Investigando o relaxamento do estresse e respostas de falha na Traqueia

Apesar de seu papel crítico na doença pulmonar, a maior estrutura das vias aéreas, a traqueia, tem estudos limitados detalhando suas propriedades viscoelásticas¹. Uma compreensão aprofundada do comportamento viscoelástico dependente do tempo da traqueia é fundamental para a pesquisa mecânica pulmonar, uma vez que a compreensão das propriedades materiais específicas das vias aéreas pode ajudar a avançar na ciência da prevenção de lesões, diagnóstico e intervenção clínica para doenças pulmonares, que são a terceira principal causa de morte nos Estados Unidos ^2,3,4.

Estudos de caracterização tecidual disponíveis relataram as propriedades de rigidez da traqueia 5,6,7,8. As respostas mecânicas dependentes do tempo têm sido minimamente investigadas apesar de sua importância na remodelação tecidual, que também é alterada pela patologia ^9,10. Além disso, a falta de dados de resposta dependentes do tempo também limita as capacidades preditivas dos modelos computacionais da mecânica pulmonar que atualmente recorrem ao uso das leis genéricas constitutivas. É preciso resolver essa lacuna realizando estudos de relaxamento do estresse que podem fornecer as características materiais necessárias para informar estudos biofísicos da traqueia. O presente estudo oferece detalhes sobre métodos de teste, aquisição de dados e análises de dados para investigar o comportamento de relaxamento do estresse da traqueia suína.

Todos os métodos descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Drexel. Todos os animais cadavéricos foram adquiridos de uma fazenda aprovada pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) localizada na Pensilvânia, EUA. Um cadáver de um porco yorkshire macho (3 semanas de idade) foi usado para o presente estudo.

1. Colheita de tecidos

1. Adquira um cadáver de um porco de uma fazenda aprovada e realize os experimentos dentro de 2 h de eutanásia. Mantenha o cadáver no gelo até que a colheita de tecido seja concluída para garantir que as propriedades biomecânicas de tecido fresco sejam conservadas.
   NOTA: Na literatura publicada, o teste de tecido fresco em animais é comumente realizado dentro de 2 h pós-eutanásia. Para mais detalhes, consulte as referências 11,12,13,14,15,16,17,18,19.
2. Coloque o cadáver na posição supina, faça uma incisão vertical da linha média ao longo do pescoço e exponha a cartilagem da tireoide, cartilagem cricoide e traquea do osso hioide até o entalhe suprasternal.
3. Colher a laringe e a traqueia de comprimento completo usando uma lâmina #10 (Figura 1A).
4. Separe a amostra de traqueia da laringe e corte o tubo traqueal longitudinalmente ao longo de todo o comprimento de um lado usando a lâmina #10 (Figura 1B).
5. Meça a espessura da traqueia utilizando a imagem transversal adquirida (obtida utilizando ImageJ²⁰, ver Tabela de Materiais) (Figura 1C). Use a espessura do tecido medido para calcular a área transversal durante a análise dos dados.
6. Corte a traqueia em duas tiras circunferenciais de aproximadamente 5 mm de largura (proximally) e duas tiras longitudinais de aproximadamente 5 mm de largura (distally), com o comprimento mínimo dessas tiras sendo de 25 mm (Figura 1D).
7. Obtenha imagens das quatro amostras (ou seja, tiras de traqueia cortadas) ao lado de uma régua. Use essas imagens para fornecer medições digitalizadas da largura da amostra usando a Imagem J (Figura 1E). Em seguida, use essa largura medida para calcular a área transversal da amostra durante a análise dos dados.
8. Certifique-se de que todas as amostras de tecido sejam mantidas hidratadas usando solução salina tamponada de fosfato estéril (PBS) durante todo o estudo. Mantenha as amostras hidratadas em gaze encharcada de PBS até estar pronta para o teste. Mergulhe o tecido em PBS pouco antes de testar para hidratação adequada.

