Artigo de método

Separação de subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa

DOI:

10.3791/64212

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7 de setembro de 2022

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1Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 2Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos um método que combina contas imunomagnéticas e classificação de células ativadas por fluorescência para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de células mononucleares do sangue periférico (monócitos, células T CD4 + , células T CD8 + , células B e células natural killer). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas e analisadas.

Resumo

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A mononucleose infecciosa (MI) é uma síndrome aguda associada principalmente à infecção primária pelo vírus Epstein-Barr (EBV). Os principais sintomas clínicos incluem febre irregular, linfadenopatia e linfócitos significativamente aumentados no sangue periférico. O mecanismo patogênico da MI ainda não está claro; não existe um método de tratamento eficaz para o efeito, estando disponíveis principalmente terapias sintomáticas. A principal questão na imunobiologia do EBV é por que apenas um pequeno subconjunto de indivíduos infectados apresenta sintomas clínicos graves e até desenvolve malignidades associadas ao EBV, enquanto a maioria dos indivíduos é assintomática por toda a vida com o vírus.

As células B são envolvidas pela primeira vez na MI porque os receptores de EBV são apresentados em sua superfície. As células natural killer (NK) são linfócitos inatos citotóxicos que são importantes para matar as células infectadas pelo EBV. A proporção de células T CD4+ diminui, enquanto a de células T CD8+ se expande dramaticamente durante a infecção aguda por EBV, e a persistência de células T CD8+ é importante para o controle vitalício da MI. Essas células imunes desempenham papéis importantes na MI, e suas funções precisam ser identificadas separadamente. Para este propósito, os monócitos são separados primeiro das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de indivíduos IM usando microesferas CD14, uma coluna e um separador magnético.

Os PBMCs restantes são corados com peridinina-clorofila-proteína (PerCP)/Cianina 5.5 anti-CD3, aloficocianina (APC)/Cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 e APC anti-CD16 para classificar células T CD4+, células T CD8+, células B e células NK usando um citômetro de fluxo. Além disso, o sequenciamento do transcriptoma de cinco subpopulações foi realizado para explorar suas funções e mecanismos patogênicos na MI.

Introdução

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O vírus Epstein-Barr (EBV), um γ-herpesvírus também conhecido como vírus do herpes humano tipo 4, é onipresente na população humana e estabelece infecção latente ao longo da vida em mais de 90% da população adulta1. A maioria das infecções primárias por EBV ocorre durante a infância e adolescência, com uma fração de pacientes manifestando mononucleose infecciosa (IM)2, mostrando imunopatologia característica, incluindo uma resposta imune ativada com células T CD8+ no sangue e uma proliferação transitória de células B infectadas por EBV na orofaringe3. O curso da MI pode durar de 2 a 6 semanas e a maioria dos pacientes se recupera bem4. No entanto, alguns indivíduos desenvolvem sintomas persistentes ou recorrentes semelhantes aos MI com alta morbidade e mortalidade, que é classificada como infecção crônica ativa por EBV (CAEBV)5. Além disso, o EBV é um importante vírus oncogênico, que está intimamente relacionado a uma variedade de malignidades, incluindo malignidades epitelióides e linfoides, como carcinoma nasofaríngeo, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin (LH) e linfoma de células T/NK6. Embora o EBV tenha sido estudado por mais de 50 anos, sua patogênese e o mecanismo pelo qual induz a proliferação de linfócitos não foram totalmente elucidados.

