Artigo de método

Isolamento e quantificação do vírus Epstein-Barr a partir da linhagem celular P3HR1

DOI:

10.3791/64279

⸱

28 de setembro de 2022

 ,  , 
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo permite o isolamento de partículas do vírus Epstein-Barr da linhagem celular humana P3HR1 ao induzir o ciclo lítico viral com 12-miristato de forbol 13-acetato. O DNA é subsequentemente extraído da preparação viral e submetido a PCR em tempo real para quantificar a concentração de partículas virais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O vírus Epstein-Barr (EBV), formalmente designado como herpesvírus humano 4 (HHV-4), é o primeiro vírus tumoral humano isolado. Quase 90-95% da população adulta do mundo está infectada pelo EBV. Com os recentes avanços em biologia molecular e imunologia, a aplicação de modelos experimentais in vitro e in vivo forneceu uma visão profunda e significativa da patogênese do EBV em muitas doenças, bem como da tumorigênese associada ao EBV. O objetivo deste trabalho experimental visualizado é fornecer uma visão geral do isolamento de partículas virais de EBV de células da linhagem celular P3HR1, seguido de quantificação da preparação viral. As células P3HR1, originalmente isoladas de um linfoma de Burkitt humano, podem produzir um vírus P3HR1, que é uma cepa de EBV tipo 2. O ciclo lítico do EBV pode ser induzido nessas células P3HR1 pelo tratamento com 12-miristato de forbol 13-acetato (PMA), produzindo partículas virais de EBV.

Usando este protocolo para o isolamento de partículas de EBV, as células P3HR1 são cultivadas por 5 dias a 37 °C e 5% de CO2 em meio completo RPMI-1640 contendo 35 ng/mL de PMA. Posteriormente, o meio de cultura é centrifugado a uma velocidade de 120 x g por 8 min para peletizar as células. O sobrenadante contendo vírus é então coletado e girado a uma velocidade de 16.000 x g por 90 min para pellet as partículas de EBV. O pellet viral é então ressuspenso em um meio RPMI-1640 completo. Isto é seguido por extração de DNA e PCR quantitativa em tempo real para avaliar a concentração de partículas de EBV na preparação.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O vírus Epstein-Barr (EBV) é o primeiro vírus tumoral humano a ser isolado1. O EBV, formalmente referido como herpesvírus humano 4 (HHV-4)2, faz parte da subfamília do vírus do herpes gama da família do vírus do herpes e é o protótipo do gênero Lymphocryptovirus . Quase 90-95% da população adulta do mundo está infectada pelo vírus3. Na maioria dos casos, a infecção inicial ocorre nos primeiros 3 anos de vida e é assintomática, no entanto, se a infecção ocorrer mais tarde durante a adolescência, pode dar origem a uma doença referida como mononucleose infecciosa4. O EBV é capaz de infectar células B em repouso, induzindo-as a se tornarem linfoblastos B proliferativos nos quais o vírus estabelece e mantém um estado de infecção latente5. O EBV pode ser reativado a qualquer momento e, assim, levar a infecções recorrentes6.

Nos últimos 50 anos, a associação entre alguns vírus e o desenvolvimento de malignidades humanas tornou-se cada vez mais evidente, e hoje estima-se que 15% a 20% de todos os cânceres humanos estejam relacionados a infecções virais7. Os vírus do herpes, incluindo o EBV, são alguns dos exemplos mais bem estudados desses tipos de vírus tumorais8. De fato, o EBV pode causar muitos tipos de neoplasias malignas humanas, como linfoma de Burkitt (BL), linfoma de Hodgkin (LH), linfoma difuso de grandes células B e doenças linfoproliferativas em hospedeiros imunocomprometidos 9,10. O EBV também demonstrou estar associado ao desenvolvimento de doenças autoimunes sistêmicas. Alguns exemplos dessas doenças autoimunes são artrite reumatoide (AR), polimiosite-dermatomiosite (PM-DM), lúpus eritematoso sistêmico (LES), doença mista do tecido conjuntivo (MCTD) e síndrome de Sjögren (SS)11. O EBV também está associado ao desenvolvimento de doença inflamatória intestinal (DII)12.

