Summary
هنا ، نصف طريقة توليد نموذج إزالة الترسبات الاصطناعي باستخدام الفأر المبيض ، وهي تجربة كلاسيكية لإزالة ترسبات بطانة الرحم في مجال أبحاث إزالة ترسبات بطانة الرحم.
Abstract
إزالة بطانة الرحم هي عملية تمايز فريدة من نوعها في بطانة الرحم ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالحيض والحمل. يؤدي ضعف إزالة الترسبات إلى اضطرابات بطانة الرحم المختلفة ، مثل العقم والإجهاض المتكرر والولادة المبكرة. كان تطوير واستخدام نموذج إزالة بطانة الرحم في الدراسات الإنجابية من أبرز ما يميز الباحثين الإنجابيين لفترة طويلة. تم استخدام الفأر على نطاق واسع في دراسة التكاثر وإزالة الترسيبات. هناك ثلاثة نماذج راسخة للفأر فيما يتعلق بإزالة الترسبات ، وهي إزالة الترسبات الطبيعية للحمل (NPD) ، وإزالة الترسبات الاصطناعية (AD) ، وإزالة الترسبات في المختبر (IVD). من بينها ، يعتبر AD نموذجا موثوقا به لإزالة الفأر ، وهو سهل التنفيذ وقريب من NPD. يركز هذا البحث على طريقة معدلة لعملية توليد وتطبيق نموذج إزالة الترسيب الاصطناعي للفأر مع استئصال المبيض لتجنب تأثيرات المبيض ، والتي يمكن أن تحصل على نتائج قابلة للتكرار بدرجة كبيرة مع اختلافات صغيرة داخل المجموعة. توفر هذه الطريقة نموذجا حيوانيا جيدا وموثوقا به لدراسة إزالة بطانة الرحم.
Introduction
مع تطور التكنولوجيا الإنجابية بمساعدة الإنسان ، وصل معدل الحمل السريري الحالي لنقل الأجنة في المختبر (IVF-ET) إلى أو حتى تجاوز معدل الحمل الطبيعي. على الرغم من ذلك ، لا يزال العديد من المرضى في الممارسة السريرية للمساعدة على الإنجاب يخضعون لعمليات نقل أجنة متعددة لكنهم يفشلون في تحقيق الحمل على النحو المطلوب. ومع ذلك ، لا تزال آليته الجزيئية المحددة غير واضحة ، لذا فإن التدخل السريري غير فعال ، وهو أحد التحديات الكبيرة التي تواجه الطب التناسلي 1,2.
تمثل عوامل بطانة الرحم حوالي ثلثي أسباب فشل التلقيح الاصطناعي3. ينقسم زرع الجنين البشري إلى ثلاث مراحل: تحديد المواقع والالتصاق والغزو4،5،6. يخضع بطانة الرحم للأم لسلسلة من التغييرات لتلبية وصول الجنين. يوفر تشكيل "فترة نافذة" الزرع ظروفا مواتية لزرع الجنين 7,8.
في معظم الثدييات ، بعد التصاق الكيسة الأريمية بالظهارة اللمعية للرحم ، تبدأ الخلايا اللحمية المحيطة بالكيس الأريمي في التكاثر والتمايز بسرعة ، وتغير إعادة التشكيل السريعة للحمة المتوسطة شكلها ووظيفتها ، مما يؤدي إلى زرع الجنين5،9،10. تسمح الزيادة السريعة في حجم الموقع ووزنه للكيسة الأريمية بأن تصبح جزءا لا يتجزأ من سدى الرحم ، وهي عملية تعرف باسم إزالة الترسبات11. تتمايز سدى بطانة الرحم وتعيد تشكيلها استعدادا للحمل ، بينما يوفر انتقال الخلايا اللحمية مساحة ووصلات إشارات جديدة للخلايا النفضية لأداء وظائفها12,13. تتحول الخلايا اللحمية إلى خلايا نفضية وتفرز العديد من العوامل المميزة مثل البرولاكتين (PRL) والبروتين المرتبط بعامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (Igfbp1) وما إلى ذلك. أظهرت الدراسات أن إزالة الترسبات غير الطبيعية هي أحد الأسباب الرئيسية لفشل زرع الجنين ، لكن سبب إزالة الترسبات غير الطبيعية لا يزال غير واضح ويحتاج إلى مزيد من التوضيح1،14.
