brugt under qPCR til forstærkning af målsekvensen. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Sekvenser af nukleare og cytoplasmatiske markører. Tabellen indeholder sekvenserne af de markører, der anvendes til at bekræfte nuklear og cytoplasmatisk separation. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Procedure til fratrækning af MALAT1 nukleare og cytoplasmatiske fraktioner. Et eksempel på datablad, der anvendes til at trække MALAT1 nuklear fraktion - MALAT1 cytoplasmatisk fraktion. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 5: Procedure til beregning af ΔCq (2^(-værdi). Et eksempel på databladet, der bruges til at beregne ΔCq (2^(-værdi)). Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 6: Procedure til beregning af cytoplasmatisk fraktion. Et eksempel på databladet, der anvendes til at beregne den cytoplasmatiske fraktion. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 7: Procedure til beregning af nuklear fraktion. Et eksempel på databladet, der bruges til at beregne den nukleare fraktion. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 8: Procedure til bekræftelse af vellykket fraktioneringsresultat. Et eksempel på datablad, der bruges til at verificere vellykket fraktionering. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur 1: Billede af qPCR-maskindesign og analysesoftware. Et billede, der demonstrerer betjeningen af qPCR-maskinen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Billede af qPCR "Datafilegenskaber". Et billede, der viser proceduren for opsætning af parametre til qPCR-kørsel. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Billede af ilægning af prøver i qPCR-maskinen. Et billede, der demonstrerer proceduren for tilføjelse af prøver til qPCR-softwaren til analyse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Datablad for eksempelnavn. Et eksempel på dataark med eksempelnavn, målnavn og Cq-værdi. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I hele protokollen blev der taget nogle skridt til at optimere elementerne for at være mest effektive for cellelinjen af interesse. Mens trinene i protokollen er relativt ligetil, kan analyse og mindre justeringer under kritiske aspekter af protokollen være nødvendige. Det mest kritiske trin i protokollen er at ændre koncentrationen af lysisbufferen til en korrekt koncentration baseret på cellelinjen af interesse og det cellulære mål. Da udnyttelsen af lysisbuffer i høj grad afhænger af forstyrrelsen af cellemembraner, er der naturlig varians i effektiviteten af lysisbuffer på forskellige cellelinjer, da der er små forskelle i celleskrøbelighed og membranpermeabilitet mellem forskellige cellelinjer¹². Startende med en baseline på 1x lysisbuffer blev trinene i protokollen udført, mens koncentrationen af lysisbufferen gradvist faldt til 0,25x, hvilket berettigede mere effektive resultater. Da eksperimentet sigter mod i sidste ende at isolere et stort antal subcellulære komponenter, er det afgørende at sikre, at koncentrationen af lysisbuffer er optimeret til cellelinjen af interesse for at opnå det højeste udbytte og de bedste resultater.

Ud over justeringen af lysisbufferkoncentrationer er det vigtigt at bemærke skrøbeligheden af RNA og understrege forsigtighed under isoleringen af RNA. RNA er mere sårbart over for nedbrydning end DNA og mange andre cellulære elementer, da dets 2'hydroxylgruppe kan tjene som et bindingspunkt for RNaser, en familie af enzymer, der kan nedbryde RNA og føre til dårlige resultater. RNaser er i høj grad i stand til RNA-nedbrydning, selv når de præsenteres i mindre mængder¹³. Da RNaser frigives fra celler under og efter lysistrin, skal der udvises forsigtighed for at forhindre kontaminering, hvilket kan føre til uønsket RNA-nedbrydning¹⁴. Trinene inkluderer at bære handsker under eksperimentet og ændre disse ofte for at undgå at overføre RNaser fra miljøet eller overflader til prøver. Derudover bør RNase-fri opløsninger anvendes, og der bør anvendes et separat arbejdsområde ved håndtering af RNA. Endelig, da RNase kan være meget modstandsdygtig over for lysisbuffer og denaturering, kan RNase-hæmmere bruges til at afbøde deres negative virkninger på RNA-isolering¹⁵.

Mens trinene under protokollen gav meget vellykkede resultater, er der nogle begrænsninger. Til at begynde med, mens RNA og cytoplasmatiske komponenter stort set kan isoleres fra hinanden, kan de to ikke adskilles fuldstændigt uden at bringe kvaliteten af RNA'et til undersøgelse i fare. På grund af dette kan enhver konklusion baseret på forskelle i aktiviteten eller funktionen af molekyler fra disse separate regioner være skæv lidt af manglende evne til at udlede fuldt isolerede prøver. Det er også vigtigt at bemærke, at hvis protokollen er tilpasset andre cellemolekyler, såsom proteiner, kan nogle proteiner eller andre cellulære elementer nedbrydes under adskillelsen af nukleare ekstrakter, hvilket fører til tab af aktivitet og påvirker ens resultater¹⁶. Det er også vigtigt at bemærke, at qPCR af de nukleare og cytoplasmatiske fraktioner under anvendelse af MALAT1 og TUG1 under denne protokol blev udført simpelthen som validering af prøvernes renhed og kvalitet. For at udvide denne ide blev de relative proportioner af nukleært og cytoplasmatisk RNA ikke analyseret eller sammenlignet under denne protokol, da den udelukkende blev brugt med henblik på validering. Denne protokol kan imidlertid tilpasses til andre anvendelser, såsom sammenligning af de relative proportioner af nukleare og cytoplasmatiske fraktioner, men disse værdier skal normaliseres til mængden af total RNA for en nøjagtig analyse eller sammenligning. Trinene til normalisering af cytoplasmatiske og nukleare fraktioner til samlede RNA-niveauer er tidligere beskrevet i andre protokoller¹¹.

Som tidligere nævnt bruger denne metode imidlertid almindelige laboratoriematerialer til at generere RNA-ekstrakter af høj kvalitet omkostningseffektivt. Denne metode til at studere nukleare og cytoplasmatiske interaktioner viser sig også at være blandt de mest tidseffektive procedurer. Brug af RNA-renhedssæt fører til meget effektiv RNA-oprydning og hjælper med at sikre høje niveauer af RNA-isolering fra forskellige cellulære regioner, hvilket fører til mere effektive prøver at studere. Endelig præsenterer tilpasningsevnen af denne protokol sig som en vigtig fordel, da ændring af lysisbufferkoncentrationen kan give adgang til undersøgelsen af mange forskellige cellelinjer, og en densitetsseparationsteknik såsom centrifugering kan føre til isolering af flere forskellige cellulære elementer. Efterhånden som undersøgelser af cytoplasmatiske og nukleare interaktioner bliver mere udbredt, kan lokaliseringens indvirkning på cellulære komponenter blive bedre forstået. Udvekslingen mellem cytoplasma og kerne kan analyseres, hvilket indikerer, om visse molekyler under disse udvekslinger kan føre til kræftudvikling, som undersøgelser af nukleare proteiner som XPO1 har indikeret¹⁷.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.