Summary
Le présent protocole utilise un ensemble de simulation biomoléculaire et décrit l’approche de dynamique moléculaire (DM) pour modéliser la caspase de type sauvage et ses formes mutantes. La méthode MD permet d’évaluer l’évolution dynamique de la structure des caspases et l’effet potentiel de mutations ou de modifications post-traductionnelles.
Abstract
L’apoptose est un type de mort cellulaire programmée qui élimine les cellules endommagées et contrôle le développement et l’homéostasie tissulaire des organismes multicellulaires. Les caspases, une famille de cystéines protéases, jouent un rôle clé dans l’initiation et l’exécution de l’apoptose. La maturation des caspases et leur activité sont affinées par des modifications post-traductionnelles de manière très dynamique. Pour évaluer l’effet des changements post-traductionnels, les sites potentiels sont systématiquement mutés avec des résidus persistants à toute modification. Par exemple, le résidu de sérine est remplacé par de l’alanine ou de l’acide aspartique. Cependant, de telles substitutions pourraient altérer la conformation du site actif de la caspase, entraînant des perturbations de l’activité catalytique et des fonctions cellulaires. De plus, des mutations d’autres résidus d’acides aminés situés dans des positions critiques pourraient également briser la structure et les fonctions des caspases et entraîner une perturbation de l’apoptose. Pour éviter les difficultés liées à l’utilisation de résidus mutés, des approches de modélisation moléculaire peuvent être facilement appliquées pour estimer l’effet potentiel des substitutions d’acides aminés sur la structure des caspases. Le protocole actuel permet la modélisation de la caspase de type sauvage et de ses formes mutantes avec le progiciel de simulation biomoléculaire (Amber) et des installations de superordinateur pour tester l’effet des mutations sur la structure et la fonction des protéines.
Introduction
L’apoptose est l’un des processus cellulaires les plus étudiés qui régulent la morphogenèse et l’homéostasie tissulaire des organismes multicellulaires. L’apoptose peut être initiée par un large éventail de stimuli externes ou internes, tels que l’activation des récepteurs de mort, la perturbation des signaux du cycle cellulaire, les dommages à l’ADN, le stress du réticulum endoplasmique (RE) et diverses infections bactériennes et virales1. Les caspases - acteurs clés de l’apoptose - sont classiquement classées en deux groupes: les initiateurs (caspase-2, caspase-8, caspase-9 et caspase-10) et les effecteurs (caspase-3, caspase-6 et caspase-7), en fonction de leur structure de domaine et de la place dans la cascade des caspases 2,3. Lors des signaux de mort cellulaire, les caspases initiatrices interagissent avec les molécules adaptatrices qui facilitent la dimérisation induite par la proximité et l’autotraitement pour former une enzyme active. Les caspases effectrices sont activées par clivage par les caspases initiatrices et effectuent des étapes d’exécution en aval en clivant plusieurs substrats cellulaires4.
La maturation et la fonction des caspases initiatrices et effectrices sont régulées par un grand nombre de mécanismes intracellulaires différents, parmi lesquels la modification post-traductionnelle joue un rôle indispensable dans la modulation de la mort cellulaire5. L’ajout de groupes modificateurs (phosphorylation, nitrosylation, méthylation ou acétylation) ou de protéines (ubiquitination ou SUMOylation) modifie l’activité enzymatique des caspases ou la conformation et la stabilité des protéines qui régulent l’apoptose. La mutagénèse dirigée est largement appliquée pour étudier les sites potentiels de modification post-traductionnelle et discerner leur rôle. Un site de modification putatif est généralement remplacé par un autre acide aminé, qui ne peut plus être modifié. Ainsi, la sérine et la thréonine potentiellement phosphorylées sont mutées en alanine, et les sites d’ubiquitination de la lysine sont remplacés par de l’arginine. Une autre stratégie consiste à substituer un acide aminé qui imite particulièrement la modification post-traductionnelle (p. ex., le glutamate et l’aspartate ont été utilisés pour imiter la sérine phosphorylée ou la thréonine)6. Cependant, certaines de ces substitutions situées à proximité élevée d’un site actif ou dans des positions critiques pourraient modifier la structure des caspases, perturber l’activité catalytique et supprimer la mort cellulaire apoptotique7. Des effets similaires ont pu être observés dans les cas de mutations faux-sens associées à la tumeur dans les gènes de la caspase. Par exemple, la mutation tumorale de la caspase-6 - R259H - a entraîné des modifications conformationnelles des boucles dans la poche de liaison au substrat, réduisant le renouvellement catalytique efficace des substrats8. La substitution d’acides aminés G325A dans la caspase-8 identifiée dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou pourrait entraver l’activité de la caspase-8, ce qui a conduit à la modulation de la signalisation du facteur nucléaire kB (NF-kB) et a favorisé la tumorigenèse9.