2. Teste biomecânico

1. Conecte cada amostra a um grampo personalizado (veja os relatórios anteriores 11,12,13,14,15,16,17,18,19) para que a amostra seja mantida longitudinalmente entre os grampos (Figura 1F).
2. Fixar cuidadosamente os grampos (sem induzir qualquer estiramento) a uma máquina de teste de material (ver Tabela de Materiais), que tem uma célula de carga de 50 N presa ao atuador superior (Figura 1G).
3. Meça a distância de aderência (ou seja, grampo) usando uma régua. Use esta distância como o comprimento inicial do tecido para cálculos de tensão.
4. Realize o pré-condicionamento carregando cada amostra cinco vezes a uma taxa de tensão de 1%/s até 1% de tensão.
5. Segure cada amostra no máximo alongamento de 0% ou 10% para 300 s para investigar a resposta viscoelástica de relaxamento do estresse do tecido.
6. Após o teste de relaxamento do estresse, estique o tecido imediatamente a 1%/s até que ocorra uma falha mecânica.
7. Documente o local de falha e confirme que não ocorreu nenhum deslize, garantindo a presença de amostras dentro do teste pós-grampo (Figura 1H).

3. Aquisição de dados

1. Não adquira nenhum dado durante o pré-condicionamento.
2. Grave os vídeos de teste de relaxamento e falha de estresse usando qualquer câmera digital a um mínimo de 30 quadros/s.
3. Adquira dados de tempo (s), carga (N) e deslocamento (mm) utilizando um software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais) a uma taxa de amostragem de 250 amostras/s durante testes de relaxamento e falha de estresse.
4. Salve os dados adquiridos como um arquivo .csv e use-os para análise de dados conforme detalhado na etapa 4.
5. Adquira imagens estáentas do tecido fixado antes do estresse-relaxamento, após o estresse-relaxamento, e após a falha (Figura 2).

