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Immunology and Infection

लीशमैनिया प्रमुख का उपयोग करके पोर-बनाने वाले विषाक्त पदार्थों के आणविक तंत्र और कार्य को समझना

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64341
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Texas Tech University

Summary

यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जिसमें छिद्र बनाने वाले विषाक्त पदार्थों द्वारा प्रेरित बंधन, साइटोटॉक्सिसिटी और सिग्नलिंग को निर्धारित करने के लिए लीशमैनिया प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स का उपयोग किया गया है। स्ट्रेप्टोलिसिन ओ के साथ एक प्रमाण-अवधारणा प्रदान की जाती है। अन्य विषाक्त पदार्थों का उपयोग विष प्रतिरोध के नए तंत्र को परिभाषित करने के लिए एल मेजर में उपलब्ध आनुवंशिक उत्परिवर्ती का लाभ उठाने के लिए भी किया जा सकता है।

Abstract

छिद्र बनाने वाले विषाक्त पदार्थों (पीएफटी) के कार्य और तंत्र को समझना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि कोशिकाएं पीएफटी के कारण झिल्ली क्षति का विरोध करती हैं। जबकि बायोफिज़िकल दृष्टिकोण छिद्र गठन को समझने में मदद करते हैं, वे अक्सर झिल्ली लिपिड और प्रोटीन के पूर्ण पूरक की कमी वाले न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोणों पर भरोसा करते हैं। सुसंस्कृत मानव कोशिकाएं एक वैकल्पिक प्रणाली प्रदान करती हैं, लेकिन मरम्मत तंत्र में उनकी जटिलता और अतिरिक्तता विशिष्ट तंत्र की पहचान करना मुश्किल बनाती है। इसके विपरीत, त्वचीय लीशमैनियासिस के लिए जिम्मेदार मानव प्रोटोजोआ रोगज़नक़, लीशमैनिया प्रमुख, जटिलता और शारीरिक प्रासंगिकता के बीच एक इष्टतम संतुलन प्रदान करता है। एल मेजर आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य है और इसे विट्रो में उच्च घनत्व के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, और संक्रमण पर गड़बड़ी के किसी भी प्रभाव को स्थापित मुराइन मॉडल में मापा जा सकता है। इसके अलावा, एल मेजर अपने स्तनधारी समकक्षों से अलग लिपिड को संश्लेषित करता है, जो झिल्ली की गतिशीलता को बदल सकता है। झिल्ली की गतिशीलता में इन परिवर्तनों को सबसे अच्छी विशेषता वाले विष परिवार, कोलेस्ट्रॉल-निर्भर साइटोलिसिन (सीडीसी) से पीएफटी के साथ जांच की जा सकती है। सीडीसी लीशमैनिया झिल्ली में एर्गोस्टेरॉल से जुड़ते हैं और एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स को मार सकते हैं, यह दर्शाता है कि एल मेजर पीएफटी फ़ंक्शन के सेलुलर और आणविक तंत्र को निर्धारित करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली है। यह काम एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स में पीएफटी फ़ंक्शन के परीक्षण के तरीकों का वर्णन करता है, जिसमें परजीवी संस्कृति, लिपिड संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए आनुवंशिक उपकरण, झिल्ली बाध्यकारी परख और कोशिका मृत्यु परख शामिल हैं। ये परख लिपिड संगठन में विकासवादी विविध जीवों और समानताओं की एक श्रृंखला में पीएफटी फ़ंक्शन को समझने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली के रूप में एल मेजर के तेजी से उपयोग को सक्षम करेंगे।

Introduction

पोर बनाने वाले विषाक्त पदार्थ (पीएफटी) जीवाणु विषाक्त पदार्थों का सबसे बड़ा परिवार हैं1, लेकिन जिन तंत्रों द्वारा वे कोशिकाओं को छिद्रित और नष्ट करते हैं, उन्हें खराब तरीके से समझा जाता है। छिद्र बनाने वाले विषाक्त पदार्थों का सबसे अच्छा अध्ययन परिवार कोलेस्ट्रॉल-निर्भर साइटोलिसिन (सीडीसी) है। सीडीसी को मुख्य रूप से ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया द्वारा संश्लेषित किया जाता है, जिसमें नेक्रोटाइज़िंग फैसिसिटिस, स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस2 के प्रेरक एजेंट शामिल हैं। प्योगेनेस सीडीसी स्ट्रेप्टोलिसिन ओ (एसएलओ) का स्राव करता है, जो मेजबान कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में स्टेरोल्स को मोनोमर्स, ऑलिगोमेराइज्ड के रूप में बांधता है, और झिल्ली1 में ~ 20-30 एनएम छिद्र डालता है। इस प्रक्रिया में लिपिड की भूमिका खराब रूप से निर्धारित होती है।

