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Entrar em contato com a Hipersensibilidade como modelo murino de dermatite de contato alérgico

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DOI:

10.3791/64329

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26 de setembro de 2022

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1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

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Resumo

A hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de murina de dermatite de contato alérgico (ACD). O CHS baseia-se na sensibilização com hapten reativo pintando a pele raspada do peito e abdômen, com um subsequente desafio da pele do ouvido com um hapten diluído, causando uma reação de inchaço que é avaliada de várias maneiras.

Resumo

A hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de dermatite de contato alérgico (ACD) que pode ser estudado em camundongos. Este estudo tem como objetivo apresentar um método laboratorial objetivo que possa ajudar a estudar a reação do CHS em camundongos, que pode ser medido e quantificado por vários testes. Para induzir o CHS, no dia "0", os camundongos foram sensibilizados em um local previamente raspado por pintura de pele abdominal com a mistura hapten 2,4,6-trinitrcloobenzeno (TNCB) em uma mistura acetona-etanol, enquanto os ratos de controle negativo foram falsos sensibilizados com a mistura veículo sozinho-acetona-etanol. No dia "4", a espessura da orelha da linha de base foi medida com um micrômetro antes da obtenção de CHS (desafio) pintando ambas as orelhas com TNCB diluído tanto nos grupos de teste quanto de controle. Após 24h, o inchaço da orelha foi medido com um micrômetro. O CHS é um exemplo de resposta imune mediada por células T que causa inchaço no tecido inflamado, atingindo 24 h após o desafio da pele com o mesmo hapten. Aumento do edema de ouvido correlacionado com aumento do peso do ouvido, atividade mieloperoxidase (MPO), concentração pró-inflamatório de citocina nos extratos de ouvido, aumento do espessamento do edematoso no exame histológico e permeabilidade vascular do ouvido. Houve também um aumento na concentração de anticorpos IgG1 específicos do TNP na sera do grupo de teste quando comparado com os camundongos de controle. Além disso, o CHS pode ser transferido com sucesso com as células efeito CHS obtidas de doadores previamente sensibilizados com tncb. As células com efeito CHS foram administradas por via intravenosa em camundongos receptores ingênuos, que foram posteriormente desafiados com o mesmo hapten diluído. O inchaço da orelha foi medido com um micrômetro 24 h depois.

Introdução

A dermatite de contato alérgica (ACD) é uma doença inflamatória da pele comum em países industrializados causada por uma reação de hipersensibilidade tipo IV resultante da exposição a produtos químicos de baixo peso molecular chamados haptens. As substâncias que causam sensibilização de contato em humanos incluem íons de metal pesado (cromo, níquel, ferro, cobalto), terebintina, fragrâncias, corantes e conservantes presentes em cosméticos (por exemplo, p-fenilediamina), algumas drogas (por exemplo, neomicina, benzocaína), antibióticos β-lactam (ou seja, penicilina), produtos químicos produzidos por plantas (pentadecacatechol, substância presente na hera venenosa), bem como hidroquinona utilizada na indústria fotográfica 1,2 . Os agentes etiológicos ACD são muito altos, pois mais de 100.000 produtos químicos são usados apenas na indústria, e 2.000 novos são sintetizados a cada ano. Até o momento, mais de 3.700 moléculas foram identificadas que podem ser contato haptens/alergênicos3. A reação de hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de ACD que pode ser estudado em camundongos, cobaias e ratos e pode ser induzido pela aplicação da pele tópica de haptens químicos reativos dissolvidos em solventes orgânicos 4,5,6. Este estudo tem como objetivo descrever um método de laboratório objetivo que pode ajudar a estudar a reação do CHS em camundongos, que pode ser medido e quantificado por vários testes.

O CHS consiste em fases de sensibilização (indução) e efeito (desafio). Em modelos animais, os haptens primeiro se ligam covalentemente às proteínas do corpo para criar neoantígenos. Durante a fase de sensibilização, os queratinócitos ativados promovem a migração e a maturação das células dendríticas da pele (SDCs) produzindo o fator de necrose pró-inflamatório citocinas-tumora α (TNF-α) e interleucina 1β (IL-1β)7. As células epidérmicas langerhans (LCs) apresentam antígenos durante as fases 8 de indução e efeito do efetordo CHS. As LCs expostas ao hapten durante a sensibilização promovem a indução tanto das células regulatórias quanto das células9. Evidências crescentes de vários estudos sugerem que as respostas do CHS podem ser mediadas por células Th1 da classe 2 do CD4+ MHC, liberando localmente interferon-γ (IFN-γ) para empregar um infiltrado inflamatório característico, linfócitos Tc1 classe I restritos cd8+ que também podem liberar ifn-γ mas principalmente mediar danos citotóxicos para queratinócitos, e agora também interleucina 17 (IL-17)-produzindo células Th1710, 11 anos.