4. Análise de dados

1. Entrada de dados
   1. Baixe e instale o software de análise de dados MATLAB (ver Tabela de Materiais), incluindo as caixas de ferramentas "Otimização" e "Processamento de Imagens".
   2. Baixe a pasta zipped (Arquivo de Codificação Suplementar 1), que inclui os códigos MATLAB e um conjunto de dados de amostra que será usado para explicar as etapas de análise de dados.
   3. Navegue até a pasta com zíper baixado e extraia seu conteúdo.
   4. Abra o MATLAB e defina a pasta descompactada como o diretório de trabalho. Certifique-se de que o diretório de trabalho tenha as seguintes pastas e arquivos rotulados conforme mencionado na nota abaixo. Certifique-se de que não há pastas ou arquivos adicionais presentes neste diretório de trabalho, uma vez que eles podem interferir com o código e resultar em um erro.
      NOTA: (1) Falha (Pós-Relaxamento), (2) Somente falha, (3) Relaxamento, (4) calc_relax_failure,m, (5) main_relax_failure,m, (6) testesDetes.xlsx.
   5. Navegue até a pasta Falha apenas .
      NOTA: Os dados contidos nesta pasta são derivados do grupo controle neste estudo, ou seja, dados biomecânicos de amostras traqueais que foram submetidas a falha mecânica após um alongamento de 0%.
   6. Armazene dados de amostras testadas em uma data específica em um arquivo do Microsoft Excel usando a seguinte convenção de nomeação de arquivos: mmddyy. Por exemplo, dados de todas as amostras traqueais do grupo controle testadas em 30 de abril de 2022 devem ser armazenados em Falha Apenas | 043022.xlsx.
      NOTA: Por favor, note que, no presente estudo, todos os testes biomecânicos foram realizados em um único dia; no entanto, se os dados foram derivados de várias datas de teste, então crie um novo arquivo Microsoft Excel, nomeado na convenção descrita, para cada uma dessas datas de teste.
   7. Falha aberta apenas | 043022.xlsx e reconhecer que existem várias guias de planilha, cada uma contendo os dados brutos de cada amostra submetida a falha mecânica nesta data específica, ou seja, 30 de abril de 2022.
   8. Certifique-se de que as amostras sejam rotuladas usando a seguinte convenção: [tipo de amostra]_[número de amostra]_[insira o nível de tensão pré-estiramento]%.
      NOTA: Por exemplo, no presente estudo, as amostras traqueais do grupo controle foram submetidas a testes de falha mecânica sob carregamento axial ou circunferencial sem qualquer relaxamento prévio do estresse. Portanto, essas amostras são nomeadas no seguinte formato: TA_1_0% e TC_1_0%, respectivamente. O 0% não denota nenhum pré-alongamento. Amostras traqueais do nosso grupo experimental foram realizadas pela primeira vez em alongamento fixo sob carga axial ou circunferencial de 10% para avaliar a resposta de relaxamento do estresse viscoelástico e, em seguida, submetidas a falha mecânica. Portanto, essas amostras são nomeadas no seguinte formato: TA_1_10% e TC_1_10% (consulte a etapa 4.1.16 e a etapa 4.1.23, representando as condições de carregamento axial e circunferencial, respectivamente).
   9. Selecione a guia planilha TA_1_0%." Certifique-se de que as colunas de cabeçalho de dados brutos sejam rotuladas exatamente como digitadas em negrito na nota abaixo.
      NOTA: (1) Tempo (seg), (2) Carga (N), (3) Posição (mm), (4) Diâmetros (mm) (etapa 1,7), (5) Área transversal média (Espessura x Largura, mm²) (obtida na etapa 1.5 e etapa 1.7), (6) Comprimento Inicial (mm) (passo 2.3).
   10. Feche o arquivo atual do Microsoft Excel, falha apenas | 043022.xlsx.
   11. Retornar ao diretório de trabalho do software de análise de dados.
   12. Navegue até a pasta Relaxamento.
       NOTA: Os dados contidos nesta pasta são derivados do grupo experimental neste estudo, ou seja, dados biomecânicos de amostras traqueais que foram submetidas a testes de relaxamento por estresse a um alongamento fixo de 10% para 300 s.
   13. Armazene dados das amostras de grupo experimentais testadas em uma data específica em um arquivo Do Microsoft Excel usando a seguinte convenção de rotulagem: mmddyy.
       NOTA: Por exemplo, os dados de todas as amostras de traqueias de grupo experimental testadas em 30 de abril de 2022 devem ser armazenados em relaxamento | 043022.xlsx. Consulte a nota na etapa 4.1.6 para obter mais detalhes.
   14. | de relaxamento aberto 043022.xlsx e reconhecer que existem múltiplas guias de planilha, cada uma contendo os dados de relaxamento da carga bruta de cada amostra no grupo experimental que foi testado nesta data específica, ou seja, 30 de abril de 2022.
   15. Faça uma pausa e note que cada uma das amostras, conforme indicado pelas guias da planilha incluídas neste arquivo Microsoft Excel, foi posteriormente submetida a falha mecânica sob carga mecânica de tração.
       NOTA: Os dados de falha correspondentes para cada uma das amostras presentes devem ser armazenados na pasta Falha (Pós-Relaxamento), descritas ainda na etapa 4.1.20.
   16. Certifique-se de que as amostras sejam rotuladas usando a convenção descrita na etapa 4.1.8.
   17. Alterne cada guia de planilha encontrada no arquivo Microsoft Excel atual e consulte a etapa 4.1.9 para garantir que os dados de relaxamento de carga bruta para cada amostra, indicados por qualquer guia de planilha, sejam formatados corretamente.
   18. Salve e feche o arquivo atual do Microsoft Excel, o Relaxamento | 043022.xlsx.
   19. Retornar ao diretório de trabalho do software de análise de dados.
   20. Navegue até a falha da pasta (Pós-Relaxamento).
   21. Certifique-se de que há um (s) de arquivos Do Microsoft Excel com a mesma data (consulte a etapa 4.1.6 para obter detalhes sobre a nomeação dos arquivos do Microsoft Excel correspondentes a cada data de teste) como o presente na pasta Relaxamento.
       NOTA: Os dados contidos na pasta atual, Failure (Post-Relaxation), são os dados de falha mecânica bruta correspondentes de amostras traqueais submetidas a testes de relaxamento de estresse a um alongamento fixo de 10% para 300 s.
   22. Falha aberta (pós-relaxamento) | 043022.xlsx e reconhecer múltiplas guias de planilha, cada uma das quais contém dados de falha mecânica bruta das mesmas amostras presentes no Relaxamento | 043022.xlsx.
   23. Certifique-se de que as amostras sejam rotuladas usando a convenção mencionada na etapa 4.1.8 e que os rótulos correspondam aos de Relaxamento | 043022.xlsx.
       NOTA: Por exemplo, os dados no atual arquivo Microsoft Excel para TA_1_10% representam dados de falha mecânica bruta para a amostra traqueal #1 sob carregamento axial que anteriormente passou por testes de relaxamento de estresse em 10% de alongamento fixo para 300 s.
   24. Alterne cada guia de planilha e consulte a etapa 4.1.9 para garantir que a coluna de cabeçalho para os dados de falha mecânica bruta de cada amostra seja formatada corretamente.
   25. Feche o arquivo atual do Microsoft Excel, Falha (Pós Relaxamento) | 043022.xlsx.
   26. Retornar ao diretório de trabalho do software de análise de dados.
   27. Repetir as etapas 4.1.5-4.1.26 para datas adicionais de teste, conforme aplicável.
   28. Abra o arquivo Do Microsoft Excel, testandoDates.xlsx, que direcionará o código para analisar datas de teste especificadas pelo usuário.
   29. Liste as datas de teste na primeira coluna no seguinte formato: mm/dd/yy.
   30. Na segunda coluna, indique usando um Y (para sim) ou N (para não) se quaisquer amostras nesta data de teste em particular eram do grupo experimental (relaxamento do estresse seguido de falha mecânica).
   31. Na terceira coluna, indique usando um Y (para sim) ou N (para não) se quaisquer amostras nesta data de teste em particular eram do grupo controle (falha mecânica direta).
   32. Repetir as etapas 4.1.29-4.1.31 para datas adicionais de teste.
   33. Salve e feche o arquivo atual do Microsoft Excel, testando Datas.xlsx.
   34. Retornar ao diretório de trabalho do software de análise de dados.
   35. Abra o arquivo principal do script , main_relax_failure.m.
   36. Selecione o grande arqueiro verde na interface de software para executar o código. Alternativamente, digite main_calc_relax de execução na janela de comando.
   37. Ao ser solicitado, insira níveis de alongamento fixos separados por círios (em %) para os vários grupos experimentais e pressione OK.
       NOTA: No presente estudo, apenas um alongamento de relaxamento do estresse foi utilizado, ou seja, entrar 10. Não inclua 0% para o grupo controle. No entanto, se os dados foram derivados de múltiplos alongamentos, por exemplo, 10% e 20%, então entrem em 10,20.
   38. Ao ser solicitado, insira durações de testes de relaxamento de estresse separados por círio (em segundos) para os vários grupos experimentais e pressione OK.
       NOTA: No presente estudo, foram realizadas amostras traqueais em alongamento fixo para 300 s e, consequentemente, insumo 300. No entanto, se os dados foram derivados de múltiplas durações de relaxamento do estresse, por exemplo 90 e 300 s, então entre em 90.300.
2. Resposta de relaxamento do estresse viscoelástico