يعد نموذج إزالة الترسيب الاصطناعي للفأر ضروريا لدراسة العملية الفسيولوجية والآليات الجزيئية الكامنة وراء إزالة الترسيب. يشير نزع الترسبات الاصطناعي (AD) بشكل أساسي إلى عملية إزالة بطانة الرحم التي أنشأتها طرق اصطناعية لمحاكاة الحمل أو الدورة الشهرية. من حيث التشكل ، هناك فرق عام بسيط بين إزالة الترسبات أثناء الحمل وإزالة الترسبات الاصطناعية15,16. توجد الغدد الرحمية في بطانة الرحم قبل شكل decidua وتختفي بعد إزالة الترسبات. فيما يتعلق بالتعبير الجيني ، يتم تحديد اختلاف طفيف فقط بين إزالة الحمل الطبيعي (NPD) و AD15. وبالتالي ، يمكن لنموذج إزالة الترسبات الاصطناعي في الفئران محاكاة إزالة الترسبات أثناء الحمل لاستكشاف التسبب غير المعروف والعلاج الجديد للأمراض التناسلية البشرية.
NPD و AD و decidualization في المختبر (IVD) هي ثلاث طرق لتحقيق إزالة الترسبات من الماوس. يعتمد نموذج NPD على الحمل الطبيعي وهو الأقرب إلى الحالة الفسيولوجية للأم ، بما في ذلك تأثيرات الأجنة. تعد مقارنة الاختلافات بين مواقع الزرع وغير المزروعة طريقة فسيولوجية ومريحة أكثر لدراسة إزالة الترسيب. تم تطوير نموذج مرض الزهايمر باستخدام حقن زيت السمسم داخل الرحم كمنشط للحث على إزالة الترسبات في أنثى فأر حامل كاذبة تتزاوج مع ذكور تم قطع القناة المنوية لتجنب تأثير الأجنة. يلعب كل من نماذج NPD و AD أدوارا أساسية في أغراض بحثية مختلفة ، لكنهما لا يستطيعان تجنب فشل التزاوج والاختلافات داخل المجموعة الناتجة عن الأنشطة المختلفة لعملية التمثيل الغذائي لهرمون الأم. IVD هي طريقة تعتمد على علاج هرمون الاستروجين والبروجستيرون مجتمعين على المستوى الخلوي ، الأمر الذي يتطلب ظروفا تجريبية أكثر صرامة وقدرة تشغيلية. ومع ذلك ، لا يمكن للنموذج في المختبر محاكاة الاستجابة العشرية بشكل كامل في ظل الظروف الفسيولوجية15. لذلك ، نقترح طريقة تحريض بسيطة ومحسنة معدلة من مرض الزهايمر التقليدي لتقليل تأثير الهرمونات الداخلية على إزالة الترسيب. بناء على ضمان نجاح تحريض إزالة الترسبات ، فهو أقرب إلى الحالة الفسيولوجية وأكثر ملاءمة للتجارب التي تحتاج إلى استبعاد عوامل الجنين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة من قبل مستشفى برج الطبل التابع للجنة كلية الطب بجامعة نانجينغ حول استخدام ورعاية الحيوانات (رقم 20171202). تتبع جميع العمليات وكالة رعاية واستخدام الحيوانات المناسبة والمبادئ التوجيهية الوطنية.
ملاحظة: تمت تربية الفئران في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) ، مع درجة حرارة 22 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية ، ورطوبة نسبية تبلغ 50٪ ± 1٪ ، ودورة ضوء / مظلمة تبلغ 12 ساعة / 12 ساعة ، وحرية الوصول إلى الطعام والماء.
