Artigo de método

Fluorescence Lifetime Macro Imager para aplicações biomédicas

DOI:

10.3791/64321

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7 de abril de 2023

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1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve o uso de um novo imageador óptico rápido para a imagem macroscópica da vida útil da fotoluminescência de amostras emissoras de decaimento longo. Os procedimentos de integração, aquisição e análise das imagens são descritos, juntamente com a preparação e caracterização dos materiais sensores para a aquisição de imagens e a aplicação do imageador no estudo de amostras biológicas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho apresenta um novo imageador de vida útil de fotoluminescência projetado para mapear a concentração de oxigênio molecular (O 2) em diferentes amostras fosforescentes, desde revestimentos sensíveis ao estado sólido do tipo O 2 até amostras de tecido animal vivo coradas com sondas solúveis sensíveis ao O2. Em particular, a sonda de infravermelho próximo NanO2-IR, baseada em nanopartículas, que é excitável com um diodo emissor de luz (LED) de 625 nm e emite a 760 nm, foi usada. O sistema de imagem é baseado na câmera Timepix3 (Tpx3Cam) e no adaptador optomecânico, que também abriga um intensificador de imagem. A microscopia de imagem ao longo da vida da fosforescência (PLIM) do O2 é comumente necessária para vários estudos, mas as plataformas atuais têm limitações em sua precisão, flexibilidade geral e usabilidade.

O sistema apresentado aqui é um imager rápido e altamente sensível, que é construído sobre um sensor óptico integrado e módulo de chip de leitura, Tpx3Cam. É mostrado para produzir sinais de fosforescência de alta intensidade e valores estáveis de vida a partir de amostras de tecido intestinal corados superficialmente ou fragmentos intraluminalmente corados do intestino grosso e permite o mapeamento detalhado dos níveis de tecido O2 em cerca de 20 s ou menos. Experimentos iniciais sobre a imagem de hipóxia em tumores enxertados em animais inconscientes também são apresentados. Também descrevemos como o imageador pode ser reconfigurado para uso com materiais sensíveis ao O2 baseados em corantes Pt-porfirina usando um LED de 390 nm para a excitação e um filtro passa-banda de 650 nm para emissão. Em geral, o imageador PLIM produziu medidas quantitativas precisas dos valores de vida útil das sondas usadas e respectivos mapas bidimensionais da concentração de O2 . Também é útil para a obtenção de imagens metabólicas de modelos teciduais ex vivo e animais vivos.

Introdução

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O 2 é um dos principais parâmetros ambientais para sistemas vivos, e o conhecimento da distribuição do O 2 e sua dinâmica é importante para muitos estudos biológicos 1,2,3. A avaliação da oxigenação tecidual por meio de sondas fosforescentes 4,5,6,7,8 e PLIM 9,10,11,12,13 vem ganhando popularidade nas pesquisas biológicas e médicas 3,9,14,15,16, 17,18,19. Isso ocorre porque o PLIM, ao contrário das medidas de fluorescência ou intensidade de fosforescência, não é afetado por fatores externos, como concentração de sonda, fotobranqueamento, intensidade de excitação, alinhamento óptico, espalhamento e autofluorescência.

No entanto, as plataformas PLIM O2 atuais são limitadas por sua sensibilidade, velocidade de aquisição de imagem, precisão e usabilidade geral. A contagem de fótons únicos correlacionada ao tempo (TCSPC), combinada com um procedimento de varredura raster, é frequentemente usada em dispositivos de PLIM e fluorescência de microscopia de imagem de tempo de vida (FLIM)20,21,22. No entanto, como o PLIM requer um longo tempo de permanência de pixels (na faixa de milissegundos), o tempo de aquisição da imagem é muito maior do que o necessário para aplicações FLIM20,22,23. Outras técnicas, como câmeras CCD/CMOS fechadas, não possuem sensibilidade a fótons únicos e apresentam baixas taxas de quadros20,24,25,26. Além disso, os sistemas PLIM existentes são mais utilizados no formato microscópico, enquanto os sistemas macroscópicos são menos comuns27.

O imageador de macro PLIM28 baseado em TCSPC foi configurado para superar muitas dessas limitações. O design do imageador foi muito facilitado pelo uso de um novo adaptador optomecânico, Cricket, que tem o seguinte: i) dois adaptadores C-mount, que fornecem fácil acoplamento do módulo da câmera no lado traseiro e lente objetiva no lado frontal; ii) uma carcaça interna para um intensificador de imagem e uma tomada para este último no lado externo do Grilo; iii) um espaço interno atrás do adaptador de montagem em C frontal, onde um filtro de emissão padrão de 25 mm pode ser alojado na frente do intensificador; e iv) uma óptica de colima de luz integrada com reguladores de anel, que permitem o alinhamento/focalização óptico entre a lente e a câmera para produzir imagens nítidas no chip da câmera.