Vários modelos chs diferentes que empregam várias espécies1 2,13,14 e haptens foram desenvolvidos (uma comparação detalhada de diferentes haptens, solventes e tempo de aplicação é resumida na Tabela 1). O camundongo, uma espécie de laboratório frequentemente utilizada, oferece algumas vantagens no estudo do CHS. Há mais cepas, nocautes (KO) e animais transgênicos entre camundongos em comparação com outras espécies, o que os torna um animal muito atraente15. Além disso, o modelo CHS requer muitos animais, e os ratos são mais econômicos aqui. Modelos animais não imitam ACD em todos os aspectos; em particular, eles mostram crostas e desquamation, o que não é comum para humanos16,17. As características da doença crônica são desafiadoras para se reproduzir, principalmente porque o modelo descrito não assume a aplicação do hapten por um longo período de tempo. No entanto, foi confirmado aqui que muitos dos aspectos significativos da ACD são reproduzidos. Também foi demonstrado que, como em humanos, essas características estão associadas a reações alérgicas locais. A escolha do hapten, seu solvente e sua aplicação delineada neste protocolo foram ditadas pelo fato de que os resultados foram confirmados por inúmeros testes in vitro e que foi testado e modificado em laboratório por muitos anos até que a versão atual fosse estabelecida. Os modelos murinos permitem a análise dos subconjuntos celulares ou citocinas que estão envolvidos no desenvolvimento da ACD e são essenciais para avaliações pré-clínicas de novos tratamentos.

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Protocolo

Todos os experimentos apresentados neste artigo foram realizados de acordo com as diretrizes do 1º Comitê De Ética Local em Testes em Animais em Cracóvia. Todos os procedimentos descritos foram realizados de acordo com as recomendações locais, especialmente no que se refere ao uso de cetamina/xilazina como anestésico, utilizando ambos os lados das orelhas para aplicar a substância/hapten, cortando a orelha e coletando sangue por remoção do globo ocular. FORAM utilizados para o presente estudo os camundongos machos e fêmeas BALB/c (haplotype H-2d), CBA/J (H-2k) e C57BL/6 (H-2b), com idade entre 6 e 12 semanas. Para significância estatística, é melhor que cada grupo de camundongos seja composto por 10-12 animais.

1. Preparação animal

  1. Limpe a mesa de operação com uma solução de 70% de etanol antes e depois de todos os procedimentos. Se usar camundongos que requerem condições estéreis, realize todas as operações em um armário de biossegurança.

2. Marcando ratos para identificação

  1. Rotule os ratos raspando a pele com uma lâmina de barbear: #0 - sem marcação, #2 - na pata dianteira direita, #3 - no lado direito, #4 - na pata traseira direita, #5 - na base da cauda, #6 - na pata traseira esquerda, #7 - no lado esquerdo, #8 - na pata dianteira esquerda.
    NOTA: Devido à reação induzida, os ratos não podem ser marcados classicamente por socos ou marcações de ouvido. Os ratos não foram anestesiados durante a rotulagem.

3. Indução de CHS

NOTA: Este procedimento é retratado na Figura 1.