   1. Usando o código (main_relax_failure.m), converter dados de tempo de carga (Linha 144) em dados nominais de tempo de estresse usando a seguinte equação¹⁹: , onde σ representa estresse (mega Pascals [MPa]), F representa carga circunferencial ou axial (Newtons [N]), e A₀ representa a área transversal inicial (milímetros quadrados [mm²]).
   2. Utilizando o código (main_relax_failure.m), determine as magnitudes de carga máxima e estresse (Linhas de Código 138 e 146) em resposta à aplicação do alongamento fixo de 10% na amostra no início do teste de relaxamento dos anos 300.
      NOTA: Estes valores são de sempre denominados carga inicial de pico e estresse inicial de pico, respectivamente.
   3. Utilizando o código (main_relax_failure.m), calcule a redução percentual de estresse (ou carga) em 300 s (Linhas de Código 141 e 149) utilizando a seguinte equação: , onde Rel% representa a porcentagem de relaxamento, σ(0⁺) representa o estresse inicial (ou carga inicial de pico), e σ(300) representa o nível de estresse registrado (ou carga) após o relaxamento acima de 300 s.
   4. Consulte o código (main_relax_failure.m) para modelar a resposta de relaxamento do estresse viscoelástico (Linhas de Código 152-161) usando um modelo de decadência exponencial da série Prony de dois termos. Este modelo é comumente usado para descrever o comportamento viscoelástico de vários tecidos biológicos, incluindo vários níveis de vias aéreas cartilaginosas (traqueia, brônquios grandes e pequenos brônquios)^21,22.
      NOTA: Os valores de estresse calculados [σ(t)] são normalizados para produzir a seguinte função de relaxamento reduzida: e G(0) = 1. Para comparar as respostas viscoelásticas de relaxamento do estresse, G(t) é ajustado por curvas usando regressão não linear de menos quadrados da seguinte forma: , onde t é o tempo durante o relaxamento do estresse, g é o coeficiente de relaxamento, τ₁ e τ₂ e indicar os tempos de relaxamento (em segundos) que descrevem o comportamento curto (inicial) e de longo prazo (equilíbrio) do tecido, respectivamente.
3. Resposta de falha mecânica
   1. Use o código (main_relax_failure.m) para converter os dados de deslocamento de carga (Linhas de Código 143-144) registrados pela máquina de teste de tração em dados nominais de tensão de estresse usando as equações mencionadas na nota abaixo.
      NOTA: , quando σ representa estresse nominal (MPa), F representa carga circunferencial ou axial (N), e A₀ representa a área transversal inicial (mm²); , onde representa a cepa resultante, ΔL representa deslocamento, e L₀ representa o comprimento inicial da amostra. Para amostras submetidas a testes de tração de falha após o relaxamento do estresse, L₀ representa o comprimento pré-esticado do tecido. Por exemplo, a amostra 3 (comprimento inicial de 8 mm) foi pré-esticada para 10%, e, portanto, L₀ foi considerada 8,8 mm para computação dos valores de tensão^{resultantes 19}.
   2. Utilize a função (calc_relax_failure.m) para identificar a carga máxima (ou seja, carga de falha) e o deslocamento correspondente de falha, bem como o estresse máximo (ou seja, estresse de falha) e tensão de falha correspondente (Linhas de Código 33 e 61-63).
   3. Use a função (calc_relax_failure.m) para descartar os dados de deslocamento de carga após a carga de falha (Linha 34).
   4. Use a função (calc_relax_failure.m) para traçar a curva de deslocamento de carga e, quando solicitado, selecione manualmente dois pontos na região linear da curva para aproximar a rigidez do tecido (N/mm) (Linhas de Código 37-58).
      NOTA: Uma vez que a curva de deslocamento de carga é normalizada pela área transversal e pelo comprimento inicial da amostra para produzir a curva de tensão-tensão, o código utiliza as coordenadas x e y selecionadas pelo usuário da curva de deslocamento de carga para calcular o módulo de elasticidade (MPa) usando a seguinte equação¹⁹: , onde E representa o módulo de elasticidade, x e y representam as coordenadas selecionadas na curva de deslocamento de carga, Um₀ representa a área transversal, L₀ representa o comprimento da amostra no início da falha mecânica, e Δσ e Δ representam a mudança de estresse e tensão sobre a região linear da resposta à falha, respectivamente.
   5. Repita o passo 4.3.4 para cada amostra.
4. Saída de dados
   1. Uma vez que o código seja executado com sucesso, certifique-se de que os resultados computados estejam disponíveis no diretório de trabalho do software de análise de dados como um arquivo Microsoft Excel na seguinte convenção de nomeação: relax_failure_results_mmddyy.xlsx, onde o mmddyy será substituído pela data em que o código foi executado.