No imageador montado, o módulo da câmera é acoplado à parte traseira do adaptador Cricket, que também abriga um intensificador de imagem composto por um fotocátodo seguido por uma placa de microcanal (MCP), um amplificador e um cintilador rápido, fósforo P47. Um filtro de emissão de 760 nm ± 50 nm é instalado dentro do Cricket, e uma lente objetiva, NMV-50M11'', é conectada ao adaptador de montagem C frontal lateral. Finalmente, a lente e a câmera estão alinhadas opticamente com reguladores de anel.

O papel do intensificador é detectar fótons de entrada e convertê-los em rajadas rápidas de luz no chip da câmera, que são registradas e usadas para gerar decaimentos de emissão e imagens vitalícias. O módulo da câmera é composto por um avançado conjunto de sensores ópticos baseados em TCSPC (256 pixels x 256 pixels) e um chip de leitura de nova geração 29,30,31,32,33, que permitem a gravação simultânea do tempo de chegada (TOA) e do tempo sobre o limiar (TOT) de rajadas de fótons em cada pixel do chip de imagem com uma resolução de tempo de 1,6 ns e uma taxa de leitura de 80 Mpixel/s.

Nessa configuração, a câmera com o intensificador tem sensibilidade de fóton único. É orientado por dados e baseado no sistema de leitura rápida do detector de pixels (SPIDR)34. A resolução espacial do imageador foi previamente caracterizada com sensores planares fosforescentes O2 e uma máscara de placa de resolução. A função de resposta do instrumento (IRF) foi medida pela imagem de um sensor fluorescente planar sob as mesmas configurações usadas para todas as outras medidas. A vida útil do corante de cerca de 2,6 ns foi curta o suficiente para que ele fosse usado para a medição de IRF no modo PLIM. O imageador pode obter imagens de objetos de até 18 mm x 18 mm de tamanho com resoluções espaciais e temporais de 39,4 μm e 30,6 ns (largura total na metade do máximo), respectivamente28.

Os protocolos a seguir descrevem a montagem do macroimageador e seu posterior uso para mapeamento da concentração de O 2 em amostras biológicas coradas com a sonda de infravermelho próximo O2 previamente caracterizada, NanO2-IR35. A sonda é uma sonda de detecção de O2 brilhante, fotoestável, permeável a células, baseada no corante de platina (II) benzoporfirina (PtBP). É excitável a 625 nm, emite a 760 nm e fornece uma resposta óptica robusta ao O 2 na faixa fisiológica (0%-21% ou 0-210 μM de O2). O imageador também demonstrou caracterizar diferentes materiais sensores baseados em corantes Pt(II)-porfirina. No geral, o imageador é compacto e flexível, semelhante a uma câmera fotográfica comum. Na configuração atual, o imageador é apropriado para diferentes aplicações PLIM de campo amplo. A substituição do LED por uma fonte de laser rápida melhorará ainda mais o desempenho do imageador e poderá potencialmente permitir aplicações FLIM de nanossegundos.

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Protocolo

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Todos os procedimentos com animais foram realizados sob autorizações emitidas pela Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irlanda) de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias (2010/63/EU) e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da University College Cork.

1. Preparação da amostra

  1. Coloração com sonda de amostras de tecidos vivos ex vivo
    1. Para aplicações ex vivo , use amostras de tecido recém-isoladas de camundongos Balb/c fêmeas com 4 semanas de idade.
    2. No dia do experimento, eutanasiar um camundongo por decapitação e dissecar rapidamente fragmentos do cólon (intestino grosso), com aproximadamente 10 mm de tamanho. Lavá-los imediatamente com tampão PBS, colocar em meio DMEM suplementado com tampão Hepes 10 mM (pH 7,2) e incubar a 37 °C36.
    3. Para coloração superficial do lado seroso do intestino, transferir as amostras de tecido vivo para um mini-prato, aplicar 2 mL de DMEM completo contendo 1 mg/mL de sonda NanO2-IR para cobrir as amostras de tecido e incubar por 30 min a 37 °C.
      NOTA: As células no tecido post-mortem permanecem vivas por muitas horas em cultura. NaNO2-IR apresenta pequena citotoxicidade, de modo que todos os experimentos foram concluídos dentro de 4 h após o isolamento tecidual.
    4. Para coloração ex vivo intraluminal de tecidos profundos, transfira os pedaços do intestino para uma placa de Petri seca e remova qualquer excesso de DMEM com papel de filtro.
    5. Injetar 1 μL de DMEM contendo 1 mg/mL de NanO2-IR 35 no lúmen com uma seringa de Hamilton e incubar as amostras por15 min ou por até 4 h.
      NOTA: NaNO2-IR mostra efeitos citotóxicos menores a longo prazo; portanto, todos os experimentos devem ser concluídos dentro de 4 h após o isolamento tecidual.
  2. Preparo de tecido tumoral corado em animais vivos
    1. Para aplicações in vivo , pré-corar células CT26 por 18 h em meio sem soro contendo sonda NaNO2-IR a 0,05 mg/mL.
    2. Pegue um rato, raspe a área de injeção no flanco direito e injete com uma seringa 200 μL de uma mistura de 1 × 10 5 células não coradas e 1 × 105 células pré-coradas com NanO2-IR .
    3. Permitir o crescimento dos tumores nos camundongos, monitorando periodicamente o tamanho do tumor com paquímetro e o peso do animal37. Os animais com tumores enxertados ficam prontos para exames de imagem no sétimo dia de crescimento tumoral.
      LEGENDA: O volume tumoral foi calculado pela equação (1):
      V = (L × W 2)/2 (1)
      onde L é o diâmetro do tumor e W is o diâmetro perpendicular ao diâmetro L.
    4. Sacrificar os animais por deslocamento cervical imediatamente antes da realização do exame.

