Im lebenden Organismus Luminale Messung der durch Dehnung hervorgerufenen urothhelialen ATP-Freisetzung bei Nagetieren

Summary

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Messung von ATP-Konzentrationen im Lumen der Blase bei einem anästhesierten Nagetier.

Abstract

Es wird angenommen, dass ATP, das als Reaktion auf eine Blasendehnung aus dem Urothel freigesetzt wird, eine wichtige sensorische Rolle bei der Kontrolle der Miktion spielt. Daher ist die genaue Messung der Urothel-ATP-Freisetzung in einem physiologischen Umfeld ein wichtiger erster Schritt bei der Untersuchung der Mechanismen, die die purinerge Signalübertragung in der Harnblase steuern. Bestehende Techniken zur Untersuchung der mechanisch evozierten Urothel-ATP-Freisetzung verwenden kultivierte Zellen, die auf flexiblen Trägern oder Blasengewebe in Ussing-Kammern fixiert sind. Jede dieser Techniken ahmt jedoch die Bedingungen in der intakten Blase nicht vollständig nach. Daher wurde ein Versuchsaufbau entwickelt, um ATP-Konzentrationen im Lumen der Harnblase von Nagetieren direkt zu messen.

In diesem Aufbau werden die Blasen von anästhesierten Nagetieren durch Katheter sowohl in der Blasenkuppel als auch über die äußere Harnröhrenöffnung perfundiert. Der Druck in der Blase wird erhöht, indem der Harnröhrenkatheter verschlossen wird, während sterile Flüssigkeit durch die Kuppel in die Blase geleitet wird. Die Messung des intravesikalen Drucks erfolgt mit einem Druckwandler, der am Blasendomkatheter befestigt ist, ähnlich dem für die Zystometrie verwendeten Aufbau. Sobald der gewünschte Druck erreicht ist, wird die Kappe des Harnröhrenkatheters entfernt und Flüssigkeit für die ATP-Quantifizierung durch Luciferin-Luciferase-Assay gesammelt. Durch diesen Versuchsaufbau können die Mechanismen, die sowohl die mechanische als auch die chemische Stimulation der Urothel-ATP-Freisetzung steuern, untersucht werden, indem verschiedene Agonisten oder Antagonisten in das Perfusat aufgenommen oder die Ergebnisse zwischen Wildtyp- und genetisch veränderten Tieren verglichen werden.

Introduction

Es wird angenommen, dass ATP im Urin eine wichtige sensorische Rolle bei der Kontrolle der Miktion spielt¹. Zum Beispiel wird angenommen, dass ATP aus dem Urothel als Reaktion auf Dehnung freigesetzt wird, wo es auf Rezeptoren auf blasenafferente Nerven wirken kann, um ihre Erregbarkeit zu erhöhen, was zu Sättigungsgefühlen führt². Daher wird auch angenommen, dass ATP im Urin ein wichtiger Akteur bei der Entwicklung von Blasenpathologien sein könnte. Zur Unterstützung dieser Hypothese sind die ATP-Konzentrationen im Urin bei Patienten mit überaktiver Blase (OAB)³, Blasenschmerzsyndrom/interstitieller Zystitis (BPS/IC)⁴ oder einer Harnwegsinfektion (UTI)^5,6 signifikant erhöht, alles Zustände, die durch erhöhte Dringlichkeit^, Häufigkeit und manchmal Schmerzen gekennzeichnet sind. Umgekehrt wurde bei Patienten, die an einer Unterfunktion der Blase (UAB) leiden, die durch die Unfähigkeit gekennzeichnet ist, die Blase zu entleeren, und die manchmal eine verminderte Fähigkeit zur Wahrnehmung der Blasenfülle aufweisen kann, eine^verminderte ATP-Konzentration im Urin nachgewiesen 7. Experimentell kann die Manipulation der ATP-Konzentrationen im Urin die Blasenreflexe bei der Ratte verändern. Die Erhöhung der ATP-Konzentrationen durch die Blockierung endogener ATPasen im Blasenlumen kann die Blasenentleerungshäufigkeit erhöhen, während die Verringerung der ATP-Konzentrationen durch Einträufeln exogener ATPasen in die Blase die Blasenentleerungshäufigkeit verringert⁸. Somit ist die Bedeutung von ATP im Urin für die Blasenfunktion klar.