1. استئصال المبيض الفأر
- تعقيم الأدوات الجراحية مع معقم درجة حرارة عالية وضغط عالي 1 قبل يوم من العملية.
- قم بوزن الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8 أسابيع وحقن 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم داخل الصفاق وفقا لتخدير الفئران. الجرعة المستخدمة هي 40 ملغ/كغ17. توفر هذه الجرعة 40-60 دقيقة من التخدير ، والتي تلبي متطلبات استئصال المبيض. للتسكين قبل الجراحة، يتم حقن الفئران بجرعة 5 ملغ/كغ من ميلوكسيكام.
ملاحظة: يمكن الإشارة إلى التخدير الناجح في الفئران من خلال اختفاء ردود الفعل العضلية العميقة والتنفس الثابت. تشمل علامات التخدير الناجح عدم الرمش عند لمس العلبة الداخلية ، وعدم البلع عند سحب اللسان ، وعدم ثني الساق عند قرص الجلد بين أصابع القدم ، وعدم الارتداد عند وخز الذيل. - ضع مرهم العين الواقي على مقل العيون لمنع الجفاف أثناء التخدير.
- ابدأ العملية عندما يتم تخدير الفئران تماما. ضع الفئران وثبتها في وضعية الانبطاح على سطح التشغيل ، واحلق الشعر على الظهر بعد ترطيبها بالماء والصابون. تطهير الجلد مع 70 ٪ من الإيثانول بعد الحلاقة.
- ابحث عن موقع شق العملية على بعد 0.5 سم (أو 1.0 سم أسفل الضلع) على الحافة العلوية لجذر الفخذ لكلا الطرفين الخلفيين الموازيين للعمود الفقري (الشكل 1 أ).
ملاحظة: موقع الشق الصحيح ضروري لتحديد موقع المبيض بسرعة. - خذ موقع الشق كمركز وقم بتطهير منطقة الشق باستخدام iodophor 3x ، ثم ضع ستارة جراحية حول منطقة الشق.
- قم بعمل شق طولي بحوالي 0.5-1.0 سم باستخدام المقص. قطع اللفافة وفصل العضلات بشكل سلبي مع ملاقط.
- ابحث عن قطعة من وسادة الدهون البيضاء في حقل الشق بالقرب من القطب السفلي للكلية من خلال طبقة العضلات الرقيقة (الشكل 1 ب).
ملاحظة: وسادة الدهون البيضاء هي المؤشر الأكثر وضوحا لموقع المبيض. - قم بتثبيت كتلة الدهون بمقاطع مرقئ ، واسحب المبيض الملفوف بواسطة وسادة الدهون من الشق.
- المشبك تقاطع المبيض وقناة فالوب مع ملاقط منحنية ، وإزالة المبيض على طول عنيق المبيض مع مقص. أوقف النزيف باستخدام قلم التخثير الكهربائي أو إبرة من حقنة سعة 1 مل يتم تسخينها على مصباح الكحول.
ملاحظة: تأكد من الحفاظ على قناة فالوب ، وهي المعلم التشريحي للحقن اللاحق لزيت السمسم في قرون الرحم. - شطف الشق الجراحي بمحلول ملحي طبيعي لمنع التصاق الأنسجة ، واستخدام خياطة 4-0 لخياطة العضلات والجلد على التوالي ، وتطهير الشق الجراحي باستخدام اليودوفور مرة أخرى.
- ضع الفئران في وضعية الانبطاح في القفص وأنعشها في حاضنة 25 درجة مئوية مجهزة بمصدر ضوء ونظام تهوية لمدة 2 ساعة تقريبا.
- انتبه للفئران بعد العملية، وأعدها إلى مكان التغذية الأصلي بمفردها حتى تتعافى تماما، وامنحها ما يكفي من الماء والطعام.
2. الراحة بعد العملية الجراحية وصياغة هرمون الاستروجين والبروجستيرون
- تأكد من راحة الفئران لمدة 2 أسابيع بعد استئصال المبيض.
- في خزانة فائقة النظافة ، أضف الإستروجين (2 نانوغرام / ميكرولتر) والبروجسترون (0.2 نانوغرام / ميكرولتر) إلى زيت السمسم في أنابيب الطرد المركزي الخالية من إنزيمات الحمض النووي الريبي.
- ضع أنابيب الطرد المركزي في حمام مائي ثرموستاتي عند 37 درجة مئوية وهز الأنابيب باستمرار لتسريع الذوبان.
- بعد الذوبان الكامل ، قسم محلول زيت السمسم إلى 100 ميكرولتر من الإقوتات للاستخدام المريح. قم بتخزين محاليل الإستروجين والبروجسترون المحضرة في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية.
3. نموذج إزالة الترسيب الاصطناعي المستحث
- تحت الجلد (s.c) حقن 100 نانوغرام من هرمون الاستروجين في 50 ميكرولتر من زيت السمسم في كل فأر لمدة 3 أيام ، تليها 2 أيام من الراحة15.
ملاحظة: تأكد من أن هرمون الاستروجين والبروجسترون قد تمت صياغتهما ووضعهما في أماكن مختلفة. أي تلوث للإستروجين بالبروجسترون قد يؤدي إلى الفشل. - حقن (s.c.) 1 ملغ من هرمون البروجسترون و 10 نانوغرام من هرمون الاستروجين في 50 ميكرولتر من زيت السمسم في كل فأر لمدة 3 أيام أخرى15.
- تشغيل الفئران للحث على نموذج decidualization الاصطناعي15 6 h بعد الحقن الثالث الاستروجين والبروجستيرون مجتمعة.
- ابحث عن قرن الرحم في الطرف السفلي من قناة فالوب وحقن 20 ميكرولتر من زيت السمسم ببطء مع قرن الرحم ، وادفع الأنسجة للخلف ، وخيط الشق ، واسمح للفأر بالتعافي. نهج العملية هو نفس استئصال المبيض الفأر15.
ملاحظة: تابع الجراحة الثانية فقط في حالة استئصال المبيض الناجح (يتم التئام شق الجلد جيدا ، ويتم استئصال المبيض بالكامل ، ولا يتم التصاق الطرف المتبقي من قناة فالوب بالأنسجة المحيطة).
ملاحظة: لتحفيز نموذج AD ، 20 ميكرولتر من زيت السمسم مناسب ؛ أكثر من 20 ميكرولتر من زيت السمسم سوف تخترق الجانب الآخر بسهولة. - حقن (s.c.) 50 ميكرولتر من زيت السمسم يحتوي على 1 ملغ من هرمون البروجسترون و 10 نانوغرام من هرمون الاستروجين (H.) لمدة 4 أيام أخرى. انظر التفاصيل في الشكل 215,18.
4. جمع العينات
- القتل الرحيم للفئران (ن = 6) عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون وجمع الرحم. راقب شكل الرحم الثنائي ، والتقط صورا ، وقم بوزن قرون الرحم (الشكل 3 أ ، ب).
- إصلاح 3-5 مم من أنسجة الرحم مع 10 ٪ من الفورمالين ، وتضمينها في البارافين ، وتقسيمها. تلطيخ المقاطع مع الهيماتوكسيلين ويوزين لمراقبة التغيرات المورفولوجية19 (الشكل 4 أ).
- قم بتضمين 3-5 مم أخرى من أنسجة الرحم في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، وقم بتجميدها في النيتروجين السائل ، وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية. قسم الأنسجة المجمدة إلى 10 ميكرومتر والكشف عن نشاط الفوسفاتيز القلوي في أنسجة الرحم عن طريق طريقة اقتران الآزو20 (الشكل 4 ب).
ملاحظة: يمكن الحصول على نتائج مرضية باستخدام الأقسام المجمدة للكشف عن محتوى ALP ، وليس أقسام البارافين. - استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي للرحم باستخدام كاشف Trizol وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) على نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (جدول المواد) باستخدام مزيج qPCR الرئيسي (جدول المواد) للكشف عن تعبير mRNA النسبي لعائلة البرولاكتين 8 أفراد الفصيلة الفرعية 2 (Prl8a2) ، كبد / عظم / كلية الفوسفاتيز القلوي (Alpl) ، وبروتين ربط عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (Igfbp1) 15 عن طريق التطبيع إلى مستويات 18S mRNA (الشكل 4C-E ). اتبع شروط PCR: المرحلة 1 ، 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ المرحلة 2 ، 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ كرر الدورة 40x. يتم توفير قائمة كاملة من تسلسلات التمهيدي في الجدول 1.
- تحليل بيانات qPCR باستخدام طريقة 2-ΔΔCT وطريقة اختبار t للتحليل الإحصائي في البرنامج المناسب. في هذه الدراسة ، تم اعتبار p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تتضمن مؤشرات نموذج إزالة الترسبات من الفأر التشكل العام للرحم ، ونسبة كتلة الرحم المنزوع الترسبي وغير المنزوع الترسبي ، والتشكل النسيجي لبطانة الرحم ، ومستوى التعبير عن جزيئات علامة إزالة الترسب. التشكل العام للرحم الاصطناعي المنزوع الرواسب للفئران التي يسببها الزيت أقرب إلى الرحم أثناء الحمل. يصبح جسم الرحم سميكا ، ويصبح تجويف الرحم أصغر من الجانب غير المستحث. حجم ووزن قرن الرحم المستحث أعلى بكثير من الجانب غير المستحث (الشكل 3 أ ، ب). أظهر تلطيخ أنسجة الرحم أن الغدد تختفي وأن خلايا انسجة بطانة الرحم على القرن المستحث متمايزة إلى خلايا نفضية كبيرة ومستديرة وسيتوبلازمية ومتعددة النوى ذات حدود خلايا غير واضحة. تظهر المقاطع الجانبية غير المستحثة مورفولوجيا أنسجة بطانة الرحم في حالة فسيولوجية طبيعية (الشكل 4 أ). أظهرت نتيجة طريقة اقتران الآزو أن محتوى الفوسفاتيز القلوي للجانب الناجم عن الزيت كان أعلى بكثير من الجانب غير المستحث (الشكل 4 ب). أظهرت نتائج qPCR أن تعبير mRNA ل Prl8a2 و Alpl و Igfbp1 في القرن المستحث كان أعلى بكثير من ذلك في القرن غير المستحث ، مما يشير إلى أن الزيت يمكن أن يحفز إزالة الترسيب الاصطناعي في الفئران (الشكل 4C-E).
الشكل 1: الشق الجراحي لاستئصال المبيض الفأر. أ: موضع استئصال المبيض في الفأر. ب: موضع مبيض الفأر أثناء استئصال المبيض. ج: موقع المبيض أثناء استئصال المبيض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إجراء العملية. يشمل الإجراء بأكمله استئصال المبيض ، والراحة بعد العملية الجراحية ، وتحريض نموذج إزالة الترسبات الاصطناعي ، والتحقق من صحة النمط الظاهري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توليد نموذج إزالة الترسيب الاصطناعي للفأر. (أ) صورة تمثيلية لعملية إزالة الترسيب الاصطناعي التي يسببها النفط. لم يتم حقن الرحم الأيمن بالزيت المسمى الزيت (-). تم حقن الرحم الأيسر بالزيت المسمى الزيت (+). ب: وزن الرحم المحقون بالزيت أو بدونه. ص < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحقق من صحة نموذج إزالة الترسيب الاصطناعي للفأر . (أ) صورة سعادة تمثيلية لإزالة الترسيب الاصطناعي الناجم عن النفط. شريط المقياس = 1 مم و 100 ميكرومتر. (ب) اكتشفت طريقة اقتران الآزو نشاط الفوسفاتيز القلوي للديسيدوا الاصطناعية. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر و 50 ميكرومتر. (ج) تم الكشف عن مستوى التعبير ل Prl8a2 mRNA بواسطة qPCR. * ص < 0.05. د: مستوى التعبير عن الحمض النووي الريبوزي الرسول ( Alpl mRNA). ** ص < 0.01. ه: مستوى التعبير عن Igfbp1 mRNA . ** ص < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ماوس Igfbp1 qPCR-F | GCCCAACAGAAAGCAGGAGATG |
| ماوس Igfbp2 qPCR-R | GTAGACACCACAGAGTCCA |
| Prl8a2 ماوس qPCR-F | ACCACAACCTCTCAGCTGG |
| Prl8a2 ماوس qPCR-R | TGTTCAGGTCCATGAGCTGGTG |
| ألبل ماوس qPCR-F | CCAGAAAGACCTTGACTGTGG |
| ألبل ماوس qPCR-R | TCTTGTCCGTGTCGCTCACCAT |
| 18s ماوس qPCR-F | ATGGCCGTTCTTAGTTGGTG |
| 18s ماوس qPCR-R | CGGACATCTAAGGGCATCAC |
الجدول 1: قائمة تسلسلات التمهيدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إزالة الترسبات في الفئران هي عملية عفوية تعتمد على وجود الأجنة ، والتي تختلف عن البشر. ومع ذلك ، فقد وجد أن التحفيز الاصطناعي مثل حقن الرحم من الخرز الزجاجي وتمزق الرحم يمكن أن يؤدي إلى إزالة بطانة الرحم بدلا من الأجنة. بالإضافة إلى ذلك ، وجد الباحثون أن العديد من العوامل يمكن أن تحفز العشرية أو المشاركة في إزالة الترسبات ، مثل حقن هرمونات الستيرويد والبروستاجلاندين والعوامل المثبطة للنمو في تجويف الرحم21. بالمقارنة مع طرق النمذجة المذكورة أعلاه ، فإن نموذج الماوس المفصل هنا مع استئصال المبيض ، باستخدام زيت السمسم كمنشط ، يمكن أن يستبعد آثار هرمون الاستروجين والبروجستيرون المنتج داخليا. لذلك ، فهي اقتصادية وسهلة التشغيل.
يجب إزالة المبايض بشكل نظيف لمنع أنسجة المبيض المتبقية ، والتي سوف تؤثر على تحريض الترسبات اللاحقة. تهدف هذه الخطوة إلى تقليل آثار هرمون الاستروجين والبروجسترون الداخلي الذي ينتجه المبيضان. يجب تجنب تلف قناة فالوب لأنه يمكن استخدامه كعلامة للبحث عن الرحم عند حقن زيت السمسم في تجويف الرحم. في حالة حدوث التصاق في البطن أو إزالة قناة فالوب ، يجب على المشغل الانتباه إلى تمييز الرحم عن الأمعاء.
يحدث تسرب الزيت بسهولة في عملية الحقن تحت الجلد. يجب على المرء اختيار جلد البطن كموقع للحقن تحت الجلد وتجنب الحلمات. من الضروري حقن الزيت وسحب الإبرة ببطء. إذا تعذر سحب الإبرة عندما يكون الماوس نشطا ، فإنه يؤدي بسهولة إلى التسرب. يجب على المرء أن يضغط على موقع الإبرة بكرة قطنية للحظة لمنع التسرب. تم استخدام حقن هرمون الاستروجين والبروجسترون الخارجية في هذه العملية للحفاظ على استقرار مستويات هرمون الفئران قبل عملية إزالة الترسيب المحفزة. تحاكي طريقة الحقن هذه التغيرات الهرمونية في فترة ما حول زرع الفئران. هنا ، قمنا بإحداث إزالة الترسبات بعد ذروة الإستروجين الثانية.
مفتاح نجاح هذه العملية هو كمية زيت السمسم المحقونة. الكثير من زيت السمسم سوف يخترق تجويف القرن الآخر من الرحم. سيؤدي عدم كفاية زيت السمسم إلى انخفاض استجابة إزالة الترسبات أو إزالة الترسبات غير المتساوية على طول الرحم ، مما يؤدي إلى اختلافات تجريبية غير متوقعة. أثناء العملية ، يجب إدخال إبرة المحقنة في تجويف الرحم عند حقن زيت السمسم وسحبها برفق ذهابا وإيابا للتأكد من وجود الإبرة في تجويف الرحم. يمكن رؤية جزء من تجويف الرحم شفافا إذا تم حقنه بنجاح. يجب على المرء أن يثبت وخز الدبوس برفق بملاقط لمدة 10 ثوان تقريبا للتأكد من إغلاقه ، مما يمنع تسرب زيت السمسم بعد سحب الإبرة. في الوقت نفسه ، ادفع جسم الرحم برفق لأسفل باستخدام الإبرة لجعل زيت السمسم ينتشر بالتساوي في تجويف الرحم.
يعد العلاج والإنعاش بعد العملية من المفاتيح الأخرى لنجاح هذا النموذج. أولا ، من الضروري الحفاظ على بيئة معقمة للشق أثناء العملية. قبل إنعاش الفئران ، قم بتطهير شق العملية باليودوفور وقم بتغطيته بقطعة من الشاش الطبي لتقليل حدوث العدوى. بعد العملية ، تحتاج الفئران إلى استقلاب التخدير لمدة 2-3 ساعات للتعافي. خلال هذه الفترة ، يجب وضع الفئران في حاضنة 25 درجة مئوية للتعافي بشكل أسرع وتجنب انخفاض حرارة الجسم الناجم عن التطهير بنسبة 70٪ من الكحول واليودوفور. يجب على المرء الانتباه إلى الشفاء في غضون أيام قليلة بعد العملية والتعامل مع أنواع المضاعفات الجراحية في الوقت المناسب ، مثل تكسير الشق والتورم والتقرح وما إلى ذلك.
Prl8a2 و Alpl هما أكثر علامات إزالة الترسبات الكلاسيكية. Igfbp1 هو أيضا البروتين الرئيسي في الخلايا المنزوع الترسبات في الفئران ويعتبر علامة محددة لإزالة الترسبات في الفئران. تزداد مستويات التعبير عن Prl8a2 و Alpl و Igfbp1 mRNA في قرن الرحم الناجم عن الزيت بشكل ملحوظ مقارنة بجانب التحكم بدون حقن الزيت. علاوة على ذلك ، فإن نشاط الفوسفاتيز القلوي على الجانب الناجم عن الزيت أعلى بكثير منه على جانب التحكم. تشير جميع هذه النتائج إلى نجاح نموذج إزالة الترسيب الاصطناعي15.
يمكن استخدام نموذج إزالة الترسيب الاصطناعي للفأر للتحقق من صحة جزيئات العقم المسببة للأمراض وتوفير نموذج تحقق جيد لتشخيص وعلاج العقم المرتبط بإزالة ترسبات بطانة الرحم غير الطبيعية. هذا النموذج مفيد لدراسة الأمراض التناسلية ، مثل الإجهاض المتكرر وفشل الزرع المتكرر. يتم استخدامه لدراسة دور العوامل الأمومية في زرع الجنين وغزوه. يتمتع نموذج AD هذا بأمان جيد ومعدل نجاح مرتفع ويحل تأثير الهرمونات الذاتية. ومع ذلك ، فهي عملية تستغرق وقتا طويلا وتتطلب الكثير من المتطلبات. سنقوم بتحسين أساليبنا التجريبية لتسهيل البحث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (82001629 ، XQS) ، وبرنامج الشباب لمؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20200116 ، XQS) ، وتمويل أبحاث ما بعد الدكتوراه في مقاطعة جيانغسو (2021K277B ، XQS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estrogen | Sigma | E2758 | Hormone supplement |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Hormone supplement |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | Hormone supplement |
| Sodium pentobarbital | Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd. | Anaesthesia | |
| Meloxicam injection | Qilu Animal Health Products Co., Ltd | Analgesia | |
| Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method) | Solarbio | G1480 | Alkaline phophatase stain |
| Eosin | Servicebio | G1005-2 | HE stain |
| Hematoxylin | Servicebio | G1005-1 | HE stain |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | qPCR |
| 70% ethanol | Lircon | ZH1120090 | Disinfect |
| Iodophor | Runzekang | RZK-DF | Disinfect |
| Erythromycin Eye Ointment | Guangzhou Baiyunshan | Mice eyeball protect | |
| 4-0 suture | Ethicon | W329 | Incision suture |
| 10% formalin | Yulu | L25010118 | Tissue fix |
| Optimal cutting temperature compound | Sakura | 4583 | Ssection |
| Trizol reagent | Ambion | 15596018 | qPCR |
References
- Carson, S. A., Kallen, A. N. Diagnosis and management of infertility: A review. JAMA. 326 (1), 65-76 (2021).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility dagger. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
- Sang, Y., Li, Y., Xu, L., Li, D., Du, M. Regulatory mechanisms of endometrial decidualization and pregnancy-related diseases. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 52 (2), 105-115 (2020).
- Ng, S. W., et al. Endometrial decidualization: The primary driver of pregnancy health. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4092 (2020).
- Birgit, G., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function. Human Reproduction Update. 25 (1), 114-133 (2019).
- Paulson, E. E., Comizzoli, P. Endometrial receptivity and embryo implantation in carnivores-commonalities and differences with other mammalian species. Biology of Reproduction. 104 (4), 771-783 (2021).
- Kelleher, A. M., Milano-Foster, J., Behura, S. K., Spencer, T. E. Uterine glands coordinate on-time embryo implantation and impact endometrial decidualization for pregnancy success. Nature Communications. 9 (1), 2435 (2018).
- Tian, J., et al. Attenuated monoamine oxidase a impairs endometrial receptivity in women with adenomyosis via downregulation of FOXO1dagger. Biology of Reproduction. 105 (6), 1443-1457 (2021).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 155-165 (2012).
- Dunn, C. L., Kelly, R. W., Critchley, H. O. Decidualization of the human endometrial stromal cell: an enigmatic transformation. Reproductive BioMedicine Online. 7 (2), 151-161 (2003).
- Zhu, H., Hou, C. C., Luo, L. F., Hu, Y. J., Yang, W. X. Endometrial stromal cells and decidualized stromal cells: Origins, transformation and functions. Gene. 551 (1), 1-14 (2014).
- Jose, R. M., et al. Endometrial and decidual stromal precursors show a different decidualization capacity. Reproduction. 160 (1), 83-91 (2020).
- Pan-Castillo, B., et al. Morphophysical dynamics of human endometrial cells during decidualization. Nanomedicine. 14 (7), 2235-2245 (2018).
- Wang, C., et al. Comparative analysis of mouse decidualization models at the molecular level. Genes. 11 (8), 935 (2020).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vriens, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. (121), e55168 (2017).
- Kerger, H., et al. Microvascular oxygen delivery and interstitial oxygenation during sodium pentobarbital anesthesia. Anesthesiology. 86 (2), 372-386 (1997).
- Filant, J., Spencer, T. E. Endometrial glands are essential for blastocyst implantation and decidualization in the mouse uterus. Biology of Reproduction. 88 (4), 93 (2013).
- Sheng, X., et al. The mitochondrial protease LONP1 maintains oocyte development and survival by suppressing nuclear translocation of AIFM1 in mammals. EBioMedicine. 75, 103790 (2022).
- Grogg, E., Pearse, A. G. Coupling azo dye methods for histochemical demonstration of alkaline phosphatase. Nature. 170 (4327), 578-579 (1952).
- Labarta, E., et al. Analysis of serum and endometrial progesterone in determining endometrial receptivity. Human Reproduction. 36 (11), 2861-2870 (2021).