Diversos estudos têm investigado as assinaturas moleculares para a imunopatologia da infecção por EBV por sequenciamento de transcriptoma. Zhong et al. analisaram o perfil do transcriptoma completo de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de crianças chinesas com MI ou CAEBV para descobrir que a expansão das células T CD8 + foi predominantemente encontrada no grupo IM7, sugerindo que as células T CD8 + podem desempenhar um papel importante na MI. Da mesma forma, outro estudo encontrou menores proporções de células T e CD19+ citotóxicas específicas para EBV e maiores porcentagens de células T CD8+ em pacientes com MI causada por infecção primária por EBV do que em pacientes com IM causada tanto pela reativação do EBV quanto por outros agentes8. As células B são envolvidas pela primeira vez na MI porque os receptores de EBV são apresentados em sua superfície. Al Tabaa et al. encontraram que as células B eram policlonalmente ativadas e diferenciadas em plasmoblastos (CD19+, CD27+ e CD20− e CD138−) e plasmócitos (CD19+, CD27+ e CD20−, e CD138+) durante o IM9. Além disso, Zhong et al. descobriram que os marcadores de monócitos CD14 e CD64 foram regulados positivamente no CAEBV, sugerindo que os monócitos podem desempenhar um papel importante na resposta imune celular do CAEBV através da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e fagocitose hiperativa7. Alka et al. caracterizaram o transcriptoma de células NK CD56 dim CD16+ classificadas por MACS de quatro pacientes de IM ou HL e descobriram que as células NK de IM e HL tinham imunidade inata e genes de sinalização de quimiocinas desregulados, o que poderia ser responsável pela hiporresponsividade das células NK10. Além disso, Greenough et al. analisaram a expressão gênica de células T CD8+ classificadas de 10 PBMCs de indivíduos com MI. Relataram que uma grande proporção de células T CD8+ na MI eram específicas do vírus, ativadas, dividindo-se e preparadas para exercer atividades efetoras11. Tanto as respostas específicas do EBV mediadas por células T quanto as respostas inespecíficas mediadas por células NK desempenham papéis essenciais durante a infecção primária por EBV. No entanto, esses estudos investigaram apenas os resultados do transcriptoma da mistura diversificada de células imunes ou apenas uma certa subpopulação de linfócitos, o que não é suficiente para a comparação abrangente das características moleculares e funções de diferentes subpopulações de células imunes em crianças com MI no mesmo estado de doença.

Este artigo descreve um método que combina contas imunomagnéticas e classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de PBMCs (monócitos, células T CD4+, células T CD8+, células B e células NK). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas usando um separador magnético e FACS ou analisadas por citometria de fluxo. O RNA pode ser extraído das células purificadas para sequenciamento do transcriptoma. Este método permitirá a caracterização e expressão gênica de diferentes células imunes nos mesmos estados de doença de indivíduos com MI, o que ampliará nossa compreensão da imunopatologia da infecção por EBV.

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Protocolo

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Amostras de sangue foram obtidas de pacientes com MI (n = 3), portadores saudáveis de EBV (n = 3) e crianças não infectadas por EBV (n = 3). Os voluntários foram recrutados do Hospital Infantil de Pequim, da Universidade Médica da Capital, e todos os estudos foram aprovados eticamente. A aprovação ética foi obtida pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University (Número de Aprovação: [2021]-E-056-Y). O consentimento informado dos pacientes foi dispensado, pois o estudo utilizou apenas as amostras restantes para testes clínicos. Todos os dados foram totalmente desidentificados e anonimizados para proteger a privacidade do paciente.