Muitas dessas doenças podem ser estudadas ou modeladas usando cultura de células, camundongos ou outros organismos infectados com EBV. É por isso que as partículas de EBV são necessárias para infectar células ou organismos, seja em modelos in vitro ou in vivo 13,14,15,16, daí a necessidade de desenvolver uma técnica que permita o isolamento de partículas virais a um baixo custo. O protocolo descrito aqui fornece diretrizes para uma maneira fácil de isolar de forma confiável as partículas de EBV de uma linhagem celular relativamente acessível e quantificar as partículas usando PCR em tempo real, que é econômica e prontamente disponível para a maioria dos laboratórios. Isso ocorre em comparação com vários outros métodos que têm sido descritos para isolar o EBV de diferentes linhagens celulares17,18,19,20.

P3HR-1 é uma linhagem celular BL que cresce em suspensão e é infectada de forma latente com uma cepa de EBV tipo 2. Esta linhagem celular é produtora de EBV e pode ser induzida a produzir partículas virais. O objetivo deste manuscrito é apresentar um método que permita o isolamento de partículas de EBV da linhagem celular P3HR-1, seguido da quantificação do estoque viral que poderia ser posteriormente utilizado para modelos experimentais de EBV in vitro e in vivo .

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Protocolo

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NOTA: O EBV deve ser considerado um material potencialmente bioperigoso e, portanto, deve ser manuseado sob contenção de Nível de Biossegurança 2 ou superior. Um jaleco, bem como luvas devem ser usados. Se houver potencial para exposição a salpicos, a proteção ocular também deve ser considerada. O procedimento a seguir deve ser conduzido em um Gabinete de Segurança Biológica.

1. Contando as células P3HR1

  1. Células de centrifugação e ressuspensão
    1. Transferir a suspensão celular de uma placa de cultura de 100 mm (ou balão T-25) de uma cultura de células P3HR1 em curso com 80% de confluência para um tubo cónico de 15 ml. A densidade de semeadura das células P3HR-1 é de 1 x 106 células/mL. Manter em meio de cultura RPMI completo (79% de meio de cultura RPMI, 20% de soro fetal bovino, 1% de antibiótico Pen-Strep) a 37 °C e 5% de CO2 e passagem a cada 3-4 dias.
    2. Centrífuga por 8 min a 120 x g. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio de cultura RPMI completo e misture bem (esta solução será referida como suspensão A).
  2. Preparação da suspensão celular para contagem
    1. Preparar uma suspensão celular diluída B misturando 2 μL de suspensão celular A com 8 μL de meio de cultura. Adicionar 10 μL de azul de tripano a 0,4% à suspensão B para obter a suspensão C. Misture bem a preparação por pipetagem suave.
  3. Contagem de células usando um hemocitômetro
    1. Coloque uma tampa de vidro no hemocitômetro e carregue 10 μL de suspensão C. Coloque o hemocitômetro sob um microscópio de luz e conte o número de células que não estão manchadas de azul em cada um dos quatro quadrantes da câmara do hemocitômetro usando a objetiva do microscópio 40x (Figura 1).
    2. O azul de tripano mancha as células mortas de azul; não conte essas células, nem as células que estão tocando qualquer uma das bordas superior, inferior, direita ou esquerda de cada quadrante do hemocitômetro.
    3. Calcule a concentração de células por ml utilizando a seguinte fórmula:
      figure-protocol-1
      NOTA: O número de quadrantes contados é quatro, e 10-4 mL é o volume dos quadrados no hemocitômetro. Os quatro quadrantes que devem ser contados estão representados em verde na Figura 1. Total de células Contadas na fórmula é a soma do número de células nos quadrantes 1, 2, 3 e 4. As células representadas em azul na Figura 1 devem ser contadas, enquanto as células em vermelho não devem ser contadas, pois estão tocando as bordas superior, direita, inferior ou esquerda do quadrante.

figure-protocol-2
Figura 1: Contagem celular utilizando câmara hemocitômetro. Quatro quadrantes são contados usando um microscópio de luz; esses quadrantes são representados em verde. Total de células Contadas na fórmula indicada na etapa 1.3.3 do protocolo aqui descrito está a soma do número de células nos quadrantes 1, 2, 3 e 4. As células indicadas em azul devem ser contadas, enquanto as células em vermelho não devem ser contadas, uma vez que estão tocando as bordas superior, direita, inferior ou esquerda do quadrante Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparando a placa para a cultura