लिपिड-सीडीसी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण रासायनिक रूप से परिभाषित लिपोसोम का उपयोग है। जबकि परिभाषित लिपोसोम विष बंधन और छिद्र गठन 3,4 को बनाए रखने के लिए लिपिड की आवश्यक सीमा पर जानकारी प्रदान करते हैं, वे सेलुलर कार्यों को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। उदाहरण के लिए, पुनर्गठित लिपोसोम में स्तनधारी मेजबानों की लिपिड विषमता और विषाक्त पदार्थों के जवाब में लिपिडसंशोधनों की कमी होती है। लिपोसोम का एक विकल्प स्तनधारी सेल लाइनों का उपयोग करना है। जबकि ये सेल लाइनें अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं, टॉक्सिन सेंसिंग और प्रतिरोध तंत्र2 में अतिरेक की एक बड़ी डिग्री है। नतीजतन, सीडीसी का विरोध करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मरम्मत मार्ग खराब रूप से निर्धारित रहते हैं। विशेष रूप से, सीए2 + प्रवाह झिल्ली की मरम्मत का प्राथमिक उत्प्रेरक है। सीए2 + प्रवाह के डाउनस्ट्रीम में, कई रास्ते लगे हुए हैं, जिनमें सेरामाइड-निर्भर मरम्मत 6,7 और एमईके-निर्भर मरम्मत मार्ग6 शामिल हैं। ये मार्ग अन्य प्रोटीन प्रभावकों के साथ बातचीत करते हैं, जिसमें परिवहन के लिए आवश्यक एंडोसोमल सॉर्टिंग कॉम्प्लेक्स (ईएससीआरटी) 8, और एनेक्सिन 6,9,10 शामिल हैं। स्तनधारी कोशिकाओं में इन मार्गों को विच्छेदित करना अतिरेक के कारण चुनौतीपूर्ण है, जो डेटा व्याख्या को अव्यवस्थित करता है।

मरम्मत मार्गों के विच्छेदन के लिए सरलता के साथ जटिलता को संतुलित करने का एक तरीका सरल जीवों का उपयोग है, जैसे कि जीनस लीशमैनिया में प्रोटोजोआ रोगजनकों। लीशमैनिया एसपी मनुष्यों और अन्य जानवरों में लीशमैनियासिस का कारण बनता है। लीशमैनियासिस प्रजातियों और अन्य कारकों के आधार पर त्वचीय लीशमैनियासिस (स्व-सीमित त्वचा घावों) से लेकर घातक आंत लीशमैनियासिस (हेपेटोस्प्लेनोमेगाली) तक होताहै। लीशमैनिया मेजर, त्वचीय लीशमैनियासिस का प्रेरक एजेंट, एक सैंडफ्लाई वेक्टर के माध्यम से मनुष्यों में प्रेषित होता है और इसका उपयोग लीशमैनिया फ़ंक्शन और संक्रमण12 को समझने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, लीशमैनिया एसपी डायजेनिक12 हैं। वे इंट्रासेल्युलर स्तनधारी मैक्रोफेज परजीवी के रूप में मौजूद हैं जिन्हें एमेस्टिगोट्स कहा जाता है और सैंडफ्लाई12 में फ्री-स्विमिंग, फ्लैगेलेटेड प्रोमेस्टिगोट्स के रूप में। एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स को सीरम-पूरक मीडिया जैसे एम 199 से उच्च घनत्व13 में सुसंस्कृत किया जा सकता है। प्रोमेस्टिगोट्स आनुवंशिक रूप से भी वापस लेने योग्य हैं; कई जीन नॉकआउट मौजूद हैं, जिनमें लिपिड जैवसंश्लेषण मार्गों को लक्षित करनाशामिल है। इन नॉकआउट का मूल्यांकन बाल्ब / सी चूहों के संक्रमण के माध्यम से संक्रामकता और घाव के विकास में वृद्धि और अंतर के लिए किया जा सकताहै।