A Figura 1 mostra o tecido falhado perto do local de fixação e a presença de tecido dentro do grampo, confirmando nenhum deslizamento durante o teste de tração. A Figura 2 indica vários locais de falha, incluindo os locais de fixação superior ou inferior ou ao longo do comprimento do tecido, que foram observados durante o teste de tração entre as amostras testadas. Os resultados da análise dos dados são resumidos nos Números 3-4 e Tabelas 1-2. Respostas de relaxamento do estresse para amostras traqueais após axial ou circunferencial pré-alongamento a 10% da cepa são mostradas na Figura 3. A carga inicial de pico e o estresse, a redução percentual do estresse ao longo dos 300 s hold, e as constantes de tempo, t1 e t2, em uma função de relaxamento da série Prony de 2 termes foram calculadas a partir dessas curvas de relaxamento. Estes parâmetros viscoelásticos estão incluídos na Tabela 1. As respostas de tensão de estresse da amostra traqueal submetidas a testes de falha sob cargas axiais ou circunferenciais após nenhum pré-alongamento ou pré-alongamento de 10% são mostradas na Figura 4. A partir dessas curvas, o estresse de falha e a tensão de falha correspondente, bem como o módulo de elasticidade, foram determinados e estão listados na Tabela 2.

Os testes preliminares caracterizaram com sucesso as respostas de relaxamento do estresse do tecido traqueal. Nestes experimentos iniciais, a resposta de relaxamento de estresse pré-alongamento de 10% relatou que o estresse inicial de pico foi maior nas direções de carregamento axial, enquanto a redução percentual do estresse foi maior na direção de carga circunferencial quando comparada à direção de carregamento axial (Tabela 1). Os tempos de relaxamento (τ1 eτ 2 que descrevem o comportamento de curto e longo prazo [equilíbrio] do tecido) também foram mais elevados na direção de carga axial quando comparados com a direção de carregamento circunferencial para o mesmo grupo pré-alongamento de 10%. Ao comparar os dados de falha, o estresse de falha e os valores E foram mais elevados nas direções de carregamento circunferencial nos grupos pré-alongamento de 0% e 10%, enquanto a cepa de falha relatada nas direções de carregamento axial foi maior (Tabela 2). Esses achados preliminares justificam experimentos adicionais para caracterizar ainda mais as respostas de relaxamento e falha no tecido traqueial para entender melhor suas respostas de relaxamento do estresse em condições de carregamento de tração, tanto axialicamente quanto circunferencialmente. As etapas descritas neste protocolo podem ajudar a alcançar esse objetivo.

Figura 1: Cálculo de tecidos e detalhes de testes mecânicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Locais de falha. Locais de falha da amostra, conforme indicado por setas amarelas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resposta de relaxamento do estresse sobre um porão de 300 s de amostras de traqueia pré-esticadas a 10% de tensão. (A) Axial ou (B) carregamento circunferencial (n = 1 por condição de carregamento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Respostas de tensão de estresse para testes de falha de amostras de traqueia sob carregamento axial ou circunferencial após nenhum pré-alongamento ou 10% de pré-alongamento (n = 1 por condição de carregamento). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Valores medidos e calculados do parâmetro de relaxamento do estresse para amostras de traqueia submetidos a um pré-estiramento de 10% de tensão para sofrer relaxamento por estresse para 300 s.

Tabela 2: Respostas de falha de amostras de traqueia em vários grupos experimentais.

Arquivo de codificação suplementar 1: Os códigos personalizados para estudar o comportamento de relaxamento do estresse da traqueia. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Os autores não têm nada a revelar.