Artigo de método

En Face Preparação de Almofadas Endocárdicas para Análise de Morfogênese Planar em Embriões de Camundongos

DOI:

10.3791/64207

⸱

27 de julho de 2022

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1Intercellular Signalling in Cardiovascular Development and Disease Laboratory, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Ciber de Enfermedades Cardiovasculares

Neste artigo

Resumo

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Classicamente, o endocárdio do primordium da válvula embrionária de camundongo foi analisado usando cortes transversais, coronais ou sagitais. Nossa nova abordagem para imagens bidimensionais en face do endocárdio em regiões valvulogênicas permite a polaridade planar e a análise de rearranjo celular do endocárdio durante o desenvolvimento valvar.

Resumo

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O estudo dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento do coração de mamíferos é essencial para tratar a doença cardíaca congênita humana. O desenvolvimento das valvas cardíacas primitivas envolve a transição epitelial-mesenquimal (EMT) de células endocárdicas das regiões do canal atrioventricular (CVA) e da via de saída (OFT) do coração em resposta a sinais miocárdicos e endocárdicos indutivos locais. Uma vez que as células se delaminam e invadem a matriz extracelular (geleia cardíaca) localizada entre o endocárdio e o miocárdio, formam-se as almofadas endocárdicas primitivas (CE). Este processo implica que o endocárdio tem que preencher as lacunas deixadas pelas células delaminadas e tem que se reorganizar para convergir (estreitar) ou estender (alongar) ao longo de um eixo. Pesquisas atuais implicaram a via da polaridade das células planares (PCP) na regulação da localização subcelular dos fatores envolvidos nesse processo. Classicamente, as fases iniciais do desenvolvimento da valva cardíaca têm sido estudadas em cortes transversais de corações embrionários ou em explantes ex vivo de AVC ou OFT cultivados em géis de colágeno. Essas abordagens permitem a análise da polaridade apico-basal, mas não permitem a análise do comportamento celular dentro do plano do epitélio ou das alterações morfológicas das células migratórias. Aqui, mostramos uma abordagem experimental que permite a visualização do endocárdio em regiões valvulogênicas como um campo planar de células. Esta abordagem experimental oferece a oportunidade de estudar PCP, topologia planar e comunicação intercelular dentro do endocárdio do OFT e AVC durante o desenvolvimento da válvula. Decifrar novos mecanismos celulares envolvidos na morfogênese valvar cardíaca pode contribuir para a compreensão da cardiopatia congênita associada a defeitos da almofada endocárdica.

Introdução

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O coração é o primeiro órgão funcional de um embrião de mamíferos. Por volta do dia embrionário (E) 7,5 em camundongos, células mesodérmicas pré-cardíacas bilaterais formam o crescente cardíaco no lado ventral1. O crescente cardíaco contém duas populações de células pré-cardíacas que incluem progenitores do miocárdio e do endocárdio2. Por volta de E8.0, os precursores cardíacos se fundem na linha média, formando o tubo cardíaco primitivo composto por dois tecidos epiteliais, o miocárdio externo e o endocárdio interno, que é um endotélio especializado separado por uma matriz extracelular chamada geleia cardíaca. Mais tarde, em E8.5, o tubo cardíaco sofre looping para a direita. O coração em alça possui diferentes regiões anatômicas com assinaturas moleculares específicas, como a via de saída (OFT), os ventrículos e o canal atrioventricular (AVC)3. Embora inicialmente o tubo cardíaco se expanda em seu lado de entrada através da adição de células4, em E9,5, a proliferação cardíaca intensiva resulta em balonamento das câmaras e estabelecimento da rede trabecular5. A formação valvar ocorre no AVC (futuras valvas mitral e tricúspide) e no OFT (futuras valvas aórtica e pulmonar).