Angesichts der offensichtlichen Bedeutung von ATP im Urin für die Pathologie der Blase ist die genaue Messung der Urothel-ATP-Freisetzung ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Mechanismen, die die Freisetzung kontrollieren. Viele Studien wurden mit verschiedenen experimentellen Modellen durchgeführt, um die Urothel-ATP-Freisetzung zu messen. An erster Stelle stehen dabei Zellkulturen, entweder Primärkulturen oder Zelllinien. Die Verwendung von kultivierten Urothelzellen wird jedoch durch die Tatsache erschwert, dass Urothelzellen ihre physiologisch polarisierte Morphologie nur annehmen, wenn sie auf speziellen durchlässigen Membranen gezüchtet werden (z. B. Transwell-Technologie [Well-Inserts])⁹. Daher ist es schwierig, eine gemessene ATP-Freisetzung mit der Physiologie in Verbindung zu bringen. Urothelzellen, die auf Well-Inserts gezüchtet werden, können polarisieren und eine Barriere bilden, die dem ähnelt, was in vivo beobachtet wird. Das Wachstum eines vollständig differenzierten Urothels kann jedoch Tage oder Wochen dauern. Während es möglich ist, gut eingesetzte Einsätze in einer Ussing-Kammer zu montieren und Druck auf die apikale Seite auszuüben, um eine Dehnung zu verursachen, ist es schwierig, genügend Druck auszuüben, um die Bedingungen in der Blase während der Pathologie nachzuahmen (d.h. Drücke von 30 cm H₂O oder höher). Ganzes Blasengewebe kann auch in einer Ussing-Kammer für Dehnungsexperimente montiert werden, aber dies entfernt die Blase aus dem Organismus zusammen mit den trophischen Faktoren, die die Gesundheit der Urothelzellen und damit die Funktion der Urothelbarriere aufrechterhalten. Daher ist der physiologisch relevanteste Weg, um die Freisetzung von ATP aus dem Urothel als Reaktion auf Dehnung oder Druck zu untersuchen, in vivo. Die chirurgischen Techniken, die für den Aufbau des Experiments erforderlich sind, sind identisch mit denen, die üblicherweise in der Zystometrie bei Tieren verwendet werden, und sollten daher von jedem, der mit dieser Technik vertraut ist, leicht durchgeführt werden können.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Technik, die zur Untersuchung von luminalem ATP bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von etwa 200-250 g verwendet wird, da die unten beschriebene transurethrale Katheterisierung bei Weibchen viel einfacher ist. Die transurethrale Katheterisierung kann jedoch auch bei männlichen Nagetieren^{durchgeführt werden 10}. Da nun auch bei Mäusen beiderlei Geschlechts eine transurethrale Katheterisierung durchgeführt wurde¹¹, können diese Experimente leicht an Mäuse oder Ratten beiderlei Geschlechts oder unterschiedlicher Größe angepasst werden, je nach den Bedürfnissen des Forschungsteams.

Protocol

Alle Verfahren, die an Nagetieren durchgeführt werden, müssen den geltenden Richtlinien entsprechen und von der lokalen institutionellen Ethikkommission genehmigt werden. Die Experimente, die für dieses Manuskript durchgeführt wurden, wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden des National Research Council für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pittsburgh School of Medicine genehmigt. In Abbildung 1 sehen Sie eine modifizierte Version des Standard-Zystometrie-Setups für Nagetiere, das in diesem Protokoll verwendet wird.

1. Versuchstiere

1. Halten Sie die Ratten in Sozialwohnungen (mehrere Nagetiere in einem Käfig) mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und ad libitum Zugang zu Wasser und Futterpellets.

2. Anästhesie und Ganglienblock

1. Induzieren Sie eine Erstanästhesie, indem Sie das Tier in eine geschlossene Box legen, die mit 4%-5% Isofluran in_O2 (1 l/min) begast ist.
2. Betäuben Sie das Tier mit Urethan.
   1. Urethan wird subkutan beidseitig (1/2 Dosis auf jeder Seite des Tieres) in einer Dosis von 1,2 g/kg injiziert. Legen Sie das Tier in einen Käfig, damit das Urethan wirken kann, was in der Regel 2 Stunden dauert.
   2. Alternativ können Sie Urethan intraperitoneal (i.p.) verabreichen, indem Sie die volle Dosis in zwei separaten Dosen im Abstand von ~ 10 Minuten injizieren.
3. Nachdem Sie auf die entsprechende Zeit gewartet haben, bis das Urethan seine Wirkung entfaltet (s.c.: 2 h, i.p.: 30 min), prüfen Sie, ob die Anästhesie richtig ist, indem Sie den Fuß des Tieres mit einer Pinzette einklemmen. Wenn ein Reflex beobachtet wird, verabreichen Sie eine zusätzliche Dosis Urethan (0,05-0,1 ml i.p.), warten Sie 15 Minuten und testen Sie erneut. Überwachen Sie das Tier während des gesamten Eingriffs weiterhin auf die richtige Anästhesieebene.
4. Um eine Kontraktion der Blase während der Blähung zu verhindern, injizieren Sie dem Tier einen ganglionären Blocker wie Hexamethonium (20 mg/kg, i.p.).
5. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen während des Versuchs zu verhindern.

3. Chirurgischer Eingriff - suprapubische Blasenkatheterisierung

1. Rasieren Sie den Bauch des Tieres und führen Sie eine Mittellinien-Laparotomie durch, um die Harnblase freizulegen.
2. Bereiten Sie einen Katheter vor, indem Sie ein Ende eines kurzen (~ 10-15 cm) langen PE50-Intramedic-Schlauchs mit einer Flamme aufblitzen. Setzen Sie eine 22-g-Nadel in das andere Ende des Schlauchs ein und füllen Sie sie mit Krebs-Lösung (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung).
3. Legen Sie eine kleine Schleife aus 3-0 Seidennaht über die Blasenkuppel und führen Sie eine kleine Zystostomie (mit einer feinen Schere oder einer 18-G-Nadel) durch, die groß genug ist, um das ausgestellte Ende des oben gemachten Katheters einzuführen. Halten Sie mit einer Hand den Katheter an Ort und Stelle und ziehen Sie mit der anderen Hand die Schlaufe der Naht fest, um den Katheter an Ort und Stelle zu fixieren. Beenden Sie die Sicherung des Katheters, indem Sie zwei Knoten in die Naht binden und den Katheter zurückziehen, bis der ausgestellte Kopf in Kontakt mit der Blasenwand ist.
   1. Alternativ können Sie den Katheter mit einer klassischen Verschlusstechnik sichern, wie sie zuvor für die Zystometrie¹² beschrieben wurde.
      HINWEIS: Es ist unbedingt erforderlich, während dieses Verfahrens keine Luftblasen in die Blase einzuführen.
4. Testen Sie das Setup auf Lecks, indem Sie eine kleine Menge Krebslösung durch den Katheter injizieren. Wenn die Flüssigkeit aus der Zystostomie austritt, sichern Sie den Katheter mit zusätzlicher Naht um die Zystostomie.

