Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

Resumo

ATAC-seq é um método de sequenciamento de DNA que usa a transposase mutante hiperativa, Tn5, para mapear mudanças na acessibilidade da cromatina mediadas por fatores de transcrição. O ATAC-seq permite a descoberta dos mecanismos moleculares subjacentes às alterações fenotípicas nas células cancerígenas. Este protocolo descreve procedimentos de otimização para ATAC-seq em tipos de células epiteliais, incluindo células cancerígenas.

Resumo

O ensaio para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) sonda a acessibilidade do ácido desoxirribonucleico (DNA) usando a transposase hiperativa Tn5. Tn5 corta e ligadura adaptadores para sequenciamento de alto rendimento dentro de regiões de cromatina acessíveis. Nas células eucarióticas, o DNA genômico é embalado em cromatina, um complexo de DNA, histonas e outras proteínas, que atua como uma barreira física à maquinaria transcricional. Em resposta a sinais extrínsecos, os fatores de transcrição recrutam complexos de remodelação da cromatina para permitir o acesso à maquinaria transcricional para a ativação do gene. Portanto, a identificação de regiões abertas da cromatina é útil ao monitorar as atividades do potenciador e do promotor de genes durante eventos biológicos, como a progressão do câncer. Uma vez que este protocolo é fácil de usar e tem um baixo requisito de entrada celular, o ATAC-seq tem sido amplamente adotado para definir regiões abertas da cromatina em vários tipos de células, incluindo células cancerígenas. Para uma aquisição de dados bem-sucedida, vários parâmetros precisam ser considerados ao preparar bibliotecas ATAC-seq. Entre eles, a escolha do tampão de lise celular, a titulação da enzima Tn5 e o volume inicial de células são cruciais para a preparação da biblioteca ATAC-seq em células cancerígenas. A otimização é essencial para gerar dados de alta qualidade. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada dos métodos de otimização ATAC-seq para tipos de células epiteliais.

Introdução

A acessibilidade à cromatina é um requisito fundamental para a regulação da expressão gênica em larga escala^{genômica 1}. Alterações na acessibilidade à cromatina são frequentemente associadas a vários estados de doença, incluindo câncer ^2,3,4. Ao longo dos anos, inúmeras técnicas foram desenvolvidas para permitir que os pesquisadores sondem a paisagem da cromatina mapeando regiões de acessibilidade à cromatina. Alguns deles incluem DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)⁵, FAIRE-seq (isolamento assistido por formaldeí....

Protocolo

1. Preparações antes do início da experiência

1. Preparar o depósito regulador de lise.
   NOTA: O buffer de isolamento nuclear ideal pode ser diferente para cada tipo de célula. Recomendamos testar tanto o tampão hipotônico utilizado no artigo original⁸ quanto um tampão CSK^12,13 para cada tipo de célula usando a coloração azul de tripano.
   1. Para preparar o tampão hipotônico (tampão Greenleaf), misture 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ e 0,1% NP-40.
   2. Para preparar o tampão CSK, misture 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM ....

Resultados

Para obter dados ATAC-seq bem-sucedidos e de alta qualidade, é importante otimizar as condições experimentais. A preparação da biblioteca ATAC-seq pode ser separada em cinco etapas principais (Figura 1), a saber, lise celular, tagmentação (fragmentação e inserção do adaptador por Tn5), purificação do DNA genômico, amplificação por PCR e análise de dados. Como um processo inicial, o tampão de lise celular (isolamento nuclear) deve ser primeiro otimizado para cada tipo de célula. O tampão hipo.......

Discussão

ATAC-seq tem sido amplamente utilizado para mapear regiões de cromatina abertas e ativas. A progressão das células cancerígenas é frequentemente impulsionada por alterações genéticas e reprogramação epigenética, resultando em acessibilidade alterada da cromatina e expressão gênica. Um exemplo dessa reprogramação é visto durante a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e seu processo reverso, a transição mesenquimal-epitélica (MET), que são conhecidos por serem os principais processos de reprogramação celular durante a met.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	USA Scientific	1615-5500	Natural
10 µ L XL Pontas TipOne	USA Scientific	1120-3810	Filtradas e de baixa retenção
100 µ L XL TipOne RPT tips	USA Scientific	1182-1830	Filtrado e de baixa retenção
100 µ L XL Pontas TipOne	USA Scientific	1120-1840	Filtradas e de baixa retenção. Tubos
Centrífuga Cônicos	15 mL Corning
20 µ L TipOne Pontas RPT	USA Scientific	1183-1810	Filtradas e de baixa retenção
200 µ L TipOne RPT tips	USA Scientific	1180-8810	filtrados e de baixa retenção
de 50 mL	Fisherbrand	06-443-19
análise YBP136010 genética	ThermoFisher		Agarose
Todas as linhagens celulares utilizadas neste estudo são obtidas da centrífuga ATCC	ATCC
Allegra X-30R Beckman	Coulter	364658	SX2415
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	Kit de purificação de contas
CellDrop Cell Counter	DeNovix	CellDrop FL	Contador de células
EDTA	MilliporeSigma	EDS	BioUltra, anidro, ≥ 99% (titulação)
EGTA	MilliporeSigma	E3889
Etanol 100%	ThermoFisher Scientific	AC615100020	Anidro; Fisher Scientific - Decon Labs Produtos de Esterilização
Soro Fetal Bovino - Testado TET	R& D Systems	S10350	Triplo 0.1 µ m filtrado
Gibco DMEM 1x	ThermoFisher Scientific	11965092	[+] 4,5 g/L D-glicose; [+] L-Glutamina; [-] Piruvato de sódio
Gibco PBS 1x	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7,4
Gibco Tripsina-EDTA 1x	ThermoFisher Scientific	25200056	(0,25%), vermelho de fenol
Glicerol	IBI Scientific	56-81-5
Glicina	MilliporeSigma	G8898
HCl	MilliporeSigma	H1758
HEPES	MilliporeSigma	H3375
Invitrogen Qubit Fluorômetro	ThermoFisher Scientific	Q32857
MgCl2	MilliporeSigma	M3634
MinElute PCR kit de purificação	Qiagen	28004	kit de purificação de DNA
NaCl	IBI Scientific	7647-14-5
NaOH	MilliporeSigma	S8045	BioXtra, ≥ 98% (acidimétrico), pellets (anidro)
NEBPróximo PCR de Alta Fidelidade 2x Master Mix	New England Biolabs	M0541
Nextera Kit de Preparação de Amostras de DNA	Illumina	FC-121-1030	2x TD e Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)	MilliporeSigma	I8896	para biologia molecular
Sistema de Detecção de PCR	BioRad	1855484	Sistema em tempo real CFX384. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPES	MilliporeSigma	P1851	Certificado BioPerformance, adequado para cultura de células
Qubit dsDNA HS Kit de ensaio	ThermoFisher Scientific	Q32854	Invitrogen; Kit de quantificação de ácido nucleico
Quibit Tubos de	ThermoFisher Scientific	Q32856	Invitrogen
SDS	MilliporeSigma	L3771
Acetato de sódio	caseiro-pH	5.2
Sacarose	IBI Scientific	57-50-1
SYBR Gold	ThermoFisher Scientific	S11494
SYBR Verde Supermix, 1.25 mL	BioRad	1708882
T100 Termociclador	BioRad	1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips	USA Scientific	1402-4700	Flex-free, natural, polipropileno
TempPlate 384-WELL PCR PLATE	USA Scientific	1438-4700	Entalhe único.
Base Tris de	MilliporeSigma	648311	ULTROL Grade
Triton x-100	IBI Scientific	9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit	Illumina	PE-121-1003	emparelhado
Trypan Blue Stain	ThermoFisher Scientific	Q32851
Tween-20	MilliporeSigma	P7949	BioXtra, líquido viscoso
Água	MilliporeSigma	W3500	filtrada estéril, BioReagent, adequada para cultura de células

de de Grau Chanfrado 352096 Tubos de centrífuga Grau de científica ensaio polipropileno natural