Isolamento e quantificação do vírus Epstein-Barr a partir da linhagem celular P3HR1

Resumo

Este protocolo permite o isolamento de partículas do vírus Epstein-Barr da linhagem celular humana P3HR1 ao induzir o ciclo lítico viral com 12-miristato de forbol 13-acetato. O DNA é subsequentemente extraído da preparação viral e submetido a PCR em tempo real para quantificar a concentração de partículas virais.

Resumo

O vírus Epstein-Barr (EBV), formalmente designado como herpesvírus humano 4 (HHV-4), é o primeiro vírus tumoral humano isolado. Quase 90-95% da população adulta do mundo está infectada pelo EBV. Com os recentes avanços em biologia molecular e imunologia, a aplicação de modelos experimentais in vitro e in vivo forneceu uma visão profunda e significativa da patogênese do EBV em muitas doenças, bem como da tumorigênese associada ao EBV. O objetivo deste trabalho experimental visualizado é fornecer uma visão geral do isolamento de partículas virais de EBV de células da linhagem celular P3HR1, seguido de quantificação da preparação viral. As células P3HR1, originalmente isoladas de um linfoma de Burkitt humano, podem produzir um vírus P3HR1, que é uma cepa de EBV tipo 2. O ciclo lítico do EBV pode ser induzido nessas células P3HR1 pelo tratamento com 12-miristato de forbol 13-acetato (PMA), produzindo partículas virais de EBV.

Usando este protocolo para o isolamento de partículas de EBV, as células P3HR1 são cultivadas por 5 dias a 37 °C e 5% de CO₂ em meio completo RPMI-1640 contendo 35 ng/mL de PMA. Posteriormente, o meio de cultura é centrifugado a uma velocidade de 120 x g por 8 min para peletizar as células. O sobrenadante contendo vírus é então coletado e girado a uma velocidade de 16.000 x g por 90 min para pellet as partículas de EBV. O pellet viral é então ressuspenso em um meio RPMI-1640 completo. Isto é seguido por extração de DNA e PCR quantitativa em tempo real para avaliar a concentração de partículas de EBV na preparação.

Introdução

O vírus Epstein-Barr (EBV) é o primeiro vírus tumoral humano a ser isolado¹. O EBV, formalmente referido como herpesvírus humano 4 (HHV-4)², faz parte da subfamília do vírus do herpes gama da família do vírus do herpes e é o protótipo do gênero Lymphocryptovirus . Quase 90-95% da população adulta do mundo está infectada pelo vírus³. Na maioria dos casos, a infecção inicial ocorre nos primeiros 3 anos de vida e é assintomática, no entanto, se a infecção ocorrer mais tarde durante a adolescência, pode dar origem a uma doença referida como mononucleose infecciosa^4<....

Protocolo

NOTA: O EBV deve ser considerado um material potencialmente bioperigoso e, portanto, deve ser manuseado sob contenção de Nível de Biossegurança 2 ou superior. Um jaleco, bem como luvas devem ser usados. Se houver potencial para exposição a salpicos, a proteção ocular também deve ser considerada. O procedimento a seguir deve ser conduzido em um Gabinete de Segurança Biológica.

1. Contando as células P3HR1

1. Células de centrifugação e ressuspensão
   1. Transferir a suspensão celular de uma placa de cultura de 100 mm (ou balão T-25) de uma cultura de células P3HR1 em curso com 80% de confluência para um tubo cónico d....

Resultados

O objetivo deste procedimento é isolar partículas de EBV em uma suspensão com título viral conhecido, que poderia posteriormente ser usada para modelar a infecção por EBV. Assim, é de extrema importância utilizar concentrações ótimas dos diferentes reagentes para obter o maior rendimento de EBV fora do procedimento.

Um ensaio de otimização foi realizado para determinar as concentrações de PMA e DMSO que produziriam o maior número de partículas de EBV (Figura 2). U.......

Discussão

A produção de partículas de EBV é necessária para a compreensão da biologia deste vírus, bem como suas doenças associadas. Aqui descrevemos a produção dessas partículas a partir da linhagem celular P3HR-1. Esta linhagem celular não é a única linha produtora de EBV; de fato, as partículas de EBV também foram isoladas das células B95-8^21,22, bem como da linhagem celular Raji^18,19. O ciclo lítico do EBV foi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,2 mL de tubos de PCR de parede fina	Thermo Scientific	AB0620	Deve ser autoclavado antes
do uso 0,2-10 µ L Pontas de Filtro de Microvolume	Corning	4807	Deve ser autoclavado antes do uso
0.5-10 µ L Pipeta BrandTech		704770
10 mL Pipeta Sorológica Descartável	Corning	4488
1000 µ L Ponteiras de Pipeta Filtradas	QSP	TF-112-1000-Q
100-1000 µ L Pipeta	Eppendorf	3123000063
100x20 mm Placas de Cutura	Sarstedt	83.1802
10-100 µ Pipeta L	BrandTech	704774
Tubos Cônicos de 15 mL	Corning	430791
200 µ L Ponteiras de Pipeta Filtradas	QSP	TF-108-200-Q
20-200 µ L Pipeta	Eppendorf	3123000055
50 mL Tubos cônicos	Corning	430828
CFX96 Termociclador C-1000 em tempo real	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
Água livre DNase/RNase	Zymo Research	W1001-1
EBER Primers	Macrogen	N/A	Primers personalizados
Controle de DNA EBV (Padrões)	Vircell	MBC065
Etanol (Grau de Reagente de Laboratório)	Fischer Chemical	E / 0600DF / 17
Soro Bovino Fetal	Sigma	F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge	Thermo Scientific	Solução de
	Qiagen	158930
Hemocitômetro	BOECO	BOE 01
Microscópio de Luz Invertida	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
Tubo de Microcentrífuga	Costar (Corning)	3621	Deve ser autoclavado antes do uso
Linha Celular P3HR-1	ATCC	HTB-62
Penicilina-Estreptomicina Solução	Biowest	L0022
Fenol	VWR	20599.297
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Enchimento de pipetas	Toalhetes de precisão Thermo Scientific	9501
Kimtech		7552
RPMI-1640 Meio de cultura	Sigma	R7388
Centrífuga SL 16R	Thermo Scientific	75004030
Acetato de Sódio	Riedel-de Haë n (Honeywell)	25022
Espectrofotômetro	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
Trypan Blue Solution	Sigma	T8154
Incubadora de CO2 com camisa de água	Thermo Scientific	4121

Glicogênio 10651805