1. Isolamento de PBMCs do sangue periférico

  1. Coletar sangue periférico fresco (2 mL) de pacientes com MI em tubos de EDTA K3por punção venosa padrão.
    NOTA: O processo precisa ser rápido para manter a viabilidade celular.
  2. Diluir o sangue periférico em volume duplo com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e colocá-lo em camadas sobre o meio de separação de linfócitos humanos (densidade: 1,077 ± 0,001 g/mL) em um tubo de centrífuga de 15 mL.
    NOTA: A razão de volume de sangue, PBS e meio de separação foi de 1:1:1. Adicione o sangue lentamente ao meio de separação e centrifugar imediatamente para evitar que o sangue se deposite no meio de separação.
  3. Centrífuga a 800 × g durante 20 min à temperatura ambiente. Transfira a camada intermediária (PBMCs enriquecidos) para outro tubo de centrífuga de 15 mL.
    NOTA: Após a centrifugação, na parte inferior do tubo estão os eritrócitos, a camada intermediária é o meio de separação, a camada superior é o plasma, e entre a camada plasmática e a camada líquida de separação estavam os PBMCs (incluindo linfócitos e monócitos).
  4. Lavar os PBMCs com 10 mL de PBS e centrifugar a 800 × g por 20 min à temperatura ambiente; descarte o sobrenadante com cuidado.
  5. Repetir a lavagem e centrifugação (passo 1.4) 2 x. Ressuscite os PBMCs com 1 mL de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e conte as células com um contador automatizado à base de azul de tripano.

2. Isolamento de monócitos CD14+ de PBMCs usando microesferas CD14

  1. Preparar uma solução tampão contendo 0,5% de soro fetal bovino (FBS) e 2 mM de EDTA em PBS (pH 7,2). Mantenha o tampão frio (2−8 °C).
    NOTA: Desgaseifique o buffer antes de usar como bolhas de ar pode bloquear a coluna. Mantenha as células frias para evitar o tamponamento dos anticorpos na superfície celular e a marcação celular inespecífica.
  2. Centrifugar os PBMCs a 300 × g durante 10 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante com cuidado. Ressuspenda as células com 80 μL do tampão. Adicione 20 μL de microesferas CD14 à suspensão celular.
    NOTA: Se houver ≤107 PBMCs, use o volume indicado acima. Se houver >107 PBMCs, aumente proporcionalmente todos os volumes de reagentes e o volume total.
  3. Misture bem as microesferas CD14 e as células no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incube por 15 min em geladeira a 4 °C. Lavar os PBMCs com 1 mL de tampão e centrífuga a 300 × g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte completamente o sobrenadante. Ressuspenda as células com 500 μL do tampão.
    NOTA: Se houver ≤108 PBMCs, use o volume indicado acima. Se houver >108 PBMCs, aumente proporcionalmente o volume do buffer.
  4. Separação magnética com colunas:
    1. Coloque a coluna no separador magnético do talão e lave a coluna com 3 mL de tampão. Adicione a suspensão da célula (da etapa 2.3) à coluna.
    2. Recolher as células não marcadas que passam através da coluna para um tubo de centrífuga de 15 ml e lavar a coluna com 3 ml de tampão. Lave a coluna com 3 x 3 mL de tampão. Coletar o efluente total no tubo de centrífuga de 15 mL.
    3. Coloque a coluna em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Adicione 5 mL de tampão à coluna. Empurre o êmbolo firmemente para dentro da coluna para liberar imediatamente as células marcadas magneticamente para o tubo de centrífuga de 15 mL.
    4. Centrifugar as células marcadas magneticamente a 300 × g durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 μL de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para uso no sequenciamento subsequente do transcriptoma.

3. Separação de populações de linfócitos de PBMCs por coloração de anticorpos marcados fluorescentemente e FACS

  1. Centrifugar as células não marcadas (passo 2.4.2) a 300 × g durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 100 μL de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Adicione 2 μL de cada anticorpo marcado (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) aos 100 μL de suspensão celular (os volumes e as informações conjugadas de fluoróforo dos anticorpos são mostrados na Tabela 1), incubar no gelo por 30 minutos e proteger da luz.
  3. Lavar as células 2 x adicionando 1 mL de PBS e centrifugando a 300 × g por 5 min à temperatura ambiente. Ressuspender as células em 500 μL de PBS no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Vórtice a suspensão celular suavemente antes de adquirir dados em um citômetro classificador de células de fluxo.