  1. Coloque um volume de suspensão celular A em um tubo cônico de 15 mL. O volume necessário depende da contagem de células. Ajustar o volume de modo que o número de células seja de aproximadamente 2,2 x 106 células para uma placa de cultura de 100 mm.
  2. Adicionar 5 ml de meio de cultura completo ao tubo e, em seguida, transferir o conteúdo do tubo para uma placa de cultura de 100 mm. Adicionar 80 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) à placa de cultura.
    NOTA: O DMSO é sensível à luz, portanto, deve ser armazenado em um recipiente resistente à luz ou coberto com um material opaco como folha de alumínio.
  3. Adicionar 350 μL de 1 mg/mL de 12-miristato de 12-miristato 13-acetato (PMA) ao tubo. A concentração final de PMA deve ser de 35 ng/mL e a de DMSO deve ser de 0,08%.
    CUIDADO: O PMA é tóxico, corrosivo e cancerígeno, portanto, deve ser manuseado com extremo cuidado. O PMA é sensível à luz, portanto, deve ser armazenado em um recipiente resistente à luz ou coberto com um material opaco como folha de alumínio.
  4. Adicionar 4,27 mL de meio de cultura para que o volume total seja de 10 mL. Misture o conteúdo do tubo inclinando-se e, em seguida, transfira o conteúdo para uma placa de cultura de 100 mm. Deixar a placa numa incubadora de cultura celular durante 5 dias a 37 °C, 5% de CO2.

3. Indução e isolamento de partículas do vírus Epstein-Barr

  1. Após 5 dias na incubadora, centrifugar o conteúdo da placa a 120 x g por 8 min para peletizar as células. Colete o sobrenadante livre de células e contendo vírus e descarte o pellet celular.
  2. Centrifugar o sobrenadante a 16.000 x g durante 90 minutos a 4 °C para peletizar as partículas do vírus. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet do vírus em 5 mL de meio de cultura.
    NOTA: A solução salina tamponada com fosfato (PBS) pode ser usada para ressuspender o pellet do vírus em vez do meio de cultura.
  3. Aliquotar a suspensão viral obtida em 20 tubos, cada um contendo 250 μL da suspensão viral. Conservar a suspensão a -80 °C.

4. Extração de DNA de partículas virais

CUIDADO: Extremo cuidado deve ser tomado ao manusear o fenol, pois é tóxico e corrosivo e tem a capacidade de causar queimaduras graves. O fenol é sensível à luz e oxida em contato com a luz ou o ar. Armazene-o em um recipiente resistente à luz ou, alternativamente, cubra o tubo de fenol com um material opaco como folha de alumínio.

  1. Separação de proteínas do DNA
    1. Adicionar 500 μL de fenol saturado de TrisCl a um dos tubos de 250 μL. Adicione 100 μL de água (para aumentar o volume da fase aquosa) e faça um vórtice bem para obter uma emulsão rosa. Centrífuga por 15 min a 9650 x g.
  2. Precipitação de DNA
    1. Recolher o sobrenadante (fase aquosa transparente) e transferi-lo para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Adicionar um equivalente a 1/10 do volume de acetato de sódio frio do sobrenadante (3 M, pH 5,2) e misturar pipetando para cima e para baixo. Adicionar 1 μL de 20 mg/ml de glicogénio e misturar por pipetagem.
      NOTA: Esta etapa é opcional, mas a adição de glicogênio aumenta a precipitação do DNA, bem como facilita a visualização do pellet de DNA.
    3. Adicione três vezes o volume de etanol frio do sobrenadante a 100%. Conservar a -80 °C durante a noite.
      NOTA: O procedimento pode ser interrompido aqui para ser retomado posteriormente. A amostra pode ser armazenada a -80 °C durante 1 h ou, em alternativa, durante a noite. O armazenamento noturno aumenta a precipitação do DNA e, portanto, é recomendado.
  3. Isolando o DNA viral
    1. No dia seguinte, centrifugar a 9650 x g durante 15 minutos a 4 °C e eliminar o sobrenadante para obter um pellet de ADN.
    2. Lave o pellet três vezes com 1 mL de etanol frio a 70%, centrifugar a 9650 x g por 15 min e descartar o sobrenadante.
    3. Seque o pellet ao ar por cerca de 10 min. Ressuscite o pellet em 10-50 μL de água destilada livre de nuclease (dependendo do tamanho do pellet de DNA).
    4. Conservar as amostras a -20 °C para processamento posterior ou a 4 °C durante a noite, a fim de assegurar a dissolução máxima do ADN, seguida de armazenamento a -20 °C. Como alternativa, prossiga diretamente com a etapa 5.