2. Configuração de imagens PLIM

  1. Pegue o adaptador Cricket e remova seu adaptador de montagem em C na parte traseira para ter acesso à caixa do intensificador no interior. Insira o intensificador de imagem MCP-125 neste compartimento e coloque o adaptador C-mount de volta.
  2. Remova o adaptador C-mount frontal do Cricket, insira o filtro de emissões de 760 nm ± 50 nm e corrija-o colocando de volta o C-mount.
  3. Conecte o módulo da câmera Tpx3Cam à parte traseira do módulo Cricket através de seu adaptador C-mount
  4. Conecte a lente à parte frontal do módulo Cricket através de seu adaptador C-mount.
  5. Monte todo o conjunto da câmera em cima da caixa preta óptica, voltada para baixo até o palco em que as amostras serão fotografadas (Figura 1).
  6. Monte o LED super brilhante de 624 nm em um poste conectado a uma protoboard dentro da caixa preta.
  7. Conecte o LED a uma fonte de alimentação e a um gerador de pulsos. Ligue o LED e concentre-o para garantir a excitação eficaz e uniforme das amostras fotografadas.
  8. Conecte a câmera a outro gerador de pulsos e sincronize os pulsos enviados para a câmera e o LED38.
  9. Usando o cabo e a tomada especiais na unidade Cricket, conecte o intensificador a uma fonte de alimentação padrão e defina o ganho para 2,7 V.
  10. Usando os recursos de foco da lente e do adaptador Cricket, foque a ótica da câmera no estágio de amostra para gerar imagens claras de amostras com bom contraste e brilho.
  11. Para uso do imageador com corantes Pt-porfirina, substitua o LED de 625 nm por um LED de 390 nm para excitação e substitua o filtro de 760 nm ± 50 nm por um filtro de 650 nm ± 50 nm no módulo Cricket.

3. Aquisição de imagens

  1. Coloque a amostra na frente da lente da câmera.
    NOTA: Use um estágio ajustável x-y-z como suporte da amostra para ajustar a posição da amostra para um bom foco.
  2. Desligue todas as luzes da sala.
  3. Ligue o software Sophy para ajustar os parâmetros operacionais, como o foco e o alinhamento da amostra.
    NOTA: O software Sophy é fornecido juntamente com a câmera para configurar os parâmetros de imagem e gravar os dados. Verifique se o software está conectado à câmera verificando o código da câmera. No entanto, foi utilizado outro programa para aquisição de dados.
  4. Em Módulos, selecione quadros infinitos e defina o modo de operação de pixel como tempo acima do limite.
  5. Em Módulos, vá para Visualizar e selecione Módulo ativo. Isso abre a janela Medpix/Timpix Frames .
  6. Nesta janela, altere a escala de cores e gire a imagem para a orientação desejada.
  7. Ligue o intensificador e inicie a gravação.
    NOTA: Use a tela de gravação do software Sophy para confirmar visualmente o alinhamento e o foco da amostra e otimizar os parâmetros de excitação do LED para gravação.
  8. Pare a gravação e feche o software Sophy.
  9. Vá para o terminal e use o software personalizado para adquirir os dados brutos no formato binário e pós-processá-los (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. No terminal, execute os seguintes comandos para registrar os dados:
      Documento Cd/SPIDR/tronco/Lançamento/
       É
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Nome do arquivo} - t {tempo de aquisição}
      Observação : ao digitar "ls", verifique a lista de arquivos no diretório atual; confirme se Tpx3daq é visto.
    2. Aguarde até que todos os quadros sejam gravados.
    3. Para processar os dados, execute os seguintes comandos no terminal:
      cd Documentos/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
      raiz
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
    4. Aguarde até que uma janela RRGui seja aberta. Selecione todas as variáveis à esquerda e Todos os Dados, Arquivo Único e Centroide à direita.
    5. Selecione o arquivo a ser processado e execute o redutor de dados.
      Observação : todos os arquivos processados aparecerão na mesma pasta que o arquivo bruto.