4. Transurethrale Katheterisierung

1. Tauchen Sie das Ende eines 20 g x 1" Infusionskatheters (mit entfernter Nadel) in chirurgisches Gleitmittel.
2. Halten Sie den äußeren Meatus urethralis vorsichtig mit einer Pinzette fest und führen Sie die Spitze des Katheters in Richtung Schwanz in die Harnröhrenöffnung ein, bis sich die Wand der angrenzenden Scheidenöffnung verformt. Drehen Sie den Katheter um 90° (bringen Sie das Luer-Lock-Ende des Katheters in Richtung Schwanz) und bewegen Sie ihn vorsichtig vor. Führen Sie den Katheter vollständig ein, bis die Luer-Lock-Nabe etwa 5 mm von der äußeren Harnröhrenöffnung entfernt ist.
   HINWEIS: Führen Sie den Katheter nicht zu weit ein, da dies dazu führen kann, dass die Spitze in die Innenwand der Blase stößt. Wenn beim Vorschieben des Katheters ein Widerstand zu spüren ist, stoppen Sie und beginnen Sie erneut oder riskieren Sie, die Harnröhre zu punktieren. Weitere Informationen finden Sie im Diskussionsabschnitt mit Tipps zur Steigerung der erfolgreichen Katheterisierung.
3. Sichern Sie den Katheter und verhindern Sie ein Auslaufen um den Katheter, indem Sie eine kurze 3-0-Seidennaht um den äußeren Harnröhrenfleisch schlingen und fest abbinden. Befestigen Sie den Katheter mit Klebeband am Schwanz, um zu verhindern, dass er versehentlich herausgezogen wird.
4. Nach der Katheterisierung wird die Krebslösung vorsichtig durch den suprapubischen Blasenkatheter in die Blase infundiert und bestätigt, dass die Flüssigkeit aus dem Harnröhrenkatheter und nicht um ihn herum fließt. Falls erforderlich, binden Sie die Naht um die äußere Harnröhrenöffnung.
5. Schließen Sie den Bauchschnitt über der Blase mit einer 3-0 Seidennaht.

5. Versuchsaufbau

1. Sichern Sie das Tier auf einem Brett, das geneigt werden kann, um den Abfluss von intravesikärer Flüssigkeit durch den Harnröhrenkatheter zu unterstützen. Platzieren Sie ein Heizkissen und eine saugfähige Unterlage zwischen dem Tier und dem Brett, um die Körperwärme aufrechtzuerhalten und die aus dem Harnröhrenkatheter abfließende Flüssigkeit aufzunehmen.
2. Verbinden Sie den suprapubischen Katheter mit einem Dreiwegehahn, der den Katheter mit einer Spritzenpumpe und einem Druckaufnehmer verbindet. Schließen Sie den Druckmessumformer über einen Verstärker und ein Datenerfassungssystem an einen Computer an.
   HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass sich keine Luftblasen in dem Schlauch bilden, der die Spritzenpumpe, den Schallkopf und den Blasenkatheter verbindet.
3. Kalibrieren Sie die Blasendruckaufzeichnung mit dem vom Hersteller des Druckaufnehmers und/oder der Datenerfassungssoftware empfohlenen Verfahren.
4. Infusion der Krebslösung durch den suprapubischen Katheter mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/min und 1 h aus dem Harnröhrenkatheter abfließen lassen, um das bei den Katheterimplantationen freigesetzte restliche ATP auszuwaschen.
5. Nach dieser Auswaschphase verschließen Sie den Harnröhrenkatheter mit einem Luer-Lock-Stopfen und messen den Druck in der Blase. Achten Sie auf einen langsamen Anstieg des intravesikanischen Drucks auf einen Druck von 30 cm_H2Oohne starken Druckanstieg, was auf eine Blasenkontraktion hindeuten würde (siehe Abbildung 2). Entfernen Sie den Pfropfen aus dem Harnröhrenkatheter, wenn der Druck 30 cm H₂O erreicht, um eine Schädigung der Blase zu vermeiden.
   HINWEIS: Wenn die Blasenkontraktionen nach 1 Stunde anhalten, ist eine zusätzliche Dosis Hexamethonium (5 mg/kg Dosis i.p.) zu verabreichen.