5. Verificação da concentração e pureza do ADN

  1. Depois de limpar o pedestal de um microespectrofotômetro com um delicado limpador de tarefas, carregue 1 μL da preparação do DNA.
  2. Observe a concentração do DNA na amostra. Verifique as razões de absorbância em ambos figure-protocol-3 e figure-protocol-4. O DNA absorverá a 260 nm, as proteínas a 280 nm e substâncias orgânicas, como o fenol, absorverão a 230 nm. Uma razão de 1,8-2 é considerada suficiente para a PCR em tempo real.

6. Quantificação por reação em cadeia da polimerase em tempo real

  1. Preparação das misturas de reação de PCR
    1. Coloque 5 μL de uma mistura de PCR em tempo real verde SYBR em tubos de PCR de 0,2 mL. Adicionar a cada tubo 1 μL de primer para a frente de 7,5 pmol/μL e 1 μL de primer reverso de 7,5 pmol/μL. Sequência do primer para a frente: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; sequência do primer reverso: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. O gene amplificado para determinar o número de cópias do genoma do EBV é o gene do pequeno RNA 2 do vírus Epstein-Barr (EBER-2 ).
    2. A um dos tubos, adicione 2 μL de água livre de nuclease e 1 μL de DNA viral a partir do passo 4. O volume total da mistura de reação é de 10 μL.
      NOTA: Dependendo da concentração de ADN na amostra, pode ser necessária uma etapa de diluição. O factor de diluição F deve ser anotado e será integrado na fórmula do passo 6.3.
    3. Prepare outros tubos que serão usados como padrões com números conhecidos de cópias do genoma do EBV (1000, 2000, 5000, 10.000 e 54.000 cópias).
  2. Executar as misturas de PCR começando com uma etapa inicial de ativação a 95 °C por 5 min, depois 40 ciclos a 95 °C e 58 °C (recozimento) por 15 s e 30 s, respectivamente.
  3. Gere uma curva padrão de qPCR plotando os valores de Ct dos padrões em relação ao log do número de cópias do genoma do EBV por tubo padrão. Empregando a equação de gráfico de curva padrão, derive o número de cópias do genoma do EBV no tubo de PCR contendo o DNA viral induzido. Em seguida, use a seguinte fórmula para calcular a concentração da preparação viral induzida:
    figure-protocol-5
    Onde X é o número de cópias do genoma do EBV derivadas da curva padrão e F é o fator de diluição usado para configurar o DNA utilizado por reação de PCR.

7. Verificação da actividade biológica/infecciosidade das partículas virais

  1. Transfira células BC-3 de uma placa de cultura de 100 mm com 80% de confluência para um tubo cônico de 15 mL. A densidade de semeadura das células P3HR-1 é de 1 x 106 células/mL. Manter em meio de cultura RPMI completo (79% de meio de cultura RPMI, 20% de soro fetal bovino, 1% de antibiótico Pen-Strep) a 37 °C e 5% de CO2 e passagem a cada 3-4 dias.
  2. Conte as células BC-3 da mesma forma que as células P3HR-1 foram contadas seguindo a etapa 1. Para uma placa de 96 poços, adicione 105 células BC-3 a cada poço. Use três, seis, nove ou 12 poços para garantir a significância dos resultados e minimizar os erros.
  3. Adicionar um volume de estoque viral a cada poço, dependendo da concentração da preparação viral determinada na etapa 6.3. O MOI pode variar, e a otimização deste protocolo revelará o melhor MOI para infecção (recomenda-se uma faixa de MOI de 2-50). Certifique-se de que o volume total da mistura presente em cada poço seja de 250 μL.
    1. Para determinar o volume necessário, a concentração do estoque viral deve ser conhecida e um MOI deve ser selecionado. Por exemplo, se o MOI é 2, então o número de partículas virais adicionadas deve ser o dobro do número de células. Calcular o volume V do estoque viral necessário usando a fórmula: figure-protocol-6, sendo n o número de partículas virais necessárias e C a concentração conhecida do estoque viral
  4. Incubar o conteúdo da placa de 96 poços por 5 dias. Após 5 dias, transfira o conteúdo de cada poço para um tubo de 1,5 mL.
  5. Centrifugar os tubos a 120 x g durante 8 min para separar as células do meio de cultura contendo vírus. Submeta os pellets celulares, bem como os sobrenadantes, à extração de DNA seguida de quantificação em PCR em tempo real para verificar a presença de genomas virais em cada fração, avaliando assim a infectividade das partículas virais.