  1. Realize a sensibilização (indução) seguindo as etapas abaixo.
    1. No dia "0", raspe os ratos no peito e abdômen (quadrado 2 cm x 2 cm) aplicando sabão cinza com água e raspando com uma lâmina de barbear.
      NOTA: Antes de aplicar hapten, espere 6h para que a pele não fique irritada.
    2. Prepare 5% hapten: 2,4,6-trinitrochlorobenzeno (TNCB, ver Tabela de Materiais) em uma mistura acetona-etanol (razão 1:3) ou somente veículo (acetona-etanol). Prepare soluções pouco antes do uso em um frasco de vidro e proteja-o da luz cobrindo o frasco com papel alumínio.
    3. No mesmo dia, sensibilize os camundongos aplicando 150 μL de 5% hapten no local previamente raspado. No grupo de camundongos de controle, aplique o veículo sozinho para avaliar a reação inflamatória não específica. Antes de colocar o animal de volta na gaiola, espere por 30 s, deixando o hapten secar.
      ATENÇÃO: Use luvas; TNCB causa uma reação alérgica grave na maioria das pessoas.
  2. Realizar a medição de provocação (desafio) e inchaço do ouvido.
    1. No dia "4", prepare-se 0,4% hapten: TNCB em uma mistura acetona-etanol (razão 1:1). Prepare a solução pouco antes de usar em um frasco de vidro e proteja-a da luz cobrindo o frasco com papel alumínio.
    2. Anestesiar os camundongos com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (90-120 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) para anestesia profunda. Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado por pelo menos 5 minutos por beliscão do dedo do dedo do dedo.
    3. Meça a espessura da orelha (medição de 0h, linha de base) com um micrômetro (ver Tabela de Materiais) por um observador desconhecendo os grupos experimentais.
    4. Aplique 10 μL de 0,4% hapten em ambos os lados das orelhas em ambos os grupos (teste e controle). Antes de colocar o animal de volta na gaiola, espere por 30 s e deixe o hapten secar.
    5. No dia "5", 24 h após a aplicação do hapten, repita as etapas 3.2.2-3.2.3 para a medição de 24 horas.
    6. Avalie a resposta do CHS calculando a diferença na espessura da aurícula antes e depois do desafio com o hapten: 24 h de espessura da orelha (μm) - 0 h de espessura da orelha (μm). Conte cada orelha como uma medida separada. Em seguida, expresse o inchaço do ouvido em micrômetros (μm) ± erro padrão da média (SEM) (Tabela 2, Figura 3).

4. Biópsias de ouvido

  1. Logo após a medição de 24 horas da espessura da orelha (quando o rato ainda estiver sob anestesia profunda), corte as orelhas o mais perto possível do crânio com uma tesoura. Colete as biópsias do lado distal das orelhas fazendo um soco de 6 mm de diâmetro usando um soco de biópsia (ver Tabela de Materiais).
    1. Meça o peso do ouvido (etapa 4.2) e, adicionalmente, realize um dos seguintes testes na mesma biópsia de ouvido: ensaio mieloperoxidase (MPO) (etapa 4.3) ou medição in vitro da concentração de citocina nos extratos auriculares (por exemplo, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [passo 4.4]).
      NOTA: Corte as orelhas antes da coleta de sangue. Após este procedimento, os camundongos devem ser eutanizados (por exemplo, por luxação cervical).
  2. Meça o peso de cada biópsia de ouvido no equilíbrio analítico e expresse-o em miligramas (mg) (Figura 4).
  3. Realize um ensaio mpo seguindo as etapas abaixo.
    1. Prepare o tampão de homogeneização dissolvendo 0,5% de brometo de hexadecilto de etilaamônio em 50 mm de tampão de fosfora DE50mmol KH 2 PO4/Na2HPO4 e ajustando o pH para 6.0 (uso à temperatura ambiente, RT).
    2. Homogeneize as biópsias em tubos de microcentrifusagem de 2 mL com 500 μL de tampão preparado por 10 minutos usando um homogeneizador com contas de aço inoxidável de 5 mm de diâmetro (adicione duas contas/frasco) (ver Tabela de Materiais). Em seguida, esfrie a amostra por 15 minutos a 4 °C e homogeneize-a por mais 10 minutos.
      NOTA: Os tubos de microcentrifuuge têm um fundo redondo para que as contas possam se mover facilmente.
    3. Congele os homogeneizadores a −20 °C por 30 min. Degelo e vórtice (certifique-se de que as amostras estão descongeladas). Repita este procedimento 3x.
    4. Centrifugar os homogeneiza em 3.000 x g para 30 min a 4 °C. Colhe os supernantes com uma pipeta. Expresse a atividade de MPO em unidades (U) por 1 mg de proteína.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras estão estáveis a -20 °C durante 3 meses.
    5. Para medir a atividade de MPO, realize uma reação enzimática misturando 20 μL de supernante e 200 μL de substrato MPO (0,167 mg/mL de orto-dianisine di hipodroclodo em 50 mmol de KH2PO4/Na2HPO4 tampão com 5 x 10-4% H202) e adicione em placas de fundo plano de 96 poços. Incubar as placas por 20 minutos na RT.
    6. Prepare a curva padrão utilizando 20 μL do padrão MPO em concentrações de 0,008 U até 0,5 U em 200 μL do substrato MPO. Prepare a amostra em branco apenas com o substrato MPO.
      ATENÇÃO: Use uma máscara enquanto trabalha com dihidroclodo orto-dianisine.
      NOTA: As placas devem ser feitas de polipropileno, que tem uma menor capacidade de ligação para que proteínas ou DNA não se liguem.
    7. Meça a densidade óptica (OD) em um comprimento de onda de λ = 460 nm. A reação enzimática é estável por 10 minutos. Leia a atividade de MPO em amostras testadas da curva padrão.
    8. Para medir a concentração proteica, utilize 20 μL do supernante, realize um teste com um kit de ácido bicinchonínico para determinação proteica (ver Tabela de Materiais) e meça o OD em λ = 562 nm (Figura 5).
  4. Realizar medição in vitro de citocinas no extrato auditivo.
    1. Homogeneize as biópsias de ouvido em RT em tubos de microcentrifus de 2 mL com 500 μL de reagente de extração de proteína tecidual (T-PER) por 10 minutos usando um homogeneizador com contas de aço inoxidável de 5 mm de diâmetro (adicione duas contas/frasco). Em seguida, esfrie a amostra por 15 minutos a 4 °C e homogeneize-a por mais 10 minutos.
      NOTA: Os tubos de microcentrifuuge têm um fundo redondo para que as contas possam se mover facilmente.
    2. Centrifugar os homogeneiza em 3.000 x g para 30 min a 4 °C.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras estão estáveis a -80 °C durante 6 meses.
    3. Avalie os níveis de citocinas utilizando um conjunto ELISA disponível comercialmente (por exemplo, IFN-γ) (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante (Figura 6).