6. Entnahme von Proben

1. Infusion der Blase mit 0,1 ml/min und Entnehmen Sie das Eluat aus dem Harnröhrenkatheter. Testen Sie 100 μL Aliquots des Eluats sofort auf ATP (siehe unten) oder frieren Sie es für die spätere Chargenquantifizierung ein.
2. Um die Wirkung der Blasendehnung auf luminale ATP-Konzentrationen zu testen, verschließen Sie den Harnröhrenkatheter mit dem Stöpsel und überwachen Sie den Blasendruck, bis er das gewünschte Niveau erreicht. Dann entdeckeln Sie den Harnröhrenkatheter und sammeln Sie das Eluat für die ATP-Messung oder das Einfrieren, wie oben beschrieben.
3. Lassen Sie die Blase nach jeder Dehnung 10-15 Minuten ruhen und auswaschen, bevor Sie weitere Proben entnehmen. Nehmen Sie insgesamt 3-5 Vordehnungsproben und 3-5 Proben bei jedem gewünschten Dehndruck, um die Wiederholbarkeit nachzuweisen.
4. Um die Wirkung von Medikamenten auf die Freisetzung von ATP zu testen, wechseln Sie die Krebslösung, die die Blase infundiert, auf Krebs, der das Medikament der Wahl enthält. Perfundiert bei 0,1 ml/min für 10-15 Minuten, damit das Arzneimittel eine Wirkung entfaltet, und sammeln Sie dann die Proben aus nicht aufgeblähten und aufgeblähten Blasen, wie in den Schritten 6.1 und 6.2 beschrieben.

7. Quantifizierung von ATP aus gesammelten Proben

1. Quantifizieren Sie ATP in den entnommenen 100-μl-Proben mit einem handelsüblichen Luciferin/Luciferase-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers und einem Luminometer.
   1. Um ATP zu quantifizieren, kombinieren Sie 100 μL-Proben Perfusat mit 50 μL der Assay-Mischung und legen Sie sie zum Ablesen in das Luminometer. Um die vom Luminometer gemeldeten relativen Lichteinheiten (RLUs) in eine ATP-Konzentration umzuwandeln, führen Sie serielle Verdünnungen von ATP in Krebs-Lösung im Bereich von 1 μM bis 10 pM in 10-fachen Verdünnungen durch, um eine Standardkurve zu erstellen und sie im Luminometer zu lesen. Zeichnen Sie die resultierenden Messwerte in einem Diagramm auf und führen Sie eine nichtlineare (quadratische) Regression durch, um die Konzentrationen aus den Proben des Tieres zu extrapolieren.
      HINWEIS: Es ist wichtig, ATP-Standards für jede im Experiment getestete Arzneimittellösung festzulegen, da viele Medikamente die Luciferin / Luciferase-Reaktion stören, die korrigiert werden muss.

8. Euthanasie von Tieren

1. Wenn das Experiment abgeschlossen ist und alle Proben gesammelt sind, wird das Tier gemäß den USDA-Richtlinien und dem Leitfaden des National Research Council für die Pflege und Verwendung von Labortieren auf humane Weise eingeschläfert.
   1. Nehmen Sie das betäubte Tier aus dem Versuchsaufbau, legen Sie es in eine geschlossene Box und begasen Sie es mit 100%_CO2. Stellen Sie sicher, dass die Füllrate 30%-70% des Kammervolumens pro Minute beträgt (z. B. 3-7 l/min für eine Box mit einem Volumen von 10 l). Setzen Sie den CO₂ -Fluss für mindestens 1 Minute fort, nachdem die Atmung aufgehört hat.
2. Verwenden Sie eine sekundäre Form der Euthanasie, um den Tod zu gewährleisten.
   1. Führen Sie eine Thorakotomie als sekundäre Form der Sterbehilfe durch, indem Sie den kleinen Hautlappen am kaudalen Ende des Brustbeins ergreifen und mit einer scharfen Schere ein kleines Loch in die Haut und die Muskulatur am Zwerchfell schneiden. Schließen Sie die Thorakotomie ab, indem Sie die Schere in die Öffnung einführen und rostral durch den Brustkorb schneiden und die Brusthöhle freilegen.
      HINWEIS: Das eingeschläferte Tier sollte gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgt werden.

Representative Results

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die genaue Messung der Urothel-ATP-Freisetzung in vivo aus dem Lumen der Blase unter Verwendung einer modifizierten Version des Standard-Nagetier-Zystometrie-Setups (siehe Abbildung 1). Dies ermöglicht es dem Forscher, die Auswirkungen von Medikamenten auf die dehnungsvermittelte ATP-Freisetzung in einem physiologischen Umfeld zu untersuchen.