लीशमैनिया संस्कृति की सापेक्ष आसानी और लिपिड जैवसंश्लेषण नॉकआउट की सीमा के अलावा, परजीवी में स्तनधारियों की तुलना में एक सरल जीनोम है। लीशमैनिया की सबसे अच्छी विशेषता वाली प्रजाति एल मेजर है, जिसमें कई मौजूदा आनुवंशिक उपकरण हैं, जैसे कि दोषपूर्ण लिपिड चयापचय14 के साथ उत्परिवर्ती। विशेष रूप से, कई मरम्मत प्रोटीन अनुपस्थित हैं। एल मेजर में एनेक्सिन जैसे प्रमुख स्तनधारी मरम्मत प्रोटीन के लिए आज तक कोई होमोलॉग नहीं पहचाना गया है। यह स्तनधारी प्रणालियों की जटिलता के बिना क्रमिक रूप से संरक्षित मरम्मत मार्गों के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है। हालांकि, लीशमैनिया में आज तक मरम्मत मार्गों की विशेषता नहीं है। इसी समय, मरम्मत में शामिल प्रमुख सिग्नलिंग मार्ग, जैसे एमईके मार्ग6, लीशमैनिया एसपी 15,16 में संरक्षित हैं, हालांकि होमोलॉग को मान्य करने की आवश्यकता है। माइटोजन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज (एमएपी) मार्ग एल मैक्सिकन में अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, जहां यह स्तनधारी कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर अस्तित्व और थर्मोस्टेबिलिटी में योगदान देता है और मेटासाइक्लोजेनेसिस16 को नियंत्रित करता है। लीशमैनिया एसपी में, 15 एमएपीके में से 10 को17 की विशेषता दी गई है। संरक्षित फॉस्फोराइलेशन होंठ अनुक्रम में पहचान के आधार पर LmMAPK9 और LmMAPK13 स्तनधारी ERK1/2 के समान होने की भविष्यवाणी की जाती है। फॉस्फोराइलेशन होंठ अनुक्रम स्तनधारी ERK1/2 और LmMAPK9 और LmMAPK13 दोनों के लिए TEY है। हालांकि, लीशमैनिया एमएपीके में से आठ में टीडीवाई फॉस्फोराइलेशन मोटिफ15 है। लीशमैनिया एसपी, एलएमएक्सएमकेके18 और एमईकेके-संबंधित किनेज (एमआरके 1)19 में एमईके के कम से कम दो होमोलॉग की पहचान की गई है। इससे पता चलता है कि लीशमैनिया में पहचानी गई अंतर्दृष्टि स्तनधारी प्रणालियों में अनुवाद कर सकती है। जहां वे स्तनधारी प्रणालियों में अनुवाद नहीं करते हैं, वे लीशमैनियासिस के इलाज के लिए चिकित्सीय लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

झिल्ली की मरम्मत और विषाक्त पदार्थों के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स का उपयोग करने के लिए, मध्यम-थ्रूपुट तकनीकों की आवश्यकता होती है। जबकि उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव सेल इमेजिंग वास्तविक समय में लेबल प्रोटीन और झिल्ली के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है, यह कम थ्रूपुट है और सेलुलर अस्तित्व को माप नहीं सकता है। मध्यम-थ्रूपुट व्यवहार्यता परख में फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापा गया डाई अपटेक, माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि का माप, या लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) जैसे सेलुलर प्रोटीन की रिहाई शामिल है। स्तनधारी कोशिकाओं में, एलडीएच परख मात्रात्मक रूप से कोशिका मृत्यु को मापते नहीं हैं। इसके अलावा, एलडीएच रिलीज या माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि जैसे जनसंख्या-आधारित परख मजबूत एकल-कोशिका या मल्टीपैरामीट्रिक विश्लेषणकी अनुमति नहीं देते हैं। इसके विपरीत, फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परख मल्टीपैरामीट्रिक सिंगल-सेल विश्लेषण20 को सक्षम करते हैं। हालांकि, इन परखों को विष जीव विज्ञान या एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स में विषाक्त पदार्थों की प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए लागू नहीं किया गया है।

इस अध्ययन में, एसएलओ का उपयोग दो अलग-अलग बफर में एल मेजर के स्फिंगोलिपिड नल उत्परिवर्ती के प्लाज्मा झिल्ली गड़बड़ी को समझने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जाता है- एम 199 मीडिया नियमित रूप से एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स और सरल टायरोड के बफर को कल्चर करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक मध्यम-थ्रूपुट प्रवाह साइटोमेट्री परख का वर्णन किया गया है और विष खुराक-प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रवाह साइटोमेट्रिक परख से डेटा को एलसी50 मानों को निर्धारित करने के लिए एक लॉजिस्टिक वक्र में मॉडलिंग किया जाता है। इस जानकारी के साथ, एसएलओ की एक सबलाइटिक खुराक निर्धारित की जा सकती है ताकि पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके एमएपी एंटीबॉडी को मान्य किया जा सके।