4. Ajuste dos parâmetros da citometria de fluxo

  1. Recolher 100 μL da suspensão celular (ver secção 1) em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, conforme necessário, e configurar uma amostra de controlo negativo, uma amostra de coloração única de CD3, uma amostra de coloração única de CD4, uma amostra de coloração única de CD8, uma amostra de coloração única de CD19 e uma amostra de coloração de CD56/CD16.
  2. Adicionar 2 μL do anticorpo marcado fluorescentemente correspondente por 100 μL da suspensão celular e do vórtice. Incube no gelo por 30 minutos no escuro. Centrifugar durante 5 min a 300 × g e aspirar o sobrenadante. Ressuscite os pellets com 500 μL de PBS e vórtice.
  3. Comissione o fluxo de classificação e atrase as gotículas usando as esferas fluorescentes da seguinte forma:
    1. Abra o sistema de classificação de células, execute o programa de inicialização, instale o bocal de 85 μm e abra o fluxo de classificação. Defina a tensão de classificação para 4.500 V e a frequência para 47.
    2. Ajuste os parâmetros principalmente ajustando o ponto de interrupção da gota de fluxo principal e o atraso da gota de acordo com as instruções do fabricante12. Configure a primeira posição do ponto de interrupção do droplet (Drop1) para 275 e a Gap para 8 na janela Breakoff . Ative o modo de classificação automática Sweet Spot para permitir que a citometria determine automaticamente o valor da amplitude das gotículas para estabilizar o fluxo.
    3. Ajuste o atraso da gota para 30,31 na janela Side Stream carregando as esferas fluorescentes, garantindo que as contas atinjam uma deflexão de fluxo lateral de >99% no modo inicial ou de ajuste fino.
  4. Consulte a estratégia de gating mostrada na Figura 1 para executar o gating da seguinte maneira:
    1. Usando um gráfico de pontos de área de dispersão para frente (FSC-A)/área de dispersão lateral (SSC-A), desenhe a porta do polígono (P1) para identificar a população de linfócitos intacta .
    2. Usando um gráfico de pontos FSC-A/FSC-height (FSC-H), desenhe a porta do polígono (P2) para identificar as células simples e excluir os duplos (Figura 1A).
    3. Usando um gráfico de pontos CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, desenhe a porta retangular (P3) para selecionar células T CD3+ e células B CD19+ (Figura 1A,B).
    4. Usando um gráfico de pontos CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, desenhe uma porta retangular para selecionar células T CD4+ e células T CD8+ (células com alta fluorescência para esses marcadores, respectivamente).
    5. Usando um gráfico de pontos CD56/CD16 APC-A/SSC-A, desenhe uma porta retangular para selecionar células NK CD56+/CD16+ (Figura 1C).
  5. Ajuste os parâmetros instrumentais usando a amostra de controle negativo:
    1. Instale o tubo de controle negativo na porta de carregamento e clique em Carregar no Painel de Aquisição. Selecione as Configurações do citômetro no software.
    2. Na janela Inspetor, clique na guia Parâmetros e ajuste as tensões de FSC, SSC e diferentes corantes fluorescentes; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cianina 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cianina 5.5: 663.
  6. Ajustar a compensação usando as amostras de coloração única13.
    1. Carregue os tubos de coloração única na citometria sequencialmente e selecione Configurações do citômetro no software. Clique na guia Compensação para ajustar a compensação.
      NOTA: A referência de compensação da citometria de fluxo é mostrada na Tabela 2.

5. Classificação e coleta de dados de células via citometria de fluxo

  1. Vórtice da suspensão celular (PBMCs separados de acordo com as seções 1–3) brevemente para ressuspender as células antes de carregar o tubo no citômetro. Mantenha os tubos restantes no gelo.
  2. Adicione 200 μL de FBS a quatro tubos de fluxo de coleta para evitar a aderência das células classificadas à parede do tubo e coloque-as na câmara de coleta do citômetro.
  3. Coletar células T CD3+CD4+, células T CD3+CD8+, células B CD3−CD19+ e células NK CD3− CD56+/CD16+ separadamente da amostra de um paciente com MI nos quatro tubos de fluxo (Figura 2A).
  4. Centrifugar as células separadas a 300 × g durante 5 min e remover o sobrenadante. Adicione 200 μL de reagente de isolamento de RNA às células para sequenciamento do transcriptoma.
  5. Separe as subpopulações de células imunes das amostras de portadores saudáveis de EBV e crianças não infectadas por EBV de acordo com as etapas acima (Figura 2B, C).

