Artigo de método

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

DOI:

10.3791/64248

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28 de setembro de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Resumo

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A medula óssea (MC) é o tecido mole encontrado dentro dos ossos onde ocorre principalmente a hematopoiese, processo pelo qual novas células sanguíneas são geradas. Como tal, contém células-tronco hematopoéticas e progenitoras (HSPCs), bem como células estromais de suporte que contribuem para a manutenção e regulação de HSPCs. Hematológicas e outras desordens da MB interrompem a hematopoiese afetando as células hematopoiéticas diretamente e/ou através da alteração do nicho da MB. Aqui, descrevemos um método para estudar hematopoese na saúde e malignidade através da análise fenotípica de BM murinos HSPCs e populações de nicho estromal por citometria de fluxo. Nosso método detalha os passos necessários para enriquecer as células BM nas frações endosteal e central de BM, bem como as estratégias apropriadas de gating para identificar os dois principais tipos celulares de nicho envolvidos na regulação da HSPC, as células endoteliais e as células-tronco mesenquimais. A análise fenotípica aqui proposta pode ser combinada com mutantes de camundongos, modelos de doenças e ensaios funcionais para caracterizar o compartimento HSPC e seu nicho.

Introdução

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A citometria de fluxo é um método inestimável para caracterizar e isolar prospectivamente células imunes e hematopoéticas. Também está sendo cada vez mais utilizado para analisar populações estromais e epiteliais de diferentes tecidos. As células-tronco hematopoéticas (CTH) possuem propriedades únicas de auto-renovação e multipotência. Em mamíferos adultos, as CTHs residem principalmente na medula óssea (MO), onde recebem sinais de quiescência e sobrevivência do microambiente ou nicho1 circundante. As HSCs são formalmente definidas de acordo com ensaios funcionais2. No entanto, vários trabalhos marcantes têm mostrado a utilidade da citometria de fluxo na identificação de CTH. Através do uso de marcadores limitados de superfície celular, é possível discriminar populações hematopoéticas altamente enriquecidas emCTH3. A citometria de fluxo é, portanto, um método central no campo das células-tronco. Tem sido extensivamente utilizado para avaliar o impacto de supostos tipos celulares de nicho e fatores de nicho sobre as CTH. Combinando citometria de fluxo com ensaios de imagem e funcionais, demonstrou-se que as HSCs são criticamente suportadas por células-tronco mesenquimais perivasculares (CTMs) e células endoteliais (CE). As CTMs de MO são um grupo heterogêneo e têm diferentes contribuições de citocinas4, mas está bem estabelecido que as CTMs do receptor de leptina (LepR)+ são células-chave de nicho1. As CE de MC também são altamente heterogêneas e podem fazer parte de sinusóides, arteríolas e vasos transicionais tipoH5. Diferentes estudos têm mostrado a contribuição nuançada dessas diferentes CE. Por exemplo, as CE sinusoidais endostesais estão espacialmente mais próximas das CTH quiescentes6, enquanto as CEH não migratórias com menores níveis de espécies reativas de oxigênio estão localizadas próximas às CE arteriolares7. A localização endosteal versus localização central dos nichos também é muito importante. Os vasos endosteais, do tipo H, estão associados a células estromais perivasculares que são perdidas com o envelhecimento, levando à perda deCTHs8. Na leucemia mieloide aguda, as CE centrais são expandidas, enquanto os vasos endostesais e as HSCs endosteteais são perdidos9.

A maioria dos estudos na área tem se concentrado na hematopoese propriamente dita e na regulação extrínseca das CTHs pelas células. No entanto, tem sido cada vez mais reconhecido que há necessidade de melhor caracterizar os nichos que regulam outros progenitores, nomeadamente os progenitores multipotentes (MPPs), particularmente considerando que estes são os principais causadores de hematopoese em estado estacionário10. Em contraste com uma estrutura hierárquica fixa, estudos recentes têm mostrado que a hematopoese é um continuum no qual as HSCs se diferenciam em MPPs tendenciosas em um estágio inicial11. As MPPs têm sido nomeadas a partir de diferentes esquemas declassificação12, mas um recente consenso da sociedade internacional de hematologia experimental (ISEH) propôs que as MPPs sejam discriminadas como MPPs precoces e de acordo com seu viés linfoide (MPP-Ly), megacariocítico e eritroide (MPP-Mk/E) e mieloide (MPP-G/M)13. O uso da citometria de fluxo será fundamental para aprofundar o estudo da importância dos nichos de MC na regulação dessas populações. Os métodos atuais de citometria de fluxo utilizam estratégias de gating variável para diferenciar HSPCs e identificar células estromais, ou seja, CEs, usando marcadores inconsistentes. O objetivo do método atual é apresentar um fluxo de trabalho simples e reprodutível da coloração de MB para identificar subpopulações de HSPC, grupos heterogêneos de CE e CTMs LepR+. Acreditamos que esta técnica, embora comparável com métodos previamente relatados (ver, por exemplo, referência 14), fornece um protocolo atualizado e de fácil implementação para a análise fenotípica de células hematopoéticas nas duas áreas funcionais da medula, BM endosteal e central8,15, bem como de células de nicho estromal da MO.