Pour évaluer l’effet potentiel des substitutions d’acides aminés sur la structure et la fonction des caspases, la modélisation moléculaire peut être appliquée. L’approche de la dynamique moléculaire (DM) est décrite dans ce travail pour modéliser la caspase de type sauvage et ses formes mutantes à l’aide du package de simulation biomoléculaire (Amber). La méthode MD donne une vue de l’évolution dynamique de la structure protéique suite à l’introduction de mutations. Développé à l’origine par le groupe de Peter Kollman, le package Amber est devenu l’un des outils logiciels les plus populaires pour les simulations biomoléculaires10,11,12,13. Ce logiciel est divisé en deux parties: (1) AmberTools, un ensemble de programmes couramment utilisés pour la préparation du système (affectation du type d’atome, ajout d’hydrogènes et de molécules d’eau explicites, etc.) et l’analyse de trajectoire; et (2) Amber, qui est centré sur le programme de simulation pmemd. AmberTools est un package gratuit (et une condition préalable à l’installation d’Amber lui-même), tandis qu’Amber est distribué avec une licence et une structure de frais distinctes. Des simulations parallèles sur un supercalculateur et/ou à l’aide d’unités de traitement graphique (GPU) peuvent améliorer considérablement les performances de la recherche scientifique sur la dynamique de la structure des protéines14. Les dernières versions logicielles disponibles sont AmberTools21 et Amber20, mais les protocoles décrits peuvent également être utilisés avec les versions précédentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation du système
NOTE: Les modèles moléculaires des formes protéiques natives et mutantes sont construits sur la base d’une structure cristalline appropriée obtenue à partir de la banque de données sur les protéines15,16.
- Pour récupérer la structure PDB sélectionnée, utilisez la liste déroulante Télécharger les fichiers et cliquez sur Format PDB. Supprimez les remarques et les données de connectivité, puis insérez une carte TER entre des chaînes protéiques distinctes dans le fichier PDB. Vous pouvez éventuellement définir l’état de protonation des résidus d’histidine en remplaçant le nom du résidu HIS par HIE, HID ou HIP (dossier supplémentaire 1).
REMARQUE: Il est raisonnable de ne pas enlever les molécules d’eau résolues cristallographiquement (si elles sont présentes dans le fichier PDB). - Pour préparer le modèle de départ, lancez le programme tleap (package AmberTools), puis entrez des commandes qui manipulent les objets tleap .
- Lancez le programme : tleap. Chargez le champ de force ff14SB pour décrire la protéine avec la mécanique moléculaire : > source leaprc.protein.ff14SB.
- Champs de force de charge pour les molécules d’eau et les ions atomiques (Na+, Cl-): > source leaprc.water.tip3p.
- Chargez le fichier PDB et créez des coordonnées pour les hydrogène, en créant un objet nommé mol : > mol = loadpdb protein.pdb.
- Vérifiez les incohérences internes qui pourraient causer des problèmes: > vérifiez mol.
REMARQUE : Les ponts disulfures, s’ils sont présents, doivent être spécifiés manuellement. Remplacez les noms des cystéines liées par covalence CYS par CYX et tapez la commande suivante dans tleap pour créer une liaison entre les atomes SG: liaison mol.X.SG mol.Y.SG (X et Y sont des nombres de résidus de cystéine). - Créer une boîte de solvant autour de la protéine (eau TIP3P, distance 12 Å) : > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
- Vérifiez la charge totale: > charge mol, et ajoutez des contre-ions (Na+ ou Cl-) pour neutraliser le système:
> addions mol Na+ 0. - Créez le fichier de topologie prmtop et le fichier de coordonnées inpcrd (entrées pour l’exécution d’une simulation) : > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Quittez le programme tleap : > quittez.