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Resultados

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Referência da estratégia de confinamento
A estratégia de gating utilizada para classificar as quatro subpopulações de linfócitos é mostrada na Figura 1. Resumidamente, os linfócitos são selecionados (P1) em um gráfico de pontos mostrando a granulosidade (SSC-A) versus o tamanho (FSC-A). Em seguida, as células simples são selecionadas (P2) em um gráfico de pontos mostrando o tamanho (FSC-A) versus dispersão para frente (FSC-H), enquanto as células duplas são excluídas. As ...

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Discussão

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Este protocolo representa uma maneira eficiente de classificar as subpopulações de células imunes do sangue periférico. Neste estudo, amostras de sangue venoso de pacientes com MI, portadores de EBV saudáveis e crianças não infectadas por EBV foram selecionadas como objetivo da pesquisa. Este trabalho utilizando o sangue periférico de pacientes com MI concentra-se principalmente em analisar e determinar as proporções de diferentes subconjuntos celulares através da citometria de fluxo multicolorida. O sequenciamento do tr...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82002130), Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7222059) e pelo Fundo de Inovação CAMS para Ciências Médicas (2019-I2M-5-026).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
APC anti-humano CD16Biolegend302012Anticorpo fluorescente 
APC anti-humano CD56 (NCAM)Biolegend362504Anticorpo fluorescente 
APC/Cyanine7 anti-humano CD4Biolegend344616Anticorpo fluorescente 
Contador de células automatizadoBIO RADTC20Contagem de células
BD FACSAria ativada por fluorescência  fluxo  célula  citômetro-classificador (BD FACSAria II)Becton, Dickinson and Company644832Cell sort
CD14 MicroBeads, humanoMiltenyi Biotec130-050-201microesferas
Lâminas de célulasCTNG BIO RAD1450016Contagem de células
Tubos de centrífugaFalcon35209715Tubo de centrífuga de 15 mL
EDTA (≥ 99%, BioPremium)BeyotimeST1303EDTA
Tubos anticoagulantes de ácido tetra acético (EDTA) de etileno diaminaBecton, Dickinson and Company  367862 Tubos anticoagulantes EDTA
FITC anti-humano CD19Biolegend302206Anticorpo fluorescente 
Soro Fetal Bovino GibcoThermo Fisher Scientific16000-044Soro Fetal Bovino
  Alta velocidade  centrífugaSigma  Centrifugação de células 3K15para tubo de centrífuga de 15 mL
  Alta velocidade  centrífugaEppendorf5424RCentrifugação celular para tubo Eppendorf (EP) de 1,5 mL
Meio de separação de linfócitos humanosDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque
LS  Separação  colunasMiltenyi Biotec130-042-401Separação  colunas
Tubos de microcentrífugaAxygenMCT-150-CTubo de microcentrífuga de 1,5 mL
Separador MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302Separador de esferas magnéticas
PE anti-humano CD8Biolegend344706Anticorpo fluorescente 
PerCP/Cyanine5.5 anti-humano CD3Biolegend344808Fluorescente anticorpo 
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Tubos de fundo redondo de poliestirenoFalcon352235tubo de 5 mL para citômetro de fluxo FACS
Reagente TRIzolAmbion15596024Lyse células para extração de RNA
Kit de ensaio de viabilidade celular de coloração azul de tripanoBeyotimeC0011Coloração azul de tripano

Referências

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