Abbildung 1: Versuchsaufbau. (A) Abbildung des Versuchsaufbaus mit den verschiedenen beschrifteten Geräten. Der Bereich des Tieres, der in einem roten Rechteck umrandet ist, ist in B dargestellt. (B) Fotografie, die den Bauch der Ratte nach der Operation zeigt. Beachten Sie den suprapubischen Katheter, der in die Blasenkuppel eingeführt und gebunden wird, sowie den Harnröhrenkatheter, der durch die äußere Öffnung eingeführt wird. Der Harnröhrenkatheter wird in das Foto eingesteckt, um zu zeigen, dass der Blasendruck während der Perfusion durch den Blasenkatheter erhöht ist. Während des Experiments wurde die Bauchöffnung vernäht, hier aber offen gelassen, um die Visualisierung der Harnblase zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Von primärer Bedeutung für die erfolgreiche Messung der dehnungsvermittelten ATP-Freisetzung in der Nagetierblase ist die Sicherstellung, dass der Miktionsreflex blockiert wird, so dass die Blase über den Schwellendruck hinaus ausgedehnt werden kann, der normalerweise ausreicht, um den Miktionsreflex zu aktivieren. Wie in Abbildung 2A gezeigt, führt die Infusion der Lösung in die Blase beim Verstopfen des Harnröhrenkatheters dazu, dass der intravesikale Druck stark ansteigt, wenn sich die Blase zusammenzieht. Da wir uns für die Auswirkungen der passiven Dehnung, nicht der Kontraktion, auf die Urothel-ATP-Freisetzung interessieren, wird das Tier mit einem Ganglienblocker, Hexamethonium, behandelt, um den Miktionsreflex zu verhindern. Wie in Abbildung 2B dargestellt, führt bei der Verabreichung von Hexamethonium das Einträufeln der Lösung in die Blase mit blockiertem Harnröhrenkatheter zu einem viel langsameren Anstieg des intravesikanischen Drucks, so dass der Druck ohne Kontraktion auf bis zu 30cm H2O ansteigen kann. Dies ermöglicht die Messung der luminalen ATP-Freisetzung bei Drücken, die hoch genug sind, um für die Pathologie relevant zu sein, wie sie bei einer Unterfunktion der Blase, einer teilweisen Blasenaustrittsobstruktion oder bei einer Detrusor-Sphinkter-Dyssynergie nach einer Rückenmarksverletzung beobachtet werden. Während es eine zusätzliche Dosis von Hexamethonium erfordern kann, um den Miktionsreflex vollständig zu blockieren, sollte darauf geachtet werden, dass nicht genug verabreicht wird, um zu einer Überdosierung zu führen. Dies könnte zu einer signifikanten Verringerung des Herzzeitvolumens führen und die Qualität des Experiments beeinträchtigen. Es sollte beachtet werden, dass die gleiche hemmende Wirkung auf den Blasenreflex erreicht werden kann, indem entweder die Beckennerven bilateral durchtrennt oder das Rückenmark auf Höhe L4 oder höher durchtrennt wird. Dies erhöht natürlich die Schwierigkeit des Versuchsaufbaus und die Zeit, die benötigt wird, um das Experiment abzuschließen, erheblich.

Abbildung 2: Druckaufnahmen von Ratten. Vor (A) und nach (B) Ganglienblock. Pfeile zeigen an, wann der Harnröhrenkatheter verstopft war. Beachten Sie, dass der Druck in der oberen Spur schnell ansteigt, wenn der Druck die Schwelle erreicht, um Miktion zu induzieren, während der Druck in der unteren Spur allmählich ansteigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Eine weitere sehr wichtige Überlegung bei diesen Experimenten ist die korrekte Umrechnung der Luminometermesswerte (normalerweise in RLUs ausgedrückt) in eine ATP-Konzentration unter Verwendung von Standardkurven. Die Luciferin/Luciferase-Reaktion ist sehr anfällig für Störstoffe¹³. Diese Interferenz kann von einer direkten Wechselwirkung mit Luciferin/Luciferase herrühren. Zum Beispiel kann eine Reihe von Verbindungen als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren von Luciferase wirken; Eine Studie deutete darauf hin, dass ~ 3% der Verbindungen im Molecular Libraries Small Molecule Repository die Glühwürmchen-Luciferase bei Konzentrationen unter 11 μM¹⁴ hemmen könnten. Darüber hinaus ist Luciferin anfällig für Oxidationsmittel, wodurch die Menge an Substrat reduziert wird, die für die Lumineszenz-erzeugende Reaktion zur Verfügung steht¹⁵. Es ist auch möglich, die Luciferin/Luciferase-Reaktion zu stören, indem die Verfügbarkeit des Co-Faktors Magnesium der Reaktion verändert wird. Zum Beispiel besteht eine gängige Technik zur Nachahmung der mechanischen Dehnung in In-vitro-ATP-Experimenten darin, eine Zellschwellung zu induzieren, indem die Osmolarität der Perfusionslösung verringert wird. Viele Forscher erreichen diese Reduktion jedoch, indem sie die Lösung mit Wasser verdünnen und so die Konzentration von Magnesium reduzieren, das als Co-Faktor in der Luciferin / Luciferase-Reaktion wirkt. Darüber hinaus werden einige Medikamente als Magnesiumsalze verkauft, die die Menge an Magnesium in der Lösung stark erhöhen können, was auch zu messbaren Unterschieden in den Lumineszenzwerten führt. Schließlich ist es möglich, dass eine Arzneimittellösung die Fähigkeit beeinträchtigt, das durch die Luciferin/Luciferase-Reaktion erzeugte Licht genau zu messen. Brilliant Blue FCF (BB-FCF, auch bekannt als Erioglaucin oder FD&C Blue Dye #1) ist ein spezifischer Inhibitor der Pannexin-vermittelten ATP-Freisetzung¹⁶. Bei effektiven Dosen hat die Brilliant Blue FCF-Lösung einen deutlichen Blauton, der Licht bei einem Peak von etwa 600 nm^{absorbiert 17}. Dies liegt im Bereich der Wellenlängen des Lichts, das von der Glühwürmchen-Luciferase emittiert wird. Daher wird die Lichtemission bei Experimenten mit BB-FCF stark reduziert. Daher ist es zwingend erforderlich, dass Standardkurven unter Verwendung bekannter Mengen an ATP, die in Lösungen gelöst sind, die jeden experimentellen Wirkstoff enthalten, verwendet werden, um die ATP-Freisetzung während des Experiments zu quantifizieren. Wie in Abbildung 3 gezeigt, verringert BB-FCF (100 μM) die Steigung der Standardkurve signifikant, was ausreicht, um die berechneten Werte für die ATP-Konzentration in der Probe signifikant zu verändern. Wie unten in Abbildung 3 gezeigt, kann die Verwendung des Krebs-Standards zur Berechnung der ATP-Konzentration in einer Probe, die BB-FCF enthält, zu einer Unterschätzung der ATP-Konzentration um ~ 50% führen. In einigen Fällen kann die Verwendung der falschen Standardkurve eine medikamentenvermittelte Änderung der ATP-Freisetzung verschleiern oder fälschlicherweise so aussehen lassen, als ob eine Änderung stattgefunden hätte. In dem in Abbildung 3 dargestellten Experiment hätte beispielsweise die Verwendung des Krebs-Standards für alle Proben den Anschein erweckt, dass Brilliant Blue FCF die ATP-Freisetzung um ~ 67% (16,6 bis 5,5 nM) reduzierte, während sie in Wirklichkeit nur ~ 42% (16,6 bis 9,6 nM) abgenommen hatte.

