Avaliação da Transcitose Intestinal de Isolados de Bacteremia de Escherichia coli Neonatal

Resumo

Escherichia coli causa sepse em neonatos que ingerem a bactéria na época do nascimento. O processo envolvido na capacidade da E. coli de viajar do trato entérico para a corrente sanguínea é pouco compreendido. Este modelo in vitro avalia a capacidade das cepas de E. coli de viajar através das células epiteliais intestinais.

Resumo

Os recém-nascidos ingerem cepas maternas de E. coli que colonizam seu trato intestinal na época do parto. Cepas de E. coli com a capacidade de se deslocar através do intestino invadem a corrente sanguínea do recém-nascido, causando bacteremia com risco de vida. A metodologia aqui apresentada utiliza células epiteliais intestinais polarizadas cultivadas em pastilhas semipermeáveis para avaliar a transcitose de isolados de bacteremia neonatal de E. coli in vitro. Este método usa a linhagem celular intestinal T84 estabelecida que tem a capacidade de crescer até a confluência e formar junções apertadas e desmossomos. Após atingir a confluência, as monocamadas maduras de T84 desenvolvem resistência transepitelial (TEER), que pode ser quantificada usando um voltímetro. Os valores de TEER estão inversamente correlacionados com a permeabilidade paracelular de componentes extracelulares, incluindo bactérias, através da monocamada intestinal. A passagem transcelular de bactérias (transcitose), por outro lado, não altera necessariamente as medidas do TEER. Neste modelo, a passagem bacteriana através da monocamada intestinal é quantificada por até 6 h pós-infecção, e medições repetidas de TEER são feitas para monitorar a permeabilidade paracelular. Além disso, esse método facilita o uso de técnicas como a imunocoloração para estudar as mudanças estruturais em junções apertadas e outras proteínas de adesão célula a célula durante a transcitose bacteriana através do epitélio polarizado. O uso deste modelo contribui para a caracterização dos mecanismos pelos quais a E. coli neonatal transcita através do epitélio intestinal para produzir bacteremia.

Introdução

Escherichia coli é a causa mais comum de sepse de início precoce em recém-nascidos ^1,2,3. A taxa de mortalidade da bacteremia neonatal por E. coli pode chegar a 40%, sendo a meningite uma possível complicação associada a graves incapacidades de neurodesenvolvimento². A ingestão de cepas maternas de E. coli pelo recém-nascido pode produzir bacteremia neonatal; esse processo tem sido replicado em modelos animais ^2,4. Uma vez ingeridas, as bactérias patogênicas viajam do....

Protocolo

NOTA: Execute todas as manipulações das células, bactérias, placas e reagentes T84 em um gabinete de segurança de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2) para evitar a contaminação. Use áreas separadas e incubadoras para todo o trabalho envolvendo células T84 estéreis, células T84 infectadas e E. coli. Os isolados clínicos de E. coli testados com os métodos aqui descritos foram obtidos seguindo as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa de nossa instituição ^1,16.

1. Preparação de inserções de transcitose com células T84 (aproximadamente 1-2 semanas antes do experi....

Resultados

Figura 1: T84 TEER ao longo do tempo. À medida que a camada de células T84 amadurece na pastilha, a resistência elétrica da monocamada aumenta. Em um TEER de pelo menos 1.000 Ω·cm², a camada celular está suficientemente desenvolvida para diminuir o transporte bacteriano paracelular e permitir a medição do trânsito bacteriano principalment.......

Discussão

Esse método é derivado de técnicas utilizadas em gastroenterologia e doenças infecciosas²⁰. Modelos in vitro da barreira epitelial intestinal têm sido utilizados para elucidar os mecanismos pelos quais o conteúdo luminal interage com esse componente relevante da imunidade inata ^6,8. As interações hospedeiro-patógeno de E. coli neonatal invasiva também têm sido caracterizadas separadamente por meio de análises genéticas, e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10.000 U/mL de mistura de penicilina/estreptomicina	Fisher Scientific	15-140-122
Tubos cônicos estéreis de 15 mL	MidSci	C15B
Tubos de microcentrífuga de 2 mL Tubos
50 mL Falcon	352070
Aspirador	Corning	4930
Gabinetes de Biossegurança	Labconco	30441010028343	Três deles são usados no método: um para trabalho de tecido estéril, um para trabalho de tecido infectado e um para trabalho bacteriano.
Centrífuga	Sorvall	Legend RT
Loops de inoculação descartáveis	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Medidor de Volt/Ohm Epitelial	World Precision Instruments	EVOM2
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10437028
Mistura de nutrientes F-12 da Ham	Gibco	11765-047
Hemacitômetro	Sigma Aldrich, agitador	de
	New Brunswick	Innova 4080
Incubadoras	Thermo Scientific	51030284	Três deles são usados no método: um para cultura de tecido estéril, um para cultura de tecido infectado e um para incubação bacteriana.
Caldo de lisogenia	Difco	244610
Ágar caldo de lisogenia	IBI Scientific	IB49101
Microscópio Nikon Eclipse TS2R	Nikon
	Unico	1100RS
T84 Células Intestinais	Coleção Americana de Cultura de Tecidos	CCL248
Insertos de cultura de tecidos, com membrana de treftalato de polietileno, 3 µ m poros,  Placa	Falcon	353096
poços, 24 poços	Falcon	353504
Trypan blue stain	Fisher Scientific	T10282

cônicos de polipropileno estéril Avant AVSS2000 incubadora Bright Line Z359629 Espectrofotômetro de cultura de tecidos formato de 24