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Protocolo

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Os animais utilizados neste protocolo foram alojados no biotério i3S em condições específicas livres de patógenos, em um ciclo claro-escuro de 12 h e ambiente com temperatura controlada. O acesso gratuito à ração padrão para roedores e água foi fornecido. Todos os animais receberam cuidados humanos de acordo com os critérios delineados pela Federação das Associações Europeias de Zootecnia de Laboratório para o cuidado e manuseio de animais de laboratório (Diretiva UE 2010/63/UE). O procedimento experimental realizado nos animais (eutanásia) foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do i3S (ref. DD_2019_15) e pela Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Detalhes dos materiais utilizados ao longo deste protocolo podem ser encontrados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de soluções e coquetéis corantes

  1. Solução salina tamponada com fosfato (PBS): Dissolva cinco comprimidos de PBS em 1 L de água destilada. Conservar à temperatura ambiente (TR).
  2. PBS 2% de soro fetal bovino (FBS): Adicionar 10 mL de FBS a 500 mL de PBS. Conservar a 4 °C.
  3. Tampão de lise de hemácias (1x): Adicionar 50 mL de tampão de lise de hemácias 10x a 450 mL de água deionizada. Conservar a 4 °C.
  4. Solução de colagenase IV e dispase II: Dissolver 30 mg de colagenase IV e 60 mg de dispase II em 30 mL de HBSS para uma solução de colagenase IV e 2 mg/mL dispase II. Preparar fresco antes de usar.
  5. Solução de bloqueio dos receptores Fc: Adicionar 10 μL de anticorpo anti-camundongo CD16/32 purificado a 490 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C até à utilização.
  6. Solução corante de viabilidade celular fluorescente: Adicionar 2 μL de corante de viabilidade celular fluorescente a 1 mL de PBS. Preparar fresco antes de usar.
  7. Coquetel de linhagem de biotina: Misture 100 μL de cada um dos seguintes anticorpos: biotina anti-camundongo CD3ε, biotina anti-camundongo CD4, biotina anti-camundongo CD8a, biotina anti-camundongo/humano CD11b, biotina anti-camundongo/humano CD45R/B220, biotina anti-camundongo Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) e biotina anti-camundongo TER-119/células eritroides. Conservar a 4 °C até à utilização.
  8. Coquetel de coloração primária de CTHs: Adicionar 10 μL de coquetel de linhagem de biotina, 10 μL de CD150 anti-camundongo (SLAM) marcado com imunofluorescência, 10 μL de ficoeritrina (PE) anti-Flk2 de camundongo (CD135), 10 μL de proteína de peridinina-clorofila (PerCP) anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL de CD48 anti-camundongo PE/Cyanine7 e 10 μL de aloficocianina (APC)/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) a 940 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.
  9. Coquetel de coloração primária do estroma: Adicionar 5 μL de anticorpo biotinilado de leptina R de camundongo, 6,7 μL de anticorpo anti-endomucina de camundongo anti-PE, 10 μL de PerCP anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL de EP/Cyanine7 anti-mouse CD31, 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse CD45, e 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/células eritroides para 954 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.
  10. HSCs/solução de coloração secundária estromal: Adicionar 1 μL de estreptavidina APC a 1 mL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.
  11. Coquetel de coloração CE: Adicionar 10 μL de anticorpo anti-endomucina de camundongo PE, 10 μL de PerCP anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL de PE/Cyanine7 anti-mouse CD31, 10 μL de Alexa Fluor 647 anti-camundongo CD54/ICAM-1, 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 e 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/eritroides a 940 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.
  12. Solução corante DAPI: Adicionar 1 gota de reagente DAPI a 500 μL de PBS. Preparar fresco antes de usar.

2. Extração da amostra

  1. Eutanásia do animal por deslocamento cervical (detalhes dos animais utilizados para a produção dos dados apresentados neste estudo podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1). Coloque o animal com a barriga para cima em uma placa de Petri e borrife com etanol 70%. Faça um corte acima do abdômen usando uma tesoura e afaste a pele até os tornozelos.
  2. Pegue uma perna e, usando uma tesoura, corte em sua parte inferior (onde está a articulação entre a perna e o quadril) para separá-la do animal. Esta etapa servirá também como um método confirmatório secundário da eutanásia. Retire o pé da perna cortando o tornozelo. Coloque a perna em PBS 2% FBS gelado. Se necessário, repita o passo com a outra perna.
  3. Pegue o osso do quadril e, usando uma tesoura, corte atrás dele para separá-lo do animal. Coloque o osso do quadril em PBS 2% FBS gelado. Se necessário, repita o passo com o outro osso do quadril.
  4. Coloque a(s) perna(s) e o(s) osso(s) do quadril em uma placa de Petri e, usando um bisturi estéril, limpe os ossos. Separe a tíbia e o fêmur cortando o joelho com o bisturi. Coloque os ossos limpos em PBS 2% FBS gelado.

3. Processamento de amostras para análise de populações de células hematopoéticas na medula óssea total

  1. Coloque um fêmur ou tíbia em uma argamassa com PBS 2% FBS gelado e esmague o osso pressionando-o suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão. As células BM são liberadas na solução contida na argamassa.
  2. Pipetar a suspensão celular resultante para cima e para baixo usando uma pipeta de 10 mL para homogeneizar e transferir para um tubo de 50 mL através de um filtro de células de 40 μm colocado sobre o tubo.
  3. Se os ossos esmagados não parecerem brancos neste ponto, adicione mais PBS 2% FBS à argamassa e repita o esmagamento e, em seguida, pipete para cima e para baixo e transfira a solução para o mesmo tubo de 50 mL através do mesmo filtro de células de 40 μm.
  4. Enxaguar a argamassa com mais um pouco de PBS 2% FBS e transferir a solução para o mesmo tubo de 50 mL através do mesmo filtro celular de 40 μm. Centrifugar o tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C.
  5. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 5 mL de tampão de lise eritrocitário (1x) em RT pipetando para cima e para baixo várias vezes. Após uma incubação de 2 minutos em RT, adicionar 15 mL de PBS 2% FBS.
  6. Centrifugar o tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se a pastilha de célula ainda parecer avermelhada, volte para a etapa 3.5. Caso contrário, descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa de fundo em V de 96 poços para coloração.
  7. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 200 μL de solução corante fluorescente. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
  8. Placa de centrifugação a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS 2% FBS para lavar.
  9. Centrifugar a placa a 500 x g por 3 min a 4 °C, descartar o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspender a pastilha em 100 μL de solução de bloqueio dos receptores Fc. Incubar a placa durante 10 min a 4 °C protegida da luz.
  10. Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g por 3 min a 4 °C, descartar o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspender o pellet em 100 μL de coquetel de coloração primária de CTH. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
  11. Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante virando a placa para papel absorvente e ressuspender o pellet em 100 μL de solução corante secundária de CTH. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
  12. Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 minutos a 4 °C e eliminar o sobrenadante virando a placa para papel absorvente.
  13. Ressuspender o pellet em 250 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro celular de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.
    NOTA: Se estiver interessado em determinar o número absoluto de populações de células hematopoéticas, adicionar contas de calibrite aos tubos de poliestireno antes da análise no citômetro16.

4. Processamento de amostras para análise de populações de células estromais na medula óssea total

  1. Coloque um fêmur ou tíbia em uma argamassa com PBS 2% FBS gelado e esmague o osso pressionando-o suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão. Corte a ponta de uma ponta P1000 com uma tesoura e use-a para transferir todo o conteúdo da argamassa para um tubo de 50 mL (não passe por um filtro de células).
  2. Centrifugar o tubo de 50 mL a 500 x g por 5 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 3 mL de solução de colagenase IV e dispase II. Incubar o tubo a 37 °C durante 40 minutos.
  3. Completar o tubo para 25 mL com PBS 2% FBS e vórtice para misturar. Transfira o conteúdo do tubo de 50 mL para um novo tubo de 50 mL através de um filtro celular de 100 μm. Adicionar 15 mL de PBS 2% FBS ao antigo tubo de 50 mL e transferir a solução para o mesmo novo tubo de 50 mL através do mesmo filtro celular. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
  4. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 5 mL de tampão de lise eritrocitário (1x) em RT pipetando para cima e para baixo várias vezes. Após uma incubação de 2 minutos em RT, adicionar 15 mL de PBS 2% FBS.
  5. Centrifugar o tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se a pastilha de célula ainda parecer avermelhada, volte para a etapa 4.4. Caso contrário, descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS 2% FBS e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa de fundo em V de 96 poços para coloração. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
  6. Se estiver a realizar a coloração estromal, avance para o passo 4.7. Se estiver a realizar a coloração CE, avance para o passo 4.12.
  7. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 100 μL de coquetel de coloração primária estromal. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
  8. Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante virando a placa para papel absorvente e ressuspender o pellet em 100 μL de solução corante secundária estromal. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
  9. Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente.
  10. Ressuspender o pellet em 250 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro celular de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz.
  11. Imediatamente antes de ir para o citômetro, adicione 35 μL de solução corante DAPI ao tubo contendo a suspensão celular para análise por citometria de fluxo e incube o tubo em RT por 5 min no escuro. Após esta incubação, manter o gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.
  12. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 100 μL de coquetel de coloração CE. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
  13. Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
  14. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente. Ressuspender o pellet em 250 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro celular de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz.
  15. Imediatamente antes de ir para o citômetro, adicione 35 μL de solução corante DAPI ao tubo contendo a suspensão celular para análise por citometria de fluxo e incube o tubo em RT por 5 min no escuro. Após esta incubação, manter o gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.
    NOTA: Se estiver interessado em determinar os números absolutos das populações de células estromais e endoteliais, adicionar contas de calibrita aos tubos de poliestireno antes da análise no citômetro16.

5. Processamento de amostras para análise de populações de células hematopoéticas em BM triturada e lavada

  1. Coloque um fêmur em uma placa de Petri e corte as extremidades do osso usando um bisturi estéril.
  2. Lavar a parte central do osso (diáfise) passando 100 μL de PBS 2% FBS através do interior do osso uma vez de cada lado usando uma seringa de insulina sem volume morto de 0,5 mL e coletando a solução em um tubo de microcentrífuga contendo 1 mL de PBS 2% FBS. Em seguida, transferir a suspensão celular para um tubo de 50 mL marcado como BM lavado contendo 4 mL de PBS 2% FBS. Continue no gelo.
  3. Coloque as extremidades do osso em uma argamassa com PBS 2% FBS gelada e esmague pressionando-o suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão. Pipetar a suspensão celular resultante para cima e para baixo usando uma pipeta de 10 mL para homogeneizar e transferir para um tubo de 50 mL marcado como BM esmagado através de um filtro de células de 40 μm.
  4. Se o osso triturado não parecer branco neste ponto, adicione mais PBS 2% FBS à argamassa e repita o esmagamento. Em seguida, pipetar para cima e para baixo e transferir a solução para o mesmo tubo de 50 mL (BM triturado) através do mesmo filtro celular de 40 μm.
  5. Enxaguar a argamassa com mais um pouco de PBS 2% FBS e transferir a solução para o mesmo tubo de 50 mL (BM triturado) através do mesmo filtro celular de 40 μm.
  6. Centrifugar os tubos de 50 ml correspondentes às amostras lavadas e trituradas a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
  7. Siga os passos 3.5 a 3.13 (secção 3) com as amostras de BM lavadas e trituradas.

6. Preparação de controles unicolores (CCEs) para análise por citometria de fluxo

  1. Siga os passos 3.1 a 3.6 (secção 3) com um osso extra de um dos animais não utilizados para a análise principal, transferindo a suspensão celular final para um tubo de microcentrífuga contendo 1 ml de PBS 2% FBS em vez de um poço de uma placa de fundo em V de 96 poços.
  2. Transferir 100 μL da suspensão celular para 8 poços de uma placa de fundo em V de 96 poços, 100 μL para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL contendo 100 μL de PBS 2% FBS marcado como DAPI SCC, e a suspensão celular restante para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL contendo 100 μL de PBS 2% FBS marcado como não corado. Mantenha os tubos sobre gelo protegidos da luz.
  3. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C e eliminar os sobrenadantes virando a placa para papel absorvente.
  4. Ressuspender um pellet em 100 μL de solução corante fluorescente e os demais em 100 μL de PBS 2% FBS.
  5. Adicionar 0,5 μL dos seguintes anticorpos, além do coquetel de linhagem de anticorpos para o qual adicionar 2 μL e o anticorpo PECy7 CD31 para o qual adicionar 0,3 μL, a cada um dos poços com suspensão celular em PBS 2% FBS (um anticorpo por poço, mesmos anticorpos usados nos painéis de análise principais ou mesmos anticorpos fluoróforos com intensidade de fluorescência e abundância de epítopos semelhantes): coquetel de linhagem de biotina, imunofluorescentemente marcado 510 anti-mouse CD150 (SLAM), PE anti-mouse Flk2 (CD135), PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1), imunofluorescentemente marcado 647 anti-mouse CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 anti-mouse CD48, e APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit). Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
  6. Adicione 100 μL de PBS 2% FBS a cada poço e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C e eliminar os sobrenadantes virando a placa para papel absorvente.
  7. Ressuspender todos os pellets, exceto o correspondente às células incubadas com o coquetel de linhagem de anticorpos em 180 μL de PBS 2% FBS e transferir as suspensões celulares para tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de filtros celulares de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.
  8. Ressuspender as células incubadas com o coquetel de anticorpos da linhagem em 100 μL de HSCs/solução de coloração secundária estromal. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.
  9. Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
  10. Ressuspender o pellet em 180 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro de células de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.
  11. Imediatamente antes de ir para o citômetro, adicione 35 μL de solução corante DAPI ao tubo DAPI SCC e incube o tubo em RT por 5 min no escuro. Após esta incubação, manter o gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.

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Resultados

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Gráficos representativos da análise por citometria de fluxo de HSCs e MPPs em um camundongo C57Bl/6 adulto jovem saudável são mostrados na Figura 1. A estratégia de gating segue a mais recente nomenclatura harmonizadora proposta pelo ISEH13. Ao analisar o impacto de uma perturbação, como infecção ou câncer, é importante usar um mouse de controle como referência para portões normais. Os controles de fluorescência menos um (FMO) podem ser particularmente úteis para deli...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embora o protocolo descrito seja simples e de fácil execução, atenção especial deve ser dada a etapas específicas. Por exemplo, ao se obter BM lavada (passo 5.2), o volume ou o número de vezes indicado para passar PBS 2% FBS pelo interior da parte central do osso não deve ser excedido, pois isso pode resultar em contaminação significativa da amostra lavada por populações de células endosteais.

Alterações no protocolo podem ser feitas para facilitar sua execução pelo pesquisador. Na extracção d...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LM foi apoiado por uma bolsa do Lady Tata Memorial Trust. JR foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Bolseira FCT UI/BD/150833/2021). O ML foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD foi apoiado por bolsas da Sociedade Americana de Hematologia, da Fundação Pablove, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) e da Sociedade Portuguesa de Hematologia. Agradecemos o apoio da Dra. Catarina Meireles e Emília Cardoso das instalações TRACY no i3s.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor 647 anticorpo anti-camundongo CD54 / ICAM-1BioLegend116114
APC EstreptavidinaBioLegend405207
APC / Cyanine7 anti-camundongo CD117 (c-kit)anticorpo BioLegend105826
APC / Cyanine7 anti-camundongo CD45BioLegend103116
APC / Cyanine7 anti-camundongo TER-119 / anticorpo de células eritróidesBioLegend116223
Biotina anti-camundongo CD3ε anticorpoBioLegend100304
Biotina anti-camundongo CD4BioLegend100404
Biotina anti-camundongo anticorpo CD8aBioLegend100704
Biotina anti-camundongo Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) biotina bioLegend108404
Biotina anticorpo anti-rato TER-119/células eritróidesBioLegend116204
Biotina anti-rato/anticorpo humano CD11bBioLegend101204
Biotina anti-rato/humano CD45R/B220 anticorpoBioLegend103204
Brilliant Violet 510 anti-rato CD150 (SLAM)BioLegend115929
Calibrite 2 Color BeadsBD Biosciences
Collagenase IVMerck Life ScienceC1889
Dispase IIMerck Life ScienceD4693
Sérum Fetal Bovino, qualificado, inativado por calor, aprovado pela UE, Origem da América do SulThermoFisher Scientific10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)ThermoFisher Scientific14175095
Anticorpo biotinilado R de leptina de camundongoR& Sistemas DBAF497
NucBlue Reagente de Célula Fixa (DAPI)ThermoFisher ScientificR37606DAPI reagente
PE anticorpo de endomucina de camundongoThermoFisher Scientific12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135)ThermoFisher Scientific12-1351-82
PE/Cyanine7 anticorpo CD31 de camundongoBioLegend102524
Anticorpo anti-rato CD48 PE/Cyanine7 AnticorpoBioLegend103424
PerCP anti-rato Ly-6A/E (Sca-1)BioLegend108122
Comprimidos salinos tampolados com fosfato (PBS)Merck Life ScienceP4417
Anticorpo anti-rato purificado CD16/32BioLegend101302
tampão de lise de hemácias BioLegend 10xBioLegend 420302
Corante de Viabilidade Fixável Violeta Zumbi BioLegend423114corante fluorescente
349502

Referências

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