Abbildung 3: Auswirkungen von experimentellen Medikamenten auf die ATP-Standardkurve. Es ist zu beachten, dass der Pannexinkanal-Antagonist Brilliant Blue die für eine bestimmte ATP-Konzentration gemessenen RLUs signifikant verändert, was zu einer Unterschätzung des gemessenen ATP führen würde, wenn es nicht korrigiert wird. Abkürzung: RLUs = relative leichte Einheiten; BB-FCF = Brilliant Blue FCF. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Eine weitere Überlegung, die zu beachten ist, ist, dass ATP häufig als Folge einer Schädigung aus dem Gewebe freigesetzt wird und dass diese chirurgischen Eingriffe und das Einführen eines Harnröhrenkatheters zu ungewöhnlich hohen ATP-Werten führen, wenn sie zu früh nach der Einrichtung durchgeführt werden. Dieses Verfahren beschreibt eine 1-stündige Auswaschzeit nach dem Aufbau des Experiments, die nicht übersprungen werden sollte. Wir haben festgestellt, dass nach 1 h die ATP-Konzentrationen, die in Proben gemessen wurden, die entnommen wurden, wenn die Blase nicht aufgebläht ist, relativ niedrig sind (~ 10-30 nM), während Proben, die vor der Auswaschphase entnommen wurden, eine Größenordnung höher sein können. Kurze, 5-minütige Auswaschungen sollten auch zwischen den Dehnungen durchgeführt werden, da der ATP-Spiegel für kurze Zeit erhöht bleiben kann. Eine gute Faustregel wäre, ATP zu Beginn des Experiments und nach jeder Dehnung in mehreren Proben zu messen und erst dann fortzufahren, wenn sich die ATP-Werte einpendeln. In Abbildung 4 zeigen wir eine Darstellung eines typischen Experiments mit Messungen, die zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt wurden. Beachten Sie die hohen Messwerte, die vor dem Auswaschen (Proben # 1 und # 5) im Vergleich zu denen nach dem Auswaschen (Proben # 2 und # 6) gemessen wurden.

Abbildung 4: Darstellung eines typischen Experiments. Eine stilisierte Darstellung einer typischen Druckaufzeichnung. Jede Zahl steht für einen Zeitpunkt, zu dem eine Probe entnommen und auf ATP gemessen wurde: 1) unmittelbar nach Abschluss des Setups, vor der Auswaschphase, 2) nach einer Auswaschphase von 1 Stunde, 3) unmittelbar vor einer Dehnung, 4) während der Dehnung, 5) unmittelbar nach einer Dehnung und 6) nach einer kurzen Auswaschphase nach der Dehnung. Die nebenstehende Tabelle zeigt repräsentative RLU-Werte und ATP-Konzentrationen für jede Probe. Abkürzung: RLUs = Relative Light Units. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5 zeigt repräsentative Grafiken von experimentellen Ergebnissen, die den Mechanismus der ATP-Freisetzung aus dem Urothel untersuchen. Wie in Abbildung 5A gezeigt, führt ein steigender Druck zu einem signifikanten Anstieg der ATP-Konzentration im Lumen der Blase, wobei ein Druck von 30 cm Wasser die Konzentrationen um fast das 2,5-fache der nicht aufgeblähten Kontrollen erhöht. Die intravesikale Perfusion von 2 U/ml Apyrase, einem Enzym, das die Hydrolyse von ATP katalysiert, verringert signifikant die gemessene ATP-Konzentration im Blasenlumen. Umgekehrt erhöht die intravesikale Perfusion von ARL67156, einem Inhibitor von NTPDasen, die auf dem Urothel vorhanden sind, die luminalen ATP-Konzentrationen signifikant. Abbildung 5B zeigt die Experimente zum Mechanismus der dehnungsinduzierten ATP-Freisetzung aus dem Urothel. Die Perfusion mit den Pannexinkanal-Antagonisten Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) oder Carbenoxolon (CBX, 100 μM) reduziert die Freisetzung von ATP in das Blasenlumen bei allen Drücken signifikant. Die luminalen ATP-Konzentrationen werden nicht verringert, wenn der Connexin-Blocker 18α-Glycyrrhetinsäure perfundiert wird, was darauf hindeutet, dass die durch Dehnung hervorgerufene ATP-Freisetzung durch Pannexinkanäle und nicht durch Connexinkanäle vermittelt wird.