4. Análise dos dados

  1. Analise os dados pós-processados com um programa dedicado escrito em linguagem C que gravará os dados em um arquivo de imagem .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
  2. Abra os arquivos de imagem .ics usando o software Time Resolved Imaging disponível gratuitamente (consulte a Tabela de Materiais). Use duas funções exponenciais para ajustar os decaimentos de fosforescência.
  3. Abra os arquivos de imagem .ics ajustados com o software de análise de imagem disponível (consulte a Tabela de Materiais).
  4. Usando tabelas de pesquisa, gere imagens de vida útil de fosforescência e codifique-as em escala de pseudocores (por exemplo, cor azul para vidas curtas e vermelho para vidas longas). Use a função Medir para calcular os valores médios de tempo de vida útil para toda a imagem ou regiões de interesse específicas (ROIs).
  5. Converter os valores de vida em concentração de oxigênio usando a equação obtida a partir do ajuste da calibração do O2 da sonda36.
    OBS: A equação (2) foi utilizada para este trabalho:
    O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)

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Resultados

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Para aplicações de imagem ex vivo , fragmentos de tecido intestinal foram corados pela aplicação tópica da sonda NanO2-IR no lado seroso do tecido. Para uma coloração mais profunda, 1 μL da sonda foi injetado no lúmen. Neste último caso, a parede intestinal de 0,2-0,25 mm de espessura protegeu a sonda da câmera. Os dois processos de coloração estão demonstrados na Figura 2A.

As imagens resultantes de intensidade e PLIM estão apresentadas na

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Discussão

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Os protocolos acima fornecem uma descrição detalhada da montagem do novo imageador e seu funcionamento no modo FLIM/PLIM de microssegundos. A câmera Tpx3Cam de nova geração baseada em TCSPC, acoplada por meio do adaptador optomecânico Cricket com o intensificador de imagem, filtro de emissão e macrolente, produz um módulo óptico estável, compacto e flexível que é fácil de operar. O imageador mostrou um bom desempenho com uma variedade de diferentes amostras e tarefas analíticas, que incluíram a caracterização de materiai...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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O apoio financeiro para este trabalho da Science Foundation Ireland, subsídios SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 e 18/SP/3522, e Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) é reconhecido com gratidão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Peças de LED de 627 nmExpressPode ser substituído por LED diferente com base no comprimento de onda de excitação do sensor. LED de 390 nm usado para corantes de Pt-porfirina.
Filtro de emissão de 760 ± 50 nmEdmund Optics84-788Pode ser substituído por um filtro diferente com base no comprimento de onda de emissão do sensor. Usado 650 ± Filtro passa-banda de 50 nm para corantes de Pt-porfirina.
Camundongos Balb/cEnvigo, UKBalb/c
Caixa pretaThorlabsXE25C9/M
PhotonisCricket-2
células CT26 ATCCCT26. WThttps://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEMSigma-AldrichD0697Outras mídias também podem ser usadas
Software ImageJgratuito de análise de imagens. Pode ser baixado de: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
intensificador de imagem MCP-125 com tela de fósforo P47PhotonisPP0360EF
Mini pratosSarstedt83.3900.30035 mm de diâmetro 
Filme plástico de Mylar, 75 micron RS Irlanda785-0795Outros substratos plásticos também podem ser usados
NanO2-IRcaseiron/aA sonda pode ser sintetizada de acordo com o método publicado 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. Imagem in vivo da atividade do metabolismo cerebral usando uma sonda sensível ao oxigênio fosforescente. J Métodos Neurosci. 15 de junho de 2013; 216(2):146-51. DOI: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 25 de abril. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' ou fornecido pelo nosso laboratório. 
Lente NMV-50M11" 50 mmNavitarOutras lentes compatíveis com adaptadores de montagem em C podem ser usadas
Placa de ensaio ópticaThorlabsMB1836
Placas de PetriSarstedt82.1472.00192 mm de diâmetro
Fonte de alimentaçãoTenma72-10495
Gerador de pulsosTenmaTGP110
SophyInstrumentos Científicos de Amsterdãn/zFornecido pela ASI junto com o Tpx3Cam
Tpx3CamInstrumentos Científicos de AmsterdãSoftware TPXCAM
Tri2Universidade de Oxfordn/aSoftware de Imagem Resolvida por Tempo Livre, pode ser baixado em: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
Estágio de Tradução XYZThorlabsLT3
Adaptador de críquete Software

Referências

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