Classicamente, o endocárdio do primordium da válvula embrionária de camundongo foi analisado usando cortes transversais, coronais ou sagitais. Nossa nova abordagem para imagens bidimensionais en face do endocárdio em regiões valvulogênicas permite a polaridade planar e a análise de rearranjo celular do endocárdio durante o desenvolvimento valvar.
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Artigo de método
En Face Preparação de Almofadas Endocárdicas para Análise de Morfogênese Planar em Embriões de Camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estudo dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento do coração de mamíferos é essencial para tratar a doença cardíaca congênita humana. O desenvolvimento das valvas cardíacas primitivas envolve a transição epitelial-mesenquimal (EMT) de células endocárdicas das regiões do canal atrioventricular (CVA) e da via de saída (OFT) do coração em resposta a sinais miocárdicos e endocárdicos indutivos locais. Uma vez que as células se delaminam e invadem a matriz extracelular (geleia cardíaca) localizada entre o endocárdio e o miocárdio, formam-se as almofadas endocárdicas primitivas (CE). Este processo implica que o endocárdio tem que preencher as lacunas deixadas pelas células delaminadas e tem que se reorganizar para convergir (estreitar) ou estender (alongar) ao longo de um eixo. Pesquisas atuais implicaram a via da polaridade das células planares (PCP) na regulação da localização subcelular dos fatores envolvidos nesse processo. Classicamente, as fases iniciais do desenvolvimento da valva cardíaca têm sido estudadas em cortes transversais de corações embrionários ou em explantes ex vivo de AVC ou OFT cultivados em géis de colágeno. Essas abordagens permitem a análise da polaridade apico-basal, mas não permitem a análise do comportamento celular dentro do plano do epitélio ou das alterações morfológicas das células migratórias. Aqui, mostramos uma abordagem experimental que permite a visualização do endocárdio em regiões valvulogênicas como um campo planar de células. Esta abordagem experimental oferece a oportunidade de estudar PCP, topologia planar e comunicação intercelular dentro do endocárdio do OFT e AVC durante o desenvolvimento da válvula. Decifrar novos mecanismos celulares envolvidos na morfogênese valvar cardíaca pode contribuir para a compreensão da cardiopatia congênita associada a defeitos da almofada endocárdica.
Introdução
O coração é o primeiro órgão funcional de um embrião de mamíferos. Por volta do dia embrionário (E) 7,5 em camundongos, células mesodérmicas pré-cardíacas bilaterais formam o crescente cardíaco no lado ventral1. O crescente cardíaco contém duas populações de células pré-cardíacas que incluem progenitores do miocárdio e do endocárdio2. Por volta de E8.0, os precursores cardíacos se fundem na linha média, formando o tubo cardíaco primitivo composto por dois tecidos epiteliais, o miocárdio externo e o endocárdio interno, que é um endotélio especializado separado por uma matriz extracelular chamada geleia cardíaca. Mais tard....
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Protocolo
Os estudos em animais foram aprovados pelo Comité de Ética em Experimentação Animal do Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) e pela Comunidade de Madrid (ref. PROEX 155.7/20). Todos os procedimentos relativos aos animais estavam em conformidade com a Diretiva da UE 2010/63UE e a Recomendação 2007/526/CE relativa à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos, promulgados na legislação espanhola ao abrigo do Real Decreto 1201/2005.
1. Obtenção de AVC e/ou OFTs (adaptado de Xiao et al. 25)
- Configure cruzamentos à tarde....
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Resultados
Os dados gerados por meio desse protocolo mostram que é possível realizar imagens de face do endocárdio da AVC. O primeiro objetivo foi analisar a forma celular do endocárdio durante a formação das valvas em resolução celular (Figura 1). Para destacar as células endocárdicas individuais em E9.5, foram utilizadas duas cepas transgênicas de camundongos. (1) ROSAmT/mG é um alelo repórter Cre fluorescente de duas cores (tdTomato/mT e EGFP/mG) cuja f.......
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Discussão
O endocárdio é uma monocamada epitelial que cobre toda a superfície interna do tubo cardíaco embrionário. Durante o desenvolvimento valvar, as células endocárdicas nas regiões valvares prospectivas sofrem EMT, assim, as células endocárdicas se transformam e reorganizam seu citoesqueleto para delaminar do endocárdio em direção à geleia cardíaca. Nós e outros obtivemos dados relevantes sobre o desenvolvimento valvar em embriões de camundongos analisando cortes transversais de corações embrionários E8.5 e E9.5, onde o endoc.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelas bolsas PID2019-104776RB-I00 e CB16/11/00399 (CIBER CV) de MCIN/AEI/10.13039/501100011033 para J. L. P. J.G.-B. foi financiado pelo Programa de Atracción de Talento da Comunidade de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. foi financiado pela Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Agradecemos à Unidade CNIC de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, ICTS-ReDib, cofinanciada pelo MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Agradecemos também a A. Galicia e L. Méndez pela criação de ratos. O custo desta publicação foi parcialmente suportado por fundos do Fundo Europeu de Desenv....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4-OH-Tamoxifeno | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16% Paraformaldheyde | Microscopia Eletrônica Ciências | 157-10 | Diluir a 4% em água |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Cabra anti-Frango, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Cabra Anti-Rato Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Montagem Laboratórios de | Vetores | H-1000-10 |
Referências
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbou....
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Reimpressões e permissões