Abbildung 5: Repräsentative Messungen der durch Dehnung hervorgerufenen ATP-Freisetzung im Lumen der Harnblase. (A) Die Dehnung der Blase erhöht die luminalen ATP-Konzentrationen, die in Gegenwart der NTPDase-Apyrase (2 U/ml) vermindert oder erhöht werden können, wenn endogene NTPDasen mit ARL67156 (10 μM) gehemmt werden. (B) Die durch Dehnung hervorgerufene ATP-Freisetzung wird durch die Pannexinkanalantagonisten Brilliant Blue FCF (BB-FCF, 100 μM) und Carbenoxolon (CBX, 100 μM) blockiert, nicht jedoch durch den Connexinkanal-Antagonisten 18α-Glycyrrhetinsäure (18α-GA, 50 μM). Die Daten werden als Mittelwert mit Standardfehlerbalken dargestellt. ** p < 0,05 zwischen den beiden Balken, die durch die Linie angezeigt werden, ## p < 0,05 im Vergleich zu Krebs-Kontrollen bei gleicher Dehnung. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Beckel et ^al.8 abgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Der Großteil der Forschung zur Urothel-ATP-Freisetzung wird in kultivierten Zellen durchgeführt, wobei entweder immortalisierte Zelllinien oder Primärkulturen von Nagetier-Urothelzellen verwendet werden. Während diese Modelle den Vorteil haben, dass sie einen relativ hohen Durchsatz haben (d.h. eine Kultur / Passage kann viele Platten / Schalen von Zellen bilden), wird ihre physiologische Relevanz verringert durch: 1) die Unfähigkeit von Urothelzellen, polarisiert zu wachsen, es sei denn, sie werden auf speziellen Trägern gezüchtet und 2) die Schwierigkeit, kultivierte Zellen physiologischen Dehnungs- / Druckniveaus auszusetzen. Eine Möglichkeit, mit diesen Einschränkungen umzugehen, besteht darin, die Blase von einem Nagetier zu entfernen, sie aufzuschneiden und in eine Ussing-Kammer zu legen, wobei das Blasengewebe zwischen zwei Halbkammern eingeführt wird, die mit physiologischer Lösung gefüllt sind. Dies ermöglicht es dem Forscher, das Urothel in seinem nativen polarisierten Zustand einer Dehnung auszusetzen, indem er der Urothelseite der Kammer Volumen hinzufügt, was zu einer Dehnung des Blasengewebes in der Kammer führt. Es ist jedoch schwierig, diese Dehnung mit der Dehnung in Verbindung zu bringen, die das Urothel in vivo beobachtet. Darüber hinaus wird durch Dehnung hervorgerufenes ATP in der Ussing-Kammer in das große Volumen der in der Kammer enthaltenen physiologischen Flüssigkeit freigesetzt, wodurch die ATP-Konzentration um ein Vielfaches verdünnt wird. Mit diesem Verfahren wird der Blasendruck direkt gemessen, so dass die Dehnung in einem physiologisch oder pathophysiologisch relevanten Bereich gehalten werden kann. Da wir die ATP-Konzentration direkt aus der luminalen Flüssigkeit messen und nicht aus einer willkürlichen und übermäßigen Menge an Flüssigkeit, die zur Erhaltung des Gewebes in vitro verwendet wird, muss die gemessene Konzentration nicht korrigiert werden. Das in dieser Arbeit beschriebene Verfahren ermöglicht es dem Forscher, die ATP-Freisetzung im Blasenlumen unter Bedingungen zu untersuchen, die physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen der Blase viel ähnlicher sind.

Die beschriebene Technik ist den Standard-Zystometrie-Techniken, die verwendet werden, um die Auswirkungen von Medikamenten auf die Reflexblasenaktivität zu untersuchen, sehr ähnlich und sollte von jedem, der diese Experimente routinemäßig durchführt, leicht durchgeführt werden können. Für diejenigen Forscher, die neu in der Blasenkatheterisierung sind, gibt es jedoch einige Vorbehalte, die zu beachten sind. Erstens kann die transurethrale Katheterisierung für Unerfahrene aufgrund der Krümmung der Harnröhre von Nagetieren schwierig sein. Dies kann auch durch die Dichtheit des äußeren Harnröhrenschließmuskels erschwert werden, selbst unter Urethan-Anästhesie. Es ist unbedingt erforderlich, dass der Forscher nicht versucht, den Katheter in die Harnröhre zu zwingen, da dies höchstwahrscheinlich zu einer erhöhten Entzündung und Schwellung führt, was wiederum die erfolgreiche Katheterisierung der Harnröhre erschwert. Darüber hinaus ist es möglich, den Katheter durch die Wand der Harnröhre zu stechen und das gesamte Experiment zu ruinieren.