REMARQUE: Les fichiers de coordonnées au format orange peuvent être facilement convertis au format PDB à l’aide de l’outil ambpdb (reportez-vous au manuel de l’utilisateur, voir le tableau des matériaux).
2. Minimisation de l’énergie
REMARQUE: La minimisation de l’énergie est nécessaire pour éliminer les mauvais contacts et les chevauchements entre les atomes dans le système de démarrage qui conduisent à l’instabilité lors de l’exécution de MD.
- Réaliser la première étape de la minimisation de l’énergie (2 500 pas de l’algorithme de descente la plus raide + 2 500 pas de l’algorithme de gradient conjugué) pour optimiser les positions des atomes d’hydrogène et des molécules d’eau ajoutés tout en gardant les coordonnées protéiques fixées par des contraintes de position sur les atomes lourds.
- Exécutez le programme pmemd comme suit :
pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
-r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd. - Suivez les arguments requis : -i Données de contrôle de fichier ; -p Topologie moléculaire du FICHIER, paramètres du champ de force, noms des atomes; -c Coordonnées initiales du DOSSIER; -o Sortie de journal lisible par l’utilisateur ; -r Coordonnées finales du DOSSIER; -ref Coordonnées de référence FILE pour les dispositifs de retenue de position.
- Spécifiez les options dans le fichier d’entrée min1.in :
&cntrl
imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
cut=10.0, ntb=1,
ntc=1, ntf=1,
ntpr=10,
ntr=1,
restraintmask=':1-517 & !@H=',
restraint_wt=2,0
/
REMARQUE: Options d’entrée: imin=1 effectuer la minimisation; maxcyc = 5000 nombre maximum de cycles de minimisation; La méthode de minimisation ncyc=2500 est passée de la descente la plus raide à la pente conjuguée après les cycles ncyc ; coupure = 10,0 coupure non liée (Å); ntb=1 des limites périodiques sont imposées, volume constant; ntc=1 aucune contrainte n’est appliquée aux longueurs de liaison (pour une meilleure convergence énergétique); NTF=1 toutes les interactions sont calculées; NTPR = 10 informations énergétiques sont imprimées dans le fichier de sortie à chaque étape NTPR ; ntr=1 indicateur pour retenir des atomes spécifiés à l’aide d’un potentiel harmonique; restraintmask=':1-517 & !@H=' spécifie les atomes restreints; restraint_wt=2,0 poids (kcal/mol∙Å2) pour les dispositifs de retenue positionnels.
- Exécutez le programme pmemd comme suit :
- Effectuer la deuxième étape de la minimisation énergétique (5 000 marches de descente les plus raides + 5 000 marches de pente conjuguées) sans contraintes pour optimiser l’ensemble du système.
- Utilisez min2.in et protein_min1.rst comme entrées : pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
-c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst. - Spécifiez les options dans le fichier d’entrée min2.in :
&cntrl
imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
cut=10.0, ntb=1,
ntc=1, ntf=1,
NTPR = 10
/
- Utilisez min2.in et protein_min1.rst comme entrées : pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
3. Chauffage
REMARQUE: Cette étape vise à chauffer le système de 0 K à 300 K. Les vitesses initiales sont attribuées aux atomes puisque le modèle de départ basé sur le fichier PDB ne contient pas d’informations de vitesse.
- Effectuer le processus de chauffage avec des contraintes de position sur les atomes de protéines (50 ps, volume constant).
- Utilisez heat.in et protein_min2.rst comme entrées : pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
-c protein_min2.rst -o protein_heat.out
-r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst - Suivez les arguments requis : -x FICHIER jeux de coordonnées enregistrés sur la trajectoire MD.
- Spécifiez les options dans le fichier d’entrée heat.in :
&cntrl
imin=0, irest=0, ntx=1,
nstlim=25000, dt=0,002,
ntc=2, ntf=2,
cut=10.0, ntb=1,
ntpr=500, ntwx=500,
ntt=3, gamma_ln=2,0,
tempi=0,0, temp0=300,0,
ntr=1, restraintmask=':1-517',
restraint_wt=1,0,
nmropt=1
/
&wt TYPE='TEMP0',
istep1=0, istep2=25000,
valeur1=0,1, valeur2=300,0 /
&wt TYPE='FIN' /
REMARQUE: Options d’entrée: imin = 0 exécuter MD; irest=0 exécuter une nouvelle simulation ; NTX=1 aucune vitesse initiale n’est lue à partir du fichier RST ; nstlim=25000 nombre d’étapes MD; dt=0,002 pas de temps (ps); les liaisons ntc=2 impliquant de l’hydrogène sont contraintes à l’aide de l’algorithme SHAKE; ntf=2 forces pour les liaisons contraintes ne sont pas calculées; Les coordonnées ntwx=500 sont écrites dans le fichier MDCRD à chaque étape NTWX ; ntt=3 Régulation de la température Langevin; gamma_ln=2,0 fréquence des collisions pour la dynamique de Langevin (ps−1); tempi = 0,0 température initiale; temp0=300,0 température de référence; Les paramètres nmropt=1 spécifiés dans une liste de noms &wt sont lus ; TYPE='TEMP0' fait varier la température cible.
- Utilisez heat.in et protein_min2.rst comme entrées : pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
4. Equilibrage
NOTE: Cette étape est nécessaire pour ajuster la densité de l’eau et obtenir l’état d’équilibre de la protéine.
- Effectuer l’équilibrage à 300 K sans aucune contrainte (500 ps, pression constante).
- Utilisez equil.in et protein_heat.rst comme entrées : pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
-c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd. - Spécifiez les options dans le fichier d’entrée equil.in :
&cntrl
imin=0, irest=1, ntx=5,
nstlim=250000,
dt=0,002,
ntc=2, ntf=2,
cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
ntt=3, gamma_ln=2,0,
temp0=300,0
/
REMARQUE: Options d’entrée: irest=1 redémarrer la simulation; Les coordonnées et les vitesses NTX=5 sont lues à partir d’un fichier RST généré précédemment; ntb = 2 limites périodiques sont imposées, pression constante; ntp = 1 échelle de pression isotrope; TAUP = 2,0 temps de relaxation de pression (PS); NTWR = 50000 Chaque étape NTWR , le fichier RST est écrit, assurant la récupération après un crash.
- Utilisez equil.in et protein_heat.rst comme entrées : pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
5. Dynamique de production
- Une fois l’équilibre atteint, effectuer une simulation MD de production (10 ns ou plus) à pression constante et générer le fichier de trajectoire pour l’analyse ultérieure de la structure protéique.
- Utilisez prod.in et protein_equil.rst comme entrées : pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
-c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd. - Spécifiez les options dans le fichier d’entrée prod.in :
&cntrl
imin=0, irest=1, ntx=5,
nstlim=5000000,
dt=0,002,
ntc=2, ntf=2,
cut=10.0, ntb=2, ntp=1, taup=2.0,
ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
ntt=3, gamma_ln=2,0,
temp0=300.0, ig=-1
/
Remarque : La version parallèle de pmemd (pmemd. MPI) ou la version accélérée par GPU (pmemd.cuda) peuvent être utilisées sur les clusters d’ordinateurs et les supercalculateurs. Une longue simulation MD peut être divisée en plusieurs segments et effectuée séquentiellement. Il est fortement recommandé de définir ig=-1 (option de démarrage aléatoire) pour chaque redémarrage de simulation. Les programmes ptraj ou cppptraj peuvent être utilisés pour l’analyse et le traitement des trajectoires de coordonnées. Pour plus d’informations, consultez le manuel d’utilisation du logiciel.
- Utilisez prod.in et protein_equil.rst comme entrées : pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le présent protocole peut être facilement appliqué dans les études de modification post-traductionnelle des caspases ou de mutations pathogènes. Dans cette section, le flux de travail de modélisation MD est illustré (Figure 1), qui a été utilisé avec succès dans l’étude de la caspase-27. En utilisant la mutagénèse in vitro dirigée des sites de phosphorylation potentiels (Ser/Thr à Ala) et des approches biochimiques, il a été démontré que la mutation Ser384Ala empêchait le traitement de la caspase-2 et bloquait l’activité enzymatique et l’induction de la mort cellulaire apoptotique (Figure supplémentaire 1). Cependant, ni l’analyse par spectrométrie de masse ni la technologie Phos-Tag n’ont confirmé que Ser384 subissait une phosphorylation7. Pour comprendre comment Ser384 régule l’activité de la caspase-2, une modélisation MD de la structure protéique tridimensionnelle a été réalisée (Figure 1).
Les modèles moléculaires des formes sauvages et mutantes de la caspase-2 ont été construits à l’aide de la structure cristalline 1pyo (les structures de caspase-2 disponibles sont énumérées dans le tableau supplémentaire 1). Le mutant Ser384Ala a été créé en supprimant l’atome O γ dans le résidu Ser384 (dans la PDB, les résidus Ser et Ala se distinguent par l’atome Oγ). Les coordonnées de l’hydrogène sont généralement absentes dans les structures cristallines. Par conséquent, des atomes d’hydrogène ont été ajoutés à la structure de la protéine, puis il a été solvaté par une couche d’eau TIP3P de 12 Å d’épaisseur pour permettre d’autres simulations explicites de solvants. Des ions sodium ont été ajoutés pour neutraliser le système. Les modèles de départ obtenus de la caspase-2 ont été soumis à une minimisation de l’énergie, à un équilibrage et à une simulation MD ultérieure de 10 ns selon le protocole de modélisation MD, en utilisant les fichiers de données de contrôle min1.in, min2.in, heat.in, equil.in et prod.in.
Dans la structure cristalline de la caspase-2, Ser384, avec Arg219 et Arg378, sont impliqués dans la formation de la surface de la cavité dans le site actif. Arg219 et Arg378 forment des liaisons hydrogène avec le groupe carboxyle du substrat, tandis que Ser384 n’intervient pas dans les interactions directes avec le substrat. Les simulations MD ont confirmé que la substitution Ser384Ala n’affectait pas les résidus catalytiques Cys320 (nucléophile) et His277 (base générale) mais induisait un changement conformationnel majeur dans Arg378. Son groupe guanidinium s’est tourné vers le solvant en vrac de sorte que l’atome de Nε ne pouvait pas former une liaison hydrogène essentielle avec le groupe carboxyle du substrat (Figure 1). Dans l’enzyme native, une interaction électrostatique se produit entre l’atome Oγ de Ser384 (charge négative partielle) et le groupe guanidinium Arg378 (charge positive). Cependant, la substitution de sérine perturbe apparemment cette interaction. Ainsi, il a été démontré que la substitution Ser384Ala affectait la reconnaissance du substrat par les résidus d’arginine dans le site actif de la caspase-2, altérant l’activité enzymatique et la capacité à déclencher la mort cellulaire apoptotique. Le mécanisme découvert semble conservé au cours de l’évolution et commun aux autres membres de la famille des caspases. Ainsi, la mise en œuvre de simulations MD a permis de confirmer les résultats biochimiques et d’obtenir de nouvelles informations sur la structure moléculaire du centre actif des caspases.
Figure 1 : Flux de travail de modélisation MD utilisé pour étudier la structure des caspases. La caspase-2 de type sauvage et son mutant Ser384Ala ont été étudiés en suivant les instructions de la section protocole. Il a été révélé que la substitution Ser384Ala induit un changement conformationnel important dans le résidu du site actif Arg378. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Fonction de la caspase-2 dans la mort cellulaire. En réponse à des stimuli extrinsèques et intrinsèques, la caspase-2 de type sauvage peut être activée par un mécanisme autoprotéolytique. La caspase-2 active clive Bid, qui, à son tour, favorise la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale et la mort cellulaire apoptotique. La mutation Ser384Ala empêche l’activation de la caspase-2 et l’induction de la mort cellulaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Structures de la caspase-2 disponibles dans la Banque de données sur les protéines. Les structures sont triées par date de sortie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Fichier supplémentaire 1 : différentes étapes de l’édition d’un fichier PDB. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’approche DM décrite permet de modéliser à la fois les formes sauvages et mutantes de la caspase à l’aide des progiciels de simulation biomoléculaire. Plusieurs questions importantes de la méthodologie sont abordées ici. Tout d’abord, une structure cristalline représentative de la caspase doit être sélectionnée à partir de la banque de données sur les protéines. Il est important de noter que les formes monomères et dimériques de la caspase sont acceptables. Choisir des structures à haute résolution avec un nombre minimum de résidus manquants est une bonne idée. L’état de protonation de certains résidus peut être réglé manuellement dans le fichier PDB d’entrée. Par exemple, sur la figure 1, un atome d’hydrogène a été attaché à l’atomeNε2 (forme HIE) du résidu catalytique His277. Deuxièmement, une boîte de solvant doit être créée autour de la protéine pour d’autres simulations explicites de solvants. La minimisation de l’énergie est nécessaire pour optimiser les coordonnées des atomes d’hydrogène et des molécules d’eau ajoutés. Troisièmement, le chauffage et l’équilibrage doivent être effectués avant la simulation de la dynamique de production. Au stade du chauffage, il faut s’assurer que les cavités et les poches de liaison à la surface des protéines se remplissent de molécules d’eau (si nécessaire, on peut augmenter le nombre d’étapes MD). Au stade de l’équilibre, l’acquisition de la conformation d’équilibre de la protéine doit être confirmée en analysant la déviation quadratique moyenne de ses atomes de squelette par rapport aux positions initiales12. Quatrièmement, il est nécessaire de surveiller les changements conformationnels de la structure protéique pendant la simulation de la dynamique de production. Pour ce faire, il convient de superposer des cadres de trajectoire sur la structure de départ en ajustant les atomes de l’épine dorsale, puis d’analyser les changements conformationnels à l’aide d’un outil de visualisation moléculaire (VMD, PyMOL, etc.) 17. Si nécessaire, on peut augmenter le nombre d’étapes de DM et/ou diviser la simulation en plusieurs segments effectués séquentiellement. Cinquièmement, il est recommandé d’utiliser la version accélérée par GPU du programme de simulation MD (pmemd.cuda), dont les performances dépassent considérablement celles réalisables par l’implémentation CPU traditionnelle14,18.
Une limite possible de la méthode décrite est la disponibilité de certaines structures de caspases dans la banque de données sur les protéines. Cependant, plus de 900 entrées PDB sont trouvées sous la demande de « caspase », ce qui indique que les structures de caspases ont été étudiées en détail. Certaines difficultés peuvent survenir lorsqu’une structure cristalline est obtenue à faible résolution (c’est-à-dire à un niveau de détail grossier) ou manque de fragments importants pour la fonction de la caspase.
En résumé, les approches de modélisation MD se sont révélées efficaces pour prédire les changements structurels des protéines après des mutations de leurs gènes, des modifications ou des interactions intermoléculaires. L’application de la simulation MD dans le domaine de la mort cellulaire ouvre de grandes opportunités pour étudier les mécanismes moléculaires de la régulation des caspases par des modifications post-traductionnelles. À cet égard, la simulation à long terme de la DM pourrait évaluer le comportement dynamique des régions fonctionnelles et l’effet potentiel des substitutions d’acides aminés pour élucider les causes moléculaires associées à la caspase-2 mutée ou modifiée ainsi qu’à d’autres caspases. Par exemple, des mutations faux-sens des gènes initiateurs de la caspase (caspase-2/caspase-8/caspase-9/caspase-10) ont été détectées dans les cancers gastro-intestinaux et dans les tumeurs des systèmes nerveux central et périphérique19. Ensemble, la modélisation MD des caspases est une approche in silico puissante pour comprendre les mécanismes régulant la mort cellulaire programmée et les troubles associés et pour développer de nouvelles thérapies efficaces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation russe de la science (17-75-20102, l’élaboration du protocole). Les expériences décrites dans la section des résultats représentatifs (analyse de la phosphorylation) ont été soutenues par les sociétés de lutte contre le cancer de Stockholm (181301) et suédoise (190345).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
References
- Olsson, M., Zhivotovsky, B.
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
- Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J.
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
- Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
- Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
- Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).
- Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
- Case, D. A., et al. AMBER 2020. , University of California, San Francisco. (2020).
- Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
- Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
- Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
- Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
- Berman, H. M., et al.
- Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
- Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
- Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
- Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).