5. Histologia do tecido auditivo

  1. Logo após a medição de 24h da espessura da orelha, quando o rato ainda estiver profundamente anestesiado, corte as orelhas o mais perto possível do crânio com a tesoura (passo 4.1).
    NOTA: Após este procedimento, os camundongos devem ser eutanizados (por exemplo, por luxação cervical).
  2. Realize a incorporação de parafinas dos blocos de tecido seguindo as etapas abaixo.
    1. Logo após a remoção, coloque o ouvido em ~10 mL de 10% de formalina por 24 h.
    2. Coloque as orelhas em uma fita de processamento de tecido. Coloque os em um processador automatizado (ver Tabela de Materiais) para ciclos de desidratação (álcool 70%, 90%, 100%, 30 min cada na RT), ciclos de limpeza (xileno 3x, 30 min cada na RT) e ciclos de infiltração de cera (parafina 3x, 30 min cada a 56 °C).
    3. Remova as fitas do processador automatizado e segure a placa de aquecimento até que seja necessário. Encha o molde de cera com cera quente (do dispensador).
    4. Remova as seções do com fórceps aquecidos e coloque-as no molde; em seguida, coloque a base de na parte superior do molde e, em seguida, encha com mais cera. Coloque-o em água gelada em uma placa fria por 30 minutos para que a parafina se solidifique para formar um bloco contendo o espécime.
    5. Use um microtome rotativo (ver Tabela de Materiais) para cortar seções de ~5 μm de espessura. Flutue as seções em um banho quente para achatá-las. Pegue as seções em um deslizamento de microscópio de vidro. Deixe-os secar em RT para garantir que as seções aderam ao slide.
      NOTA: Use lâminas que eliminem a necessidade de aplicar materiais adesivos ou revestimentos proteicos para evitar a perda de seções teciduais durante a coloração.
  3. Realizar hematoxilina e eosina (H&E) coloração.
    1. Prepare 17 pratos de coloração com os seguintes: xileno (quatro pratos), 100% etanol (álcool absoluto) (quatro pratos), 90% etanol, 80% etanol, 70% etanol, 50% etanol, PBS (três pratos), solução de hematoxylina, solução de eosina. Transfira os slides de um prato para o outro de acordo com as etapas abaixo e execute tudo no RT.
      NOTA: O procedimento em cada prato pode ser repetido aproximadamente 10x (por exemplo, se um prato de 20 slides for usado, 200 manchas podem ser feitas sem alterar os fluidos).
    2. Desparafinar as seções por incubação a 65 °C por 30 min na incubadora. Mergulhe os slides em xileno por 30 minutos. Repita 1x em novo xileno por 30 min.
    3. Mergulhe os slides em 100% etanol por 5 min. Repita 1x em novo 100% etanol por 5 min. Mergulhe os slides na linha do etanol, 90%, 80%, 70% e 50%, por 2 minutos em cada diluição.
    4. Mergulhe os slides em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) por 5 min. Limpe o excesso de líquido ao redor do tecido e parte de trás das lâminas.
    5. Manche as seções na solução de hematoxilina (ver Tabela de Materiais) por 7-8 min. Lave em água corrente por 30 s do lado inverso para não danificar as seções. Repita o passo 5.3.4.
    6. Colorique as seções com solução de eosin (ver Tabela de Materiais) para 30 s. Lave como mencionado na etapa 5.3.5 e, em seguida, repita o passo 5.3.4.
    7. Mergulhe os slides em 100 % de etanol (álcool absoluto) por 2 min. Repita 1x em novo 100% etanol por 2 min.
    8. Mergulhe os slides em xileno por 5 minutos. Repita 1x em novo xileno por 5 min.
    9. Deixe as seções secarem por 15 minutos no RT. Adicione uma gota de meio de montagem (ver Tabela de Materiais) em um deslizamento de tampa e, em seguida, coloque-o na parte superior da seção.
  4. Examine a seção sob um microscópio leve sob uma ampliação de 20x ou 40x, e capture imagens (Figura 7).

6. Teste de permeabilidade vascular

NOTA: Alternadamente para a medição da espessura da orelha, um teste de permeabilidade vascular pode ser realizado.

  1. Sensibilize os camundongos no dia "0" (etapas 3.1.1-3.1.3), e depois, no dia "4", anestesia os camundongos (passo 3.2.2) e aplique diretamente hapten nas orelhas (passo 3.2.4), omitindo a medição de ouvido de 0h.
  2. Às 23h após o desafio, anestesia os ratos (passo 3.2.2).
  3. Injete por via intravenosa (i.v.) 8,3 μL/g de peso corporal de 1% de corante azul Evans (ver Tabela de Materiais) em Salina Tamponada de Fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  4. Anestesiar os camundongos novamente profunda (passo 3.2.2)-1 h após a injeção azul de Evans.
  5. Coletar biópsias de ouvido (etapa 4.1).
    NOTA: Após este procedimento, os camundongos devem ser eutanizados (por exemplo, por luxação cervical).
  6. Extrair o corante do tecido, colocar socos de ouvido nos tubos contendo 1 mL de formamide e incubar a 37 °C na atmosfera de 5% de CO2 por 18 h.
  7. Centrifugar as biópsias a 3.000 x g por 3 min na RT. Colete os supernantes com uma pipeta.
  8. Meça o OD em um comprimento de onda de λ = 565 nm em placas de fundo plano de 96 poços contra um vazio contendo formamida. A cor é estável por 24 h. Leia a concentração das amostras de teste da curva padrão (use as concentrações de azul Evans variando de 0,2-30 μg de corante/mL formamide) (Figura 8).
    NOTA: As placas devem ser feitas de polipropileno, que tem uma menor capacidade de ligação para que proteínas ou DNA não se liguem.

7. Coleta de soro e imunoglobulina anti-TNP (IgG1) medição de anticorpos

  1. Depois de coletar biópsias de ouvido (etapa 4.1), quando o rato ainda estiver sob anestesia profunda, remova o globo ocular com pinças, coloque pressão suave sobre o rato e colete sangue do seio retro-orbital no tubo (frasco com gel para obtenção de soro, consulte Tabela de Materiais). Um método alternativo de coleta de sangue pode ser perfurar o coração com uma seringa e coletar o sangue.
    NOTA: O sangue deve ser coletado após a remoção das orelhas. O mesmo método de sangramento deve ser utilizado em todo um estudo devido a possíveis diferenças nos parâmetrossanguíneos 18. Após este procedimento, os camundongos devem ser eutanizados (por exemplo, por luxação cervical).
  2. Inverta um mínimo de 6x, espere 30 min para o sangue coagular e, em seguida, centrífugas em 1.300-2.000 x g por 10 minutos na RT.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. A amostra está estável a -20 °C durante 6 meses.
  3. Cubra uma placa de fundo plano de 96 poços com 50 μL de albumina de soro bovino conjugada com 2,4,6-trinitrophenyl (TNP-BSA) dissolvida em DPBS na concertação de 10 μg/mL. Em seguida, cubra a segunda placa com albumina de soro bovino (BSA) isoladamente dissolvida em DPBS (fundo) a uma concentração de 10 μg/mL. Incubar durante a noite a 4 °C.
    NOTA: O soro do rato contém anticorpos (Abs) contra bsa, por isso as amostras precisam ser testadas em ambas as placas, e em seguida, um cálculo deve ser feito (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Lave as placas com 300 μL de DPBS contendo 0,05% Tween 20. Repita 3x.
  5. Prepare o dilatente do ensaio (AD): DPBS contendo 1% de BSA. Bloqueie os poços com AD por 1h no RT. Lave novamente (passo 7.4).
  6. Preparar um padrão interno (iSTD): sensibilizar os camundongos com TNCB (etapas 3.1.1-3.1.3) e, 10 dias após a sensibilização, coletar e votar o soro de todos os doadores (etapa 7.1 e passo 7.2).
  7. Adicione à placa 50 μL de concentrações classificadas de iSTD diluídas com AD para fazer a curva padrão (descrita na Tabela 3). Adicione à placa 50 μL de amostras de soro. Teste cada amostra e curva padrão em ambas as placas (revestidas de TNP-BSA e BSA). Incubar por 2 h na RT. Lave as placas (etapa 7.4).
  8. Adicionar 50 μL de anticorpo monoclonal anti-rato IgG1 biotinilado (mAb, ver Tabela de Materiais) diluído 1:250 com AD e incubar por 1h no RT. Lave novamente (passo 7.4).
  9. Adicione 50 μL de rabanete peroxidase streptavidin (HRD streptavidin, ver Tabela de Materiais) diluído 1:2000 com D.C., e incubar por 30 minutos no RT no escuro. Lave a placa (passo 7.4).
  10. Adicione 50 μL de substrato TMB (ver Tabela de Materiais) e incubar por 30 min no RT no escuro.
  11. Pare a reação enzimática adicionando 25 μL de 1 M H2SO4; a reação é estável por 30 minutos.
  12. Meça o OD em um comprimento de onda de λ = 450 nm e um fundo de 570 nm (o fundo deve ser subtraído a cada medição de 450 nm). Ao apresentar os resultados, subtraia as medidas de BSA do TNP-BSA para amostras e a curva padrão. Em seguida, calcule a unidade (U) de anticorpos de acordo com a curva padrão (Figura 9).

8. Transferência adotiva das células com efeito CHS

NOTA: Este procedimento é retratado na Figura 2.

  1. Doadores (na proporção de um doador:1 receptor): sensibilizar camundongos com TNCB no dia "0" (etapas 3.1.1-3.1.3).
  2. No dia "4", anestesia a anestesia profunda dos ratos (passo 3.2.2).
  3. Isole com fórceps os linfonodos axilares e inguinais (ALNs) e baços (SPLs). Juntar as ALNs em um frasco e as SPLs em outro.
    NOTA: Há um linfonodo axilar atrás do músculo peitoral em cada axila. Um linfonodo inguinal na região do quadril está situado ao lado de três vasos sanguíneos. O baço está localizado no lado esquerdo do corpo atrás do intestino e estômago19. Trabalhe com ferramentas estéreis em um armário de biossegurança para manter condições estéreis. Após este procedimento, os camundongos devem ser eutanizados (por exemplo, por luxação cervical).
  4. Mash tecido entre as extremidades foscos de dois slides microscópio. Passe a suspensão da célula através de um coador de células com um tamanho de poros de 70 μm (ver Tabela de Materiais).
  5. Lave as células com DPBS suplementadas com 1% de soro bovino fetal (FBS). Centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C. Decante o supernatante e resuspenda a pelota de célula restante em 1-5,0 mL de DPBS.
  6. Conte as células vivas usando um hemocitômetro20 com azul Trypan, e misture 10 μL da suspensão celular com 90-990 μL (dependendo do número celular) do azul Trypan. Leve em conta a diluição ao calcular o número da célula (10x-100x).
  7. Prepare uma mistura de ALNs e SPLs (razão 1:1): 8,0 x 106 até 7,0 x 107/mouse em 200 μL de DPBS.
  8. Receptores (camundongos síndicos ingênuos): anestesiam camundongos ingênuos (passo 3.2.2) e injetam i.v. com uma mistura preparada das células com efeito CHS (passo 8.7). No grupo controle de camundongos, não injete nenhuma célula.
  9. Meça a espessura da orelha antes (0h) e depois (24h) o desafio (etapas 3.2.1-3.2.6) (Figura 10).
  10. Além disso, realize testes em células isoladas de efeito CHS (por exemplo, fenotipagem celular ou a medição de citocinas produzidas pelas células efeito CHS por citometria de fluxo). Culturas celulares também podem ser estabelecidas, e a capacidade das células com efeito CHS de proliferar na presença do antígeno ou da quantidade de citocinas secretadas na cultura sobrenatantes pode ser avaliada21,22 (dados não apresentados).
    NOTA: A realização de testes adicionais requer correspondentemente mais doadores de células.

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Resultados

Para indução de CHS, os animais foram sensibilizados através da pintura da pele (abdominal) com 150 μL de 5% de TNCB ou farsa sensibilizada apenas com o veículo. No dia "4", as respostas de inchaço de ouvido de ambas as orelhas foram induzidas pela pintura de contato (desafio) com 10 μL de 0,4% de TNCB em ambos os camundongos anteriormente em contato sensibilizado com tncb (grupo de teste) e os ratos do grupo controle (falsos sensibilizados). Os dados apresentados descrevem que os camundongos sensibilizados com ...