Wir haben einige Tipps und Tricks entwickelt, um die Erfolgsquote zu erhöhen. Zum Beispiel ist es manchmal notwendig, dem Tier eine weitere kurze Dosis inhalatives Isofluran (0,5% -1,0%) zu verabreichen, um den Harnröhrenschließmuskel zu entspannen. Dies sollte sparsam und mit Vorsicht erfolgen, da die Kombination von Urethan und Isofluran zu einer Atemdepression führen kann. Ein weiterer Trick besteht darin, die Spitze des Katheters in eine 2% ige Lidocainlösung zu tauchen, bevor sie in die äußere Harnröhrenöffnung eingeführt wird. Dies führt oft dazu, dass sich der Schließmuskel nach einigen Minuten entspannt. Das Entleeren der Blase durch sanftes Drücken auf den Bauch des Tieres kann auch dazu beitragen, den Harnröhrenschließmuskel zu entspannen. Schließlich kann es notwendig sein, einen Katheter mit kleinerer Dicke zu verwenden. Wir verwenden manchmal einen 24 G Katheter, besonders bei kleineren Tieren. Beachten Sie jedoch, dass es notwendig sein kann, die Infusionsrate in die Blase zu reduzieren, wenn Sie einen transurethralen Katheter mit kleinerer Dicke verwenden, um die langsamere Drainage aus dem Harnröhrenkatheter auszugleichen. Andernfalls würde der Blasendruck ansteigen, obwohl der Harnröhrenkatheter nicht verschlossen ist.

Es sollte beachtet werden, dass Urethan in diesem Protokoll als Anästhetikum verwendet wird. Urethan wird häufig in Laboratorien verwendet, die die unteren Harnwege untersuchen, da es den Miktionsreflex schont, während andere Anästhetika dies nicht tun. Aus diesem Grund löst eine Dehnung der Blase über einem Druck von ~ 7-10 cm H₂O unter Urethan-Anästhesie einen Miktionsreflex aus. Da wir an der ATP-Freisetzung als Reaktion auf passive Dehnung interessiert sind, fordert dieses Protokoll die Blockierung von Blasenkontraktionen mit dem Ganglienblocker Hexamethonium. Dies ermöglicht die Messung der ATP-Freisetzung als Reaktion auf die höheren intravesikanischen Drücke (d. h. 30 cm H₂O), die häufig in der Blasenpathologie mit Auslassobstruktion beobachtet werden. Daher ermöglicht die Verwendung eines Urethan/Hexamethoniums die Messung der durch Spannung hervorgerufenen luminalen ATP-Freisetzung über lange Zeiträume (die Wirkungsdauer beider Arzneimittel wird in Stunden gemessen). Einige Labore ziehen es jedoch vor, ein Anästhetikum zu verwenden, das den Miktionsreflex nicht schont, wie z. B. Ketamin, und die Notwendigkeit eines Ganglienblockers eliminieren. Dies wird auch für dieses Verfahren gut funktionieren, obwohl es aufgrund der kürzeren Wirkungsdauer des Anästhetikums eine häufigere (oder kontinuierlichere) Verabreichung erfordert.

Ein bemerkenswerter Unterschied zwischen dieser Technik zur Messung von ATP und dem üblichen Zystometrie-Setup, mit dem Urologieforscher vertraut sein können, ist die Verwendung von gepufferter Krebslösung als Perfusat anstelle der isotonischen Standard-Kochsalzlösung. ATP ist ein eher labiles Molekül und wird in einer gepufferten Lösung etwas stabilisiert. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung der Krebslösung viel näher an der des Urins als an Kochsalzlösung, was diesen Experimenten die klinische Relevanz verleiht. Dies ist eine wichtige Überlegung, da gezeigt wurde, dass die Kontrolle der Urothel-ATP-Freisetzung durch kalziumdurchlässige Kanäle moduliert wird und der Mangel an Kalzium in normaler Kochsalzlösung die ATP-Freisetzung negativ beeinflussen kann. Die Instabilität von ATP in Lösung ist auch der Grund, warum wir vorschlagen, dass Proben sofort mit der Luciferin-Luciferase-Reaktion quantifiziert werden. Wenn der Forscher jedoch nicht in der Lage ist, die Proben sofort zu lesen, sollten die Proben so schnell wie möglich eingefroren werden, um den Abbau von ATP zu begrenzen.

Eine Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass sie nur die luminale ATP-Freisetzung misst und nicht die ATP-Freisetzung von der serosalen Seite des Urothels messen kann. Es wird angenommen, dass ATP von der serosalen Seite freigesetzt wird, um die afferente Erregbarkeit direkt zu beeinflussen. Eine direkte Messung dieser Freisetzung ist jedoch schwierig. In diesem Fall ist die Verwendung von Zellen, die auf durchlässigen Membranträgern wie Transwell-Platten gezüchtet wurden, oder die chirurgische Entfernung des Urothels für Ussing-Kammerexperimente die bevorzugte Technik. Angesichts der offensichtlichen Bedeutung von luminalem ATP in der Blasenpathologie ist dieses experimentelle Modell jedoch ein nützliches Werkzeug, um die zellulären Mechanismen aufzuklären, die die Urothel-ATP-Freisetzung während der Pathologie steuern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose