Artigo de método

Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

DOI:

10.3791/64242

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30 de junho de 2022

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1University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, 2Dana-Farber Cancer Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq é um método de sequenciamento de DNA que usa a transposase mutante hiperativa, Tn5, para mapear mudanças na acessibilidade da cromatina mediadas por fatores de transcrição. O ATAC-seq permite a descoberta dos mecanismos moleculares subjacentes às alterações fenotípicas nas células cancerígenas. Este protocolo descreve procedimentos de otimização para ATAC-seq em tipos de células epiteliais, incluindo células cancerígenas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ensaio para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) sonda a acessibilidade do ácido desoxirribonucleico (DNA) usando a transposase hiperativa Tn5. Tn5 corta e ligadura adaptadores para sequenciamento de alto rendimento dentro de regiões de cromatina acessíveis. Nas células eucarióticas, o DNA genômico é embalado em cromatina, um complexo de DNA, histonas e outras proteínas, que atua como uma barreira física à maquinaria transcricional. Em resposta a sinais extrínsecos, os fatores de transcrição recrutam complexos de remodelação da cromatina para permitir o acesso à maquinaria transcricional para a ativação do gene. Portanto, a identificação de regiões abertas da cromatina é útil ao monitorar as atividades do potenciador e do promotor de genes durante eventos biológicos, como a progressão do câncer. Uma vez que este protocolo é fácil de usar e tem um baixo requisito de entrada celular, o ATAC-seq tem sido amplamente adotado para definir regiões abertas da cromatina em vários tipos de células, incluindo células cancerígenas. Para uma aquisição de dados bem-sucedida, vários parâmetros precisam ser considerados ao preparar bibliotecas ATAC-seq. Entre eles, a escolha do tampão de lise celular, a titulação da enzima Tn5 e o volume inicial de células são cruciais para a preparação da biblioteca ATAC-seq em células cancerígenas. A otimização é essencial para gerar dados de alta qualidade. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada dos métodos de otimização ATAC-seq para tipos de células epiteliais.

Introdução

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A acessibilidade à cromatina é um requisito fundamental para a regulação da expressão gênica em larga escalagenômica 1. Alterações na acessibilidade à cromatina são frequentemente associadas a vários estados de doença, incluindo câncer 2,3,4. Ao longo dos anos, inúmeras técnicas foram desenvolvidas para permitir que os pesquisadores sondem a paisagem da cromatina mapeando regiões de acessibilidade à cromatina. Alguns deles incluem DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (isolamento assistido por formaldeído de elementos reguladores)6, MAPit (protocolo de acessibilidade à metiltransferase para modelos individuais)7 e o foco deste artigo, ATAC-seq (ensaio para cromatina acessível à transposase)8. O DNase-seq mapeia regiões acessíveis empregando uma característica fundamental da DNase, a saber, a digestão preferencial de DNA nu livre de histonas e outras proteínas, como fatores de transcrição5. O FAIRE-seq, semelhante ao ChIP-seq, utiliza reticulação e sonicação de formaldeído, exceto que não há imunoprecipitação envolvida, e as regiões livres de nucleossomos são isoladas por extração de fenol-clorofórmio6. O método MAPit utiliza uma metiltransferase GC para sondar a estrutura da cromatina na resolução de molécula única7. ATAC-seq baseia-se na transposase hiperativa, Tn58. A transposase Tn5 liga-se preferencialmente a regiões de cromatina abertas e insere adaptadores de sequenciamento em regiões acessíveis. O Tn5 opera através de um mecanismo de "cortar e colar" mediado por DNA, pelo qual a transposase pré-carregada com adaptadores se liga a locais de cromatina abertos, corta o DNA e liga-se aos adaptadores8. As regiões ligadas a Tn5 são recuperadas por amplificação por PCR usando primers que recozidos para esses adaptadores. FAIRE-seq e DNase-seq requerem uma grande quantidade de material de partida (~100.000 células a 225.000 células) e uma etapa de preparação de biblioteca separada antes do sequenciamento9. Por outro lado, o protocolo ATAC-seq é relativamente simples e requer um pequeno número de células (<50.000 células)10. Ao contrário das técnicas FAIRE-seq e DNase-seq, a preparação da biblioteca de sequenciamento do ATAC-seq é relativamente fácil, pois a amostra de DNA isolada já está sendo marcada com os adaptadores de sequenciamento por Tn5. Portanto, apenas a etapa de amplificação por PCR com primers apropriados é necessária para concluir a preparação da biblioteca, e as etapas de processamento prévias, como reparo final e ligadura do adaptador, não precisam ser realizadas, economizando tempo11. Em segundo lugar, o ATAC-seq evita a necessidade de conversão, clonagem e amplificação de bissulfito com primers específicos da região necessários para o MAPit7. Devido a essas vantagens, o ATAC-seq tornou-se um método extremamente popular para definir regiões abertas de cromatina. Embora o método ATAC-seq seja simples, várias etapas exigem otimização para obter dados de alta qualidade e reprodutíveis. Este manuscrito discute procedimentos de otimização para a preparação padrão da biblioteca ATAC-seq, destacando especialmente três parâmetros: (1) composição do tampão de lise, (2) concentração de transposase Tn5 e (3) número de células. Além disso, este artigo fornece dados de exemplo das condições de otimização usando células epiteliais aderentes cancerosas e não cancerosas.

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Protocolo

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1. Preparações antes do início da experiência

  1. Preparar o depósito regulador de lise.
    NOTA: O buffer de isolamento nuclear ideal pode ser diferente para cada tipo de célula. Recomendamos testar tanto o tampão hipotônico utilizado no artigo original8 quanto um tampão CSK12,13 para cada tipo de célula usando a coloração azul de tripano.
    1. Para preparar o tampão hipotônico (tampão Greenleaf), misture 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 e 0,1% NP-40.
    2. Para preparar o tampão CSK, misture 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 3 mM MgCl2 e 0,1% Triton X-100.
  2. Garantir que as condições de cultura celular sejam ótimas; examinar as células sob um microscópio de luz para se certificar de que não há níveis elevados de apoptose.
  3. Ligue a centrífuga para que atinja 4 °C.

2. Colheita de células

  1. Aspirar meios de uma cultura de células com <80% de confluência. As células são tipicamente cultivadas em um prato de 35 mm ou 60 mm, com base no número de células necessárias, tratamentos, etc.
  2. Lave as células com 1 mL ou 3 mL de PBS.
  3. Adicione 0,5 mL ou 1 mL de tripsina e incube por 2-3 min (dependendo dos tipos de células). Use cuidadosamente uma pipeta de 1 mL para misturar bem.
  4. Adicione 1 mL ou 2 mL de meio ao prato e misture bem. Transferir para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células em um tubo de 15 mL por 3 min a 300 x g.
    NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células.
  5. Aspirar o meio e ressuspender as células em 1 mL ou 2 mL de meio.
    NOTA: É fundamental preparar uma solução homogênea de célula única. Para tecidos, um homogeneizador Dounce pode ser usado para homogeneizar tecidos e minimizar grandes aglomerados de células ou agregados. Alguns tecidos requerem filtração (por exemplo, filtros celulares) e/ou classificação celular FACS para isolar células viáveis e obter uma única solução celular.
  6. Conte as células usando um contador de células.
    NOTA: Neste estudo, foi utilizado um contador de células automatizado (Tabela de Materiais).
  7. Centrifugar o volume celular necessário (por exemplo, um volume contendo 1 x 106 células com base na contagem de células) a 300 x g durante 3 min à temperatura ambiente (RT).
  8. Ressuspeite o pellet celular contendo 1 x 106 células em 1 mL de PBS frio.
    NOTA: Se o número de células for inferior a 1 x 10 6 células, diminua o volume PBS frio para preparar a solução celular na mesma concentração (1 x 106 células/mL).

3. Lise celular

  1. Transfira 25 μL (= 2,5 x 104 células) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C e eliminar cuidadosamente o sobrenadante
    NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células. Deixe cerca de 3 μL de sobrenadante para garantir que as células não estão sendo descartadas.
  2. Adicione 25 μL de tampão de lise e ressuspenda as células por pipetagem suave para cima e para baixo. Incubar no gelo por 5 min
  3. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C e eliminar cuidadosamente o sobrenadante.
    NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células. Deixe cerca de 3 μL de sobrenadante para garantir que as células não estão sendo descartadas.

4. Marcação Tn5

  1. Ressuspender imediatamente o pellet em 25 μL de mistura de reacção Tn5. A mistura de reação Tn5 é a seguinte: 12,5 μL de 2x tampão de DNA de tagmentação (tampão TD), 1,25-5 μL de transposase Tn5 e 11,25-7,5 μL de água livre de nuclease.
    NOTA: A concentração padrão de Tn5 é de 2,5 μL para 2,5 x 104 células.
  2. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    NOTA: Misture a solução a cada 10 minutos.

5. Purificação do DNA

NOTA: A purificação é necessária antes da amplificação. A purificação do DNA é feita usando o kit de purificação MinElute PCR (Tabela de Materiais).

  1. Adicionar 5 μL de acetato de sódio 3 M (pH 5,2).
  2. Adicione imediatamente 125 μL de Buffer PB e misture bem.
  3. Siga o protocolo do kit de purificação por PCR a partir da etapa 2.
    1. Coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta de 2 mL.
    2. Aplicar a amostra na coluna de rotação e na centrífuga durante 1 min a 17.900 x g a RT.
    3. Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação de volta no mesmo tubo de coleta.
    4. Adicionar 750 μL de Buffer PE à coluna de rotação e centrifugar durante 1 min a 17.900 x g a RT.
    5. Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação de volta no mesmo tubo de coleta.
    6. Centrifugar a coluna de rotação por 5 minutos para secar completamente a membrana.
    7. Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação em um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
    8. Eluir os fragmentos de DNA com 10 μL de tampão EB.
    9. Deixe a coluna repousar por 1 min em RT.
    10. Centrífuga por 1 min a 17.900 x g em RT para eluír o DNA.

6. Amplificação por PCR

NOTA: A amplificação por PCR de DNAs transpostos (marcados) é necessária para o sequenciamento. Os adaptadores de kit Nextera (Tabela de Materiais) foram usados neste exemplo. Os primers utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1.

  1. Configure a seguinte reação de PCR em tubos de PCR de 200 μL (50 μL para cada amostra). A mistura de reação de PCR é a seguinte: 10 μL de DNA eluído (etapa 5.), 2,5 μL de 25 mM Adapter 1, 2,5 μL de 25 mM Adapter 2, 25 μL de 2x PCR master mix e 10 μL de água livre de nuclease
  2. Executar o programa de amplificação por PCR parte 1 (Tabela 2).
    NOTA: Para a amplificação inicial, as mesmas condições são usadas para todas as amostras que usam um termociclador padrão.
  3. QPCR em tempo real (total de 14,5 μL por amostra)
    1. Usando 5 μL do produto da parte 1 de amplificação de PCR (etapa 6.2.), configure a seguinte reação, desta vez incluindo ouro SYBR e detecção em uma máquina de PCR em tempo real.
    2. Preparar a mistura de reação de PCR da seguinte forma: 5 μL de produto de PCR da etapa 6.2., 0,75 μL de ouro SYBR (diluído 1000x), 5 μL de mistura mestre de PCR 2x e 3,75 μL de água livre de nuclease.
      NOTA: Os números de ciclo precisos para amplificação de biblioteca antes de atingir a saturação para cada amostra são determinados por qPCR (Tabela 3) para reduzir o viés de GC e tamanho na PCR10. O SYBR Gold foi diluído com água isenta de nuclease. Para a confecção da solução diluída, 1 μL de SYBR Gold (concentração estoque de 10.000x) foi adicionado a 999 μL de água isenta de nuclease. O tempo de execução do RT-qPCR mencionado na Tabela 3 é de cerca de 60 min.
  4. Determine o número necessário de ciclos de PCR adicionais usando os parâmetros de execução da etapa 6.3.
    1. Número de ciclos = 1/4 de intensidade máxima (saturada) de fluorescência (tipicamente 3 ou 4 ciclos de PCR)
  5. Programa de amplificação por PCR parte 2 (volume = 45 μL; Tabela 4): Depois de determinar o número do ciclo, configure os PCRs com ciclos adicionais calculados na etapa 6.4.1. Por exemplo, se o número de ciclo calculado for 3, configure 3 ciclos no programa abaixo. O total de ciclos seria 8 (5 na etapa 6.2., mais 3 ciclos adicionais na etapa 6.5.)

7. Purificação de contas

NOTA: Aqui, foram utilizadas contas AMPure XP (Table of Materials).

  1. Aos produtos de PCR amplificados na etapa anterior, adicione 150 μL de contas em RT.
    NOTA: As contas caseiras AMPure14 podem ser usadas neste processo.
  2. Incubar por 15 min no RT.
  3. Coloque os tubos em um suporte magnético por 5 min.
  4. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
  5. Lave as contas com 200 μL de etanol a 80%.
    NOTA: 80% de etanol deve ser preparado fresco.
  6. Repita a etapa 7.4.
  7. Remova o etanol completamente.
  8. Secar as amostras ao ar por 10 min no RT.
  9. Ressuspender com 50 μL de tampão de eluição (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
  10. Repita a purificação das esferas (etapas 7.1.-7.9.) para minimizar ainda mais a contaminação do primer.

8. Concentração de DNA e verificação de qualidade

  1. Meça a concentração de DNA usando um kit de quantificação de ácido nucleico (Tabela de Materiais).
  2. Verifique os fragmentos de DNA amplificados por eletroforese em gel usando SYBR Gold (0,5x TBE, gel de agarose a 1,5%) ou um sistema de eletroforese automatizado (por exemplo, TapeStation, bioanalisador).

9. Sequenciamento

  1. Realizar o sequenciamento de alto rendimento utilizando as amostras de DNA amplificado12,13.
    NOTA: As amostras de DNA amplificado estão prontas para sequenciamento de alto rendimento. Para reter informações de fragmentos de DNA nucleossomal, recomenda-se o sequenciamento de extremidade emparelhada sobre o sequenciamento de extremidade única. Ambas as extremidades dos fragmentos de DNA indicam onde a transposase se liga. Para mapear regiões abertas de cromatina, 30 milhões de leituras/amostra são normalmente suficientes.

10. Análise dos dados

  1. Filtragem de dados com base na qualidade da chamada base: Defina a pontuação média mínima de qualidade da base para 20 (99% de precisão).
  2. Aparamento do adaptador: remova as sequências do adaptador usando uma ferramenta apropriada.
    Observação : A ferramenta wrapper Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) foi usada para remover sequências de adaptador. Para bibliotecas ATAC-seq preparadas pelo Illumina Tn5, a seguinte sequência é usada como uma sequência adaptadora: CTGTCTCTTATACACATCT. O comprimento mínimo da sequência para reconhecer a contaminação do adaptador é definido como 5.
  3. Mapeamento do genoma: Mapeie as leituras para o genoma apropriado com Bowtie usando os seguintes parâmetros "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Um exemplo de mapeamento da qualidade das células basais de câncer de mama MDA-MB-231 está abaixo:
    Leituras com pelo menos um alinhamento relatado: 52,79%
    Leituras que não conseguiram alinhar: 13,10%
    Leituras com alinhamentos suprimidos devido a -m: 34,11%
  4. Eliminação de duplicação: Marque as duplicatas de PCR pelas ferramentas Picard16.
  5. Gerando um arquivo de cobertura de genoma para visualização de dados: converta as leituras de extremidade emparelhadas desduplicadas em fragmentos de leitura de extremidade única. Os rastros de cobertura do genoma são obtidos utilizando-se o genomeCoverageBed from bedtools17.

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Resultados

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Para obter dados ATAC-seq bem-sucedidos e de alta qualidade, é importante otimizar as condições experimentais. A preparação da biblioteca ATAC-seq pode ser separada em cinco etapas principais (Figura 1), a saber, lise celular, tagmentação (fragmentação e inserção do adaptador por Tn5), purificação do DNA genômico, amplificação por PCR e análise de dados. Como um processo inicial, o tampão de lise celular (isolamento nuclear) deve ser primeiro otimizado para cada tipo de célula. O tampão hipo...

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Discussão

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ATAC-seq tem sido amplamente utilizado para mapear regiões de cromatina abertas e ativas. A progressão das células cancerígenas é frequentemente impulsionada por alterações genéticas e reprogramação epigenética, resultando em acessibilidade alterada da cromatina e expressão gênica. Um exemplo dessa reprogramação é visto durante a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e seu processo reverso, a transição mesenquimal-epitélica (MET), que são conhecidos por serem os principais processos de reprogramação celular durante a met...

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Divulgações

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Os autores declaram que não há interesses financeiros relevantes ou materiais que se relacionem com a pesquisa descrita neste artigo.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos à instalação da UND Genomics Core pela excelente assistência técnica.

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [P20GM104360 a M.T., P20 GM104360 a A.D.] e fundos iniciais fornecidos pela Escola de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade de Dakota do Norte, Departamento de Ciências Biomédicas [a M.T.].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLUSA Scientific1615-5500Natural
10 µ L XL Pontas TipOneUSA Scientific1120-3810Filtradas e de baixa retenção
100 µ L XL TipOne RPT tipsUSA Scientific1182-1830Filtrado e de baixa retenção
100 µ L XL Pontas TipOneUSA Scientific1120-1840Filtradas e de baixa retenção. Tubos
Centrífuga Cônicos15 mL Corning
20 µ L TipOne Pontas RPTUSA Scientific1183-1810Filtradas e de baixa retenção
200 µ L TipOne RPT tipsUSA Scientific1180-8810filtrados e de baixa retenção
de 50 mLFisherbrand06-443-19
análise YBP136010 genéticaThermoFisherAgarose
Todas as linhagens celulares utilizadas neste estudo são obtidas da centrífuga ATCCATCC
Allegra X-30R BeckmanCoulter364658SX2415
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881Kit de purificação de contas
CellDrop Cell CounterDeNovixCellDrop FLContador de células
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, anidro, ≥ 99% (titulação)
EGTAMilliporeSigmaE3889
Etanol 100%ThermoFisher ScientificAC615100020Anidro; Fisher Scientific - Decon Labs Produtos de Esterilização
Soro Fetal Bovino - Testado TETR& D SystemsS10350Triplo 0.1 µ m filtrado
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4,5 g/L D-glicose; [+] L-Glutamina; [-] Piruvato de sódio
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7,4
Gibco Tripsina-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0,25%), vermelho de fenol
GlicerolIBI Scientific56-81-5
GlicinaMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorômetroThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR kit de purificaçãoQiagen28004kit de purificação de DNA
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, ≥ 98% (acidimétrico), pellets (anidro)
NEBPróximo PCR de Alta Fidelidade 2x Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera Kit de Preparação de Amostras de DNAIlluminaFC-121-10302x TD e Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896para biologia molecular
Sistema de Detecção de PCRBioRad1855484Sistema em tempo real CFX384. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPESMilliporeSigmaP1851Certificado BioPerformance, adequado para cultura de células
Qubit dsDNA HS Kit de ensaioThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen; Kit de quantificação de ácido nucleico
Quibit Tubos deThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
Acetato de sódiocaseiro-pH5.2
SacaroseIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Verde Supermix, 1.25 mLBioRad1708882
T100 TermocicladorBioRad1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-4700Flex-free, natural, polipropileno
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700Entalhe único.
Base Tris deMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer KitIlluminaPE-121-1003emparelhado
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, líquido viscoso
ÁguaMilliporeSigmaW3500filtrada estéril, BioReagent, adequada para cultura de células
de de Grau Chanfrado 352096 Tubos de centrífuga Grau de científica ensaio polipropileno natural

Referências

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