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Resultados

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O objetivo deste procedimento é isolar partículas de EBV em uma suspensão com título viral conhecido, que poderia posteriormente ser usada para modelar a infecção por EBV. Assim, é de extrema importância utilizar concentrações ótimas dos diferentes reagentes para obter o maior rendimento de EBV fora do procedimento.

Um ensaio de otimização foi realizado para determinar as concentrações de PMA e DMSO que produziriam o maior número de partículas de EBV (Figura 2). U...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A produção de partículas de EBV é necessária para a compreensão da biologia deste vírus, bem como suas doenças associadas. Aqui descrevemos a produção dessas partículas a partir da linhagem celular P3HR-1. Esta linhagem celular não é a única linha produtora de EBV; de fato, as partículas de EBV também foram isoladas das células B95-821,22, bem como da linhagem celular Raji18,19. O ciclo lítico do EBV foi...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O financiamento para este trabalho foi apoiado por doações ao ER do Asmar Research Fund, do Conselho Nacional Libanês de Pesquisa Científica (L-CNRS) e do Plano de Prática Médica (MPP) da Universidade Americana de Beirute.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 mL de tubos de PCR de parede finaThermo ScientificAB0620Deve ser autoclavado antes
do uso 0,2-10 µ L Pontas de Filtro de MicrovolumeCorning4807Deve ser autoclavado antes do uso
0.5-10 µ L Pipeta BrandTech704770
10 mL Pipeta Sorológica DescartávelCorning4488
1000 µ L Ponteiras de Pipeta FiltradasQSPTF-112-1000-Q
100-1000 µ L PipetaEppendorf3123000063
100x20 mm Placas de CuturaSarstedt83.1802
10-100 µ Pipeta LBrandTech704774
Tubos Cônicos de 15 mLCorning430791
200 µ L Ponteiras de Pipeta FiltradasQSPTF-108-200-Q
20-200 µ L PipetaEppendorf3123000055
50 mL Tubos cônicosCorning430828
CFX96 Termociclador C-1000 em tempo realBio-Rad184-1000
DMSOAmresco0231
Água livre DNase/RNaseZymo ResearchW1001-1
EBER PrimersMacrogenN/APrimers personalizados
Controle de DNA EBV (Padrões)VircellMBC065
Etanol (Grau de Reagente de Laboratório)Fischer ChemicalE / 0600DF / 17
Soro Bovino FetalSigmaF9665
Fresco 21 MicroCentrifugeThermo ScientificSolução de
Qiagen158930
HemocitômetroBOECOBOE 01
Microscópio de Luz InvertidaZeissAxiovert 25
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5121
Tubo de MicrocentrífugaCostar (Corning)3621Deve ser autoclavado antes do uso
Linha Celular P3HR-1ATCCHTB-62
Penicilina-Estreptomicina SoluçãoBiowestL0022
FenolVWR20599.297
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma-AldrichP8139
Enchimento de pipetasToalhetes de precisão Thermo Scientific9501
Kimtech7552
RPMI-1640 Meio de culturaSigmaR7388
Centrífuga SL 16RThermo Scientific75004030
Acetato de SódioRiedel-de Haë n (Honeywell)25022
EspectrofotômetroDeNovixDS-11
Tris-HClSigmaT-3253
Trypan Blue SolutionSigmaT8154
Incubadora de CO2 com camisa de águaThermo Scientific4121
Glicogênio 10651805

Referências

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