O endocárdio desempenha papéis cruciais no desenvolvimento da válvula. As células endocárdicas sofrem transição epitelial-mesenquimal (EMT) no AVC e no OFT para formar as almofadas endocárdicas, uma estrutura que aparece no início do desenvolvimento valvar. Diferentes vias de sinalização ativam esse processo; em E9.5 em camundongos, o NOTCH ativado no endocárdio em resposta à BMP2 derivada do miocárdio promove EMT invasiva de células endocárdicas nas regiões AVC e OFT por meio da ativação de TGFβ2 e SNAIL (SNAI1), que reprime diretamente a expressão da caderina endotelial vascular (VE-caderina), um componente transmembrana das junções aderentes (AJs)6,7,8 . No OFT, a ativação do endocárdio para iniciar a EMT é mediada pelo FGF8 e BMP4, cuja expressão é ativada pelo NOTCH 9,10,11,12.

A progressão da EMT envolve a dinâmica celular à medida que as células mudam de forma, quebram e refazem junções com seus vizinhos, delaminam e começam a migrar13. Essas alterações incluem remodelamento e desmontagem gradual de AJ 14,15, sinalização de polaridade celular planar (PCP), perda de polaridade ápico-basal (PAB), constrição apical e organização citoesquelética 16,17. ABP refere-se à distribuição de proteínas ao longo do eixo anteroposterior de uma célula. No coração em desenvolvimento, a regulação da PA em cardiomiócitos é necessária para o desenvolvimento ventricular18. PCP refere-se a uma distribuição polarizada de proteínas dentro das células através do plano de um tecido e regula a distribuição celular; epitélios com geometria estável são constituídos por células em forma de hexágono, onde apenas três células convergem nos vértices 19,20,21,22. Diferentes processos celulares, como divisão celular, troca de vizinhos ou delaminação que ocorrem durante a morfogênese epitelial, produzem um aumento no número de células que convergem para um vértice e no número de células vizinhas que uma determinada célula tem22. Esses comportamentos celulares relacionados à PCP podem ser regulados por diferentes vias de sinalização, dinâmica da actina ou tráfico intracelular23.

Os dados gerados que estudam o desenvolvimento valvar em camundongos foram obtidos de cortes transversais, coronais ou sagitais de corações embrionários E8.5 e E9.5, onde o endocárdio é mostrado como uma linha de células em vez de como um campo de células - o endocárdio cobre toda a superfície interna do tubo cardíaco24. Cortes embrionários não permitem a análise de PCP no endocárdio de embriões de camundongos. Nosso novo método experimental permite a análise da distribuição de células endocárdicas, anisotropia AJ e análise da forma de célula única, como mostrado nos resultados representativos. Este tipo de dados é necessário para a análise de PCP, juntamente com a descrição de outras moléculas relacionadas com PCP, não mostradas neste relatório. A imunofluorescência total, o preparo específico de amostras e o uso de camundongos geneticamente modificados permitem a análise de polaridade planar no endocárdio no início do desenvolvimento valvar em camundongos.

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Protocolo

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Os estudos em animais foram aprovados pelo Comité de Ética em Experimentação Animal do Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) e pela Comunidade de Madrid (ref. PROEX 155.7/20). Todos os procedimentos relativos aos animais estavam em conformidade com a Diretiva da UE 2010/63UE e a Recomendação 2007/526/CE relativa à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos, promulgados na legislação espanhola ao abrigo do Real Decreto 1201/2005.

1. Obtenção de AVC e/ou OFTs (adaptado de Xiao et al. 25)

  1. Configure cruzamentos à tarde entre mTmG feminino e VE-Cadherin-Cre-ERT/+ masculino.
  2. Na manhã seguinte, verifique se há um plugue vaginal. Se houver um tampão vaginal, conte-o como meio dia (E0.5). Dependendo do experimento de interesse, conte 8 dias ou 9 dias.
  3. 24 h antes da dissecção, gavagar a fêmea grávida por via oral com 50 μL de 5 mg/mL de 4-OH-Tamoxifeno diluído em óleo de milho.
    NOTA: Esta dose induzirá uma quantidade limitada de recombinação mediada por CRE revelada pela presença de clones GFP-positivos. A dose adequada terá de ser determinada com cada novo lote de 4-OH-Tamoxifeno.
  4. Sacrificar a fêmea grávida em E8.5 ou E9.5 por luxação cervical.
  5. Abra o abdômen das ratas grávidas usando uma tesoura e remova o útero que contém os embriões usando tesouras e pinças finas.
  6. Coloque o útero em uma placa de Petri contendo solução salina gelada 1x tamponada com fosfato (PBS) com Tween-20 (PBT) a 0,1%.
  7. Remova as decíduas individuais do útero sob um microscópio de dissecação e usando pinça fina.
  8. Usando pinças finas, faça uma incisão na parte branca da decídua, que é onde o embrião está, remova-o suavemente, evitando puxar, e transfira os embriões para uma nova placa de Petri com PBT fresco usando um P1000 com a ponta cortada, deixando um diâmetro grande o suficiente para um embrião passar sem quebrar.
  9. Para genotipagem, pegue um pequeno pedaço do saco vitelino (0,5 mm2) ou um pedaço da cauda (da extremidade posterior, contando 5 a 10 somitos em direção à cabeça) e diga-o em 100 μL de tampão apropriado.
  10. Sob o exaustor, transfira os embriões para paraformaldeído gelado a 4% (4% de PFA) em PBS filtrado estéril em um tubo de microcentrífuga (2 mL) a 4 °C. Fixar os embriões de 2 h durante a noite (O/N) a 4 °C num nutador.
  11. Sob o exaustor, remova o fixador de PFA a 4% dos tubos de microcentrífuga sem tocar nos embriões. Rejeitar o PFA num recipiente adequado.
  12. Lave os embriões 5x em PBT frio por 10 min cada um à temperatura ambiente (RT).
  13. Usando pinça fina, remova o coração e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com PBT fresco.

2. Imunofluorescência de montagem inteira do coração embrionário do rato

  1. Substitua o PBT por PBSTr (0,4% Triton X-100 em PBS) e lave as amostras 3x, 5 min cada, no RT em um agitador orbital.
  2. Substitua o PBSTr por solução de bloqueio (PBSTr por soro bovino inativado pelo calor a 10%). Incubar de 2 h a O/N a 4 °C num agitador orbital.
  3. Substitua a solução de bloqueio por uma solução de bloqueio contendo anticorpos primários na concentração desejada (para anticorpo anti-GFP ou anti-VE-Caderina, use diluição 1:1000). Incubar O/N num agitador orbital a 4 °C.
  4. Após incubação O/N a 4 °C, incubar durante 1,5 h a RT num agitador orbital. Este passo é muito importante para aumentar a relação sinal-ruído.
  5. Remover e manter a 4 °C a solução primária de anticorpos para até três experiências futuras (adicionar azida de sódio a uma concentração final de 0,02% para uma melhor conservação).
  6. Lave os embriões 3x com PBSTr por 3 min cada.
  7. Lavar os embriões com PBSTr 3x durante 30 min cada um num agitador orbital a 4 °C.
  8. Após a última lavagem, adicionar 1 mL de solução bloqueadora contendo 1:1000 anticorpos secundários conjugados com fluorescência contra a espécie hospedeira de anticorpos primários. Adicionar também 1:3000 DAPI à solução e incubar os embriões O/N num agitador orbital a 4 °C.
  9. Após incubação O/N a 4 °C, incubar durante 1,5 h a RT num agitador orbital. Este passo é muito importante para aumentar a relação sinal-ruído.
  10. Lave os embriões 3x com PBSTr por 3 min cada.
  11. Lave os embriões com PBSTr 3x-5x por 30 min cada em um agitador orbital no RT.

3. Montagem do AVC embrionário do rato ou OFTs

  1. Coloque os corações em uma placa de Petri (35 mm) contendo PBS.
  2. Usando um fio de tungstênio e uma pinça fina, isole o AVC ou o OFT e corte-os longitudinalmente26.
  3. Prepare folhas de cobertura (22 mm x 22 mm), corrediças (60 mm x 24 mm), pinças, uma pipeta P200 com as pontas apropriadas, papel toalha e qualquer meio de montagem aquoso à base de glicerol para fluorescência, sem DAPI.
  4. Usando uma abordagem semelhante à de Xiao, C. et al.25, colem duas tiras de fita adesiva em uma lâmina, separadas por 0,3-0,6 cm, a fim de criar um espaço de sala 3D que permitirá que as amostras conservem sua forma original sem esmagá-las.
  5. Cuidadosamente, e usando o volume mínimo de buffer, solte as amostras no slide entre as listras de fita usando uma pipeta de ponta P200 cortada. Use um microscópio de dissecação para aumentar a precisão.
  6. Usando pinça fina, coloque as amostras com o endocárdio voltado para cima (miocárdio para baixo na lâmina).
  7. Remova o excesso de PBS com uma toalha de papel (evite tocar na amostra) e, em seguida, seque as amostras por 1-2 min no RT para fazer com que as amostras grudem na lâmina.
  8. Adicionar 40 μL de meio de montagem aquoso no tecido.
  9. Coloque a tampa sobre os dois pedaços de fita adesiva e abaixe-a lentamente sobre o tecido com uma agulha ou pinça. Evite criar bolhas de ar.
  10. Sele a tampa usando uma gota de esmalte em cada vértice da tampa.
  11. Uma vez que o esmalte esteja seco, limpe o meio de montagem em excesso das laterais da tampa usando uma toalha de papel absorvente. Evite mover a tampa.
  12. Adicione esmalte ao longo das bordas da tampa para selá-lo completamente, evitando a evaporação do meio de montagem.
  13. Usando um microscópio confocal vertical ou invertido, tire imagens a 10x para visualização geral e a 63x com zoom de 3x para imagens detalhadas.

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Resultados

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Os dados gerados por meio desse protocolo mostram que é possível realizar imagens de face do endocárdio da AVC. O primeiro objetivo foi analisar a forma celular do endocárdio durante a formação das valvas em resolução celular (Figura 1). Para destacar as células endocárdicas individuais em E9.5, foram utilizadas duas cepas transgênicas de camundongos. (1) ROSAmT/mG é um alelo repórter Cre fluorescente de duas cores (tdTomato/mT e EGFP/mG) cuja f...

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Discussão

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O endocárdio é uma monocamada epitelial que cobre toda a superfície interna do tubo cardíaco embrionário. Durante o desenvolvimento valvar, as células endocárdicas nas regiões valvares prospectivas sofrem EMT, assim, as células endocárdicas se transformam e reorganizam seu citoesqueleto para delaminar do endocárdio em direção à geleia cardíaca. Nós e outros obtivemos dados relevantes sobre o desenvolvimento valvar em embriões de camundongos analisando cortes transversais de corações embrionários E8.5 e E9.5, onde o endoc...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado pelas bolsas PID2019-104776RB-I00 e CB16/11/00399 (CIBER CV) de MCIN/AEI/10.13039/501100011033 para J. L. P. J.G.-B. foi financiado pelo Programa de Atracción de Talento da Comunidade de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. foi financiado pela Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Agradecemos à Unidade CNIC de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, ICTS-ReDib, cofinanciada pelo MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Agradecemos também a A. Galicia e L. Méndez pela criação de ratos. O custo desta publicação foi parcialmente suportado por fundos do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional. O CNIC é apoiado pelo ISCIII, pelo MCIN e pela Fundação Pro CNIC e é um Centro de Excelência Severo Ochoa (bolsa CEX2020-001041-S) financiado pelo MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4-OH-TamoxifenoSigma AldrichH-6278
16% ParaformaldheydeMicroscopia Eletrônica Ciências157-10Diluir a 4% em água
anti-GFPAves LabsFGP-1010
anti-VECadherinBD Biosciences555289
Cabra anti-Frango, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11039
Cabra Anti-Rato Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch115-605-174
DAPIAppliChemA4099,0005
Slides Superfrost PLUSVWR631-010825 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML
Tween 20A4974,0500AppliChem
Vectashield Montagem Laboratórios deVetoresH-1000-10
Médios

Referências

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