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Discussão

O CHS é induzido através de haptens, que se ligam a antígenos auto-proteína na pele, criando neoantígenos. O CHS é mediado pelo recrutamento extravascular local de células T com efeito de antígeno circulante, o que resulta em inchaço no tecido desafiado, atingindo 24 h após a exposição da pele secundária ao mesmo hapten6. O inchaço do tecido é causado principalmente pela infiltração de leucócitos e deposição de fibrina dependente de leucócitos24. Essas alterações p...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela subvenção SUBZ. A020.22.060 da Universidade Médica de Wroclaw, Polônia, e por subvenções do Ministério da Ciência e Educação Superior N401 545940 para MS e IP2012 0443 72 para MMS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Etanol 70%Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha65350-Mpara desinfecção
de superfície Placas de fundo plano de 96 poços, polipropilenoGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Áustria655101para MPO e medição azul de Evans - as placas devem ser feitas de polipropileno, que tem uma capacidade de ligação menor, de modo que proteínas ou DNA não se liguem
acetona (reagente ACS, etc; 99,5%)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha179124
Folha de alumínioMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaZ185140
Balança analíticaSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, AlemanhaPRACTUM224-1s, 29105177
Processador automatizado de tecidosMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, ÍndiaMTP-E-212preparar automaticamente amostras de tecido fixando, desidratando, limpando e infiltrando-as com parafina
BD Vacutainer SST II Advance (tubo com gel para obtenção de soro)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, EUABD
Kit de ácido bicinchonínico para determinação de proteínasMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaBCA1-1KT
Biotina Rato Anti-Rato IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, EUA553441
BSA (albumina de soro bovino)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaA9418, filtro de células de 2 mg/mL
, tamanho dos poros 70 μ mBIOLOGIX, China15-1070adequado para tubos de 50 mL
CoverslipVWR, Radnor, Pensilvânia, Estados Unidos631-158324 mm, mas é possível usar tamanhos diferentes
Capacidade de pipetas descartáveis: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′ s solução salina tamponada com fosfato)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, EUA14190144 sem cálcio, sem magnésio, cultura de células de mamíferos
DPX Mountant para histologiaMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha6522meios de montagem para HE, pode ser usado algum outro, por exemplo, bálsamo do Canadá
Pinças Dumont 5 - retasAnimalab, Poznan, Polônia11251-10FSTinstrumentos cirúrgicos para procedimentos em camundongos (devem ser esterilizados)
Pinças Dumont 7 - dobradasAnimalab, Poznan, Polônia11272-50FSTinstrumentos cirúrgicos para procedimentos em camundongos (devem ser esterilizados)
Solução de eosina Y, alcoólicaMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 mLEppenforf, Alemanha3,01,20,086polipropileno
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2,0 mLEppenforf, Alemanha3,01,20,094polipropileno, fundo redondo (os grânulos de homogeneização podem se mover facilmente)
Etanol 100% (álcool absoluto)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.07017
Etanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaE2129
FBS (soro bovino fetal)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA
Solução de formalina, tamponada neutra, 10%Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaHT501128
Formamida 99,5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaF7503
Freezer -20 ° CBosch, AlemanhaGSN54AW30
Frigorífico +4 ° C / freezer -20 & CBosch, AlemanhaKGV36V10de células de mamíferos, qualificado, Brasil, 10 x 50 mL
Lâminas de microskope de vidro, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pensilvânia, Estados Unidos631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Lâminas que eliminam a necessidade de aplicar materiais adesivos ou revestimentos de proteínas, para evitar a perda de seções de tecido durante a coloração.
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Sabonete cinzaPollena Ostrzeszó w, Produtor Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PolôniaSabonete em barra cinza Bialy jelenSabonete em barra Natural Hipoalergênico. Produto disponível para o público em geral
H2SO4 (ácido sulfúrico) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.60313
Solução de hematoxilina HarrisMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaHHS16
VWR, Avantor, EUA612-5719câmara de contagem manual, que é mais precisa
Brometo de hexadeciltrimetilamônioMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaH5882
HomogeneizadorQIAGEN Hilden, AlemanhaTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234homogeneizador com esferas de aço inoxidável (diâmetro 5 mm) para tubos de centrífuga de 2 mL
Peroxidase de rábano estreptavidina (HRP estreptavidina)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUASA-5004-1
Solução de peróxido de hidrogênio (H202)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaH1009
Incubadora Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Alemanha4107106837 oC na atmosfera de 5% CO2 e 65 0C para desparafinização das seções para histologia