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Protocol

सभी उपयुक्त दिशानिर्देश और मानक सूक्ष्मजीवविज्ञानी, सुरक्षा और सेल संस्कृति प्रथाओं को आरजी 2 रोगज़नक़ लीशमैनिया प्रमुख और पुनः संयोजक डीएनए के उपयोग और हैंडलिंग के लिए नियोजित किया गया था। लाइव एल मेजर के साथ सभी प्रयोग बीएसएल -2 प्रमाणित प्रयोगशाला में जैव सुरक्षा कैबिनेट में किए गए थे। टेक्सास टेक यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल बायोसेफ्टी कमेटी द्वारा काम की देखरेख की गई थी।

नोट: एक सुरक्षा परिप्रेक्ष्य से, जीवित एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स जोखिम समूह 2 रोगजनक हैं। संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) से उचित नियंत्रण, सावधानियों और निरीक्षण का उपयोग करके संभालें। विषाक्त पदार्थों के लिए संस्थागत प्रक्रियाओं के अनुसार विषाक्त पदार्थों और रसायनों को संभालें। यदि पुनः संयोजक विषाक्त पदार्थों का उपयोग किया जाता है, तो पुनः संयोजक डीएनए कार्य के लिए आईबीसी अनुमोदन और निरीक्षण की आवश्यकता हो सकती है।

1. एल. प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स की खेती और तैयारी

  1. एल प्रमुख आनुवंशिक उत्परिवर्ती प्राप्त करें, या बनाएं और मान्य करें जैसा कि पहले या तो समरूप पुनर्संयोजन या सीआरआईएसपीआर-आधारित विधियों का उपयोग करके वर्णित किया गया था। नॉकआउट की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए प्लास्मिड पर वापस जोड़े गए जीन के साथ पूरक नॉकआउट का उपयोग करें।
  2. पूर्ण एम 199 माध्यम में 27 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर वाइल्ड टाइप एल मेजर और एसपीटी 2- प्रोमेस्टिगोट्स। पूर्ण M199 प्लस 10 μg/ mL G418 में एपिसोमल ऐडबैक कोशिकाओं (spt2-/+SPT2) को कल्चर करें ( तालिका 1 और सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: एल प्रमुख कोशिकाओं के साथ प्रयोगों से जुड़े पूरे प्रयोगात्मक सेटअप को बीएसएल 2-प्रमाणित जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए।
  3. प्रोमेस्टिगोट्स को पूर्ण एम 199 माध्यम22 में तब तक उगाएं जब तक कि वे लॉग चरण (2-8 x 106 कोशिकाओं / एमएल) तक नहीं पहुंच जाते, जैसा कि एल द्वारा निर्धारित कियागया है। साइटोटॉक्सिसिटी के लिए प्रत्येक कुएं के लिए 1 x 105 कोशिकाओं की योजना बनाएं, साथ ही धुंधला नियंत्रण के लिए 5 x 105 कोशिकाएं। पश्चिमी धब्बा के लिए, प्रति अच्छी तरह से 2 x 107 कोशिकाओं की योजना बनाएं।
    नोट: दो तकनीकी प्रतिकृति के साथ साइटोटॉक्सिसिटी परख करें।
  4. उचित सेल घनत्व को सत्यापित करने के लिए, प्रोमेस्टिगोट्स के एक एलिकोट (10-40 μL) को फिक्सेटिव की समान मात्रा (1x PBS में 3.7% पैराफॉर्मलडिहाइड) के साथ मिलाएं। हेमसाइटोमीटर के प्रत्येक तरफ निश्चित नमूने के 10 μL लोड करें।
    सावधानी: फॉर्मलाडेहाइड एक जहरीला रसायन है। खतरनाक रसायनों के लिए संस्थागत नीतियों के अनुसार संभालें।
  5. 20x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल गिनती करें। हेमसाइटोमीटर के केंद्र में 25 छोटे वर्गों में सभी कोशिकाओं की गणना करें। दोनों तरफ के वर्गों के लिए दोहराएं और गिनती का औसत निकालें।
    नोट: यदि गणना के बीच भिन्नता >10 है, तो पुनर्गणना और औसत। यदि औसत गणना <10 या >100 है, तो कमजोर पड़ने और पुनर्गणना को बदलें, और फिर निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके संस्कृति घनत्व की गणना करें:
    Equation 1 (समीकरण 1)
    उदाहरण के लिए, यदि 25 वर्गों