Cetamina 100 mg/mL, solução injetávelBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polóniacat.# não disponível
KH2PO4 (di-hidrogenofosfato de potássio) 99,995% de base anidraMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.05108
Centrífuga de laboratórioHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, AlemanhaB00013899velocidade de 300 x g, com arrefecimento a 4 0C
Centrífuga de laboratórioHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Alemanha75002425velocidade de 3.000 x g, com resfriamento a 4 0C
Mask (FFP2)VWR, Radnor, Pensilvânia, Estados Unidos111-0917para trabalhar com camundongos dicloridrato de ortodianisina
Unidade de melhoramento da Cátedra de Ciências Biomédicas, Faculdade de Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina da Universidade Jaguelônica, Cracóvia, PolôniaCBA/J, C57BL/6
MicrômetroMitutoyo, Tóquio, Japão193-111dígitos Micrômetro Externo, Parada de Catraca, Alcance 0-25mm, Graduação 0.001mm, Precisão +/-0.002mm, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplaca, 96 poços, microlon, alta ligação (para teste ELISA)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Áustria655061com superfícies de ligação maxi-sorp para resultados confiáveis e reprodutíveis em ensaios colormétricos
Microscópio com objetivasLeica Microsystems CMS GmbH, AlemanhaDM1000, 294011-082007A histologia apresentada no artigo foi realizada sob o ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, com objetivos: FL 20X LWDPH, 0,40NA/3,1WD e FL 40X LWDPH 0,65NA/1,79WD
Mieloperoxidase de leucócitos humanos (padrão MPO)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (fosfato de sódio dibásico heptahidratado)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaS9390
AzeiteMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha75343rato OptEIA puro
e natural IFN-&gama; Conjunto ELISABecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, EUA555138
Cloridrato de ortodianisinaMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaD3252
Cera de parafinaMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha76242contas, PBS sólido ceroso
(solução salina tamponada com fosfato)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, EUA20012027pH 7,2, medidor de ph para cultura de células de mamíferos
Elmetron, PolôniaCP-401
Pipetas, volume variável com ponteirasMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaEP3123000900-1EA3-pack, Opção 1, 0,5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, inclui epT.I.P.S.
Lâmina de barbearVWR, Radnor, Pensilvânia, Estados UnidosPERS94-0462lâminas raspadoras e cortadoras, borda única, lombada de alumínio, 100 lâminas por caixa, embaladas individualmente
Micrótomo rotativoMRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UKHIS-202A
Tesoura - reta, afiada / afiadaAnimalab, Poznan, Polônia14060-10FSTInstrumentos cirúrgicos para procedimentos em camundongos (devem ser esterilizados)
Tampa de rosca (topo aberto)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha27056tampa de furo de polipropileno preto, para uso com 22  frasco de mL com espectrofotômetro de 20-400 fios
BioTek Instruments, EUA201446espectrofotômetro de microplacas universal: λ faixa: 200 - 999 nm, faixa de medição de absorbância: 0,000 - 4,000 Abs
Placa de coloração 20 lâminas com rackMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaS6141por exemplo, 20 placas de coloração de lâminas completas com tampas, suporte de lâminas e alça
Punção de biópsia descartável estéril 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, EUA33-36
Tesoura cirúrgicaAnimalab, Poznan, Polônia52138-46instrumentos cirúrgicos para procedimentos em camundongos (devem ser esterilizados)
de processamento de tecidosMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaZ672122de processamento/incorporação de tecidos com tampa
Conjunto de reagentes de substrato TMBBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, EUA555214
TNCB (2,4,6-trinitroclorobenzeno)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JapãoC0307
TNP-BSA (albumina de soro bovino conjugada com 2,4,6-trinitrofenil)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, EUAT-5050
T-PER (reagente de extração de proteína tecidual)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA78510
Tubos de 15 mL estéreisMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaCLS430055 (Corning)polipropileno, fundo cônico
Tubos de 50 mL, estérilMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaCLS430290 (Corning)polipropileno, fundo cônico
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaP1379
Frascos de frasco, tampa de rosca, vidro transparente (somente frasco) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha27173para a preparação de hapteno, aparafusado de modo a não evaporar
Banho-mariaAJL Electronic, PolóniaLW102
Dispensador de cera (parafina)VWR, Radnor, Pensilvânia, Estados Unidos114-8737
Xilazina (xilapan 20 mg/ml) solução injetávelVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polóniacat.# não disponível
Xileno (grau histológico)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha534056
à 366882 Ensaios e análises de proteínas A3160802 cultura Recomenda-se o hemocitômetro

Referências

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Reimpressões e permissões

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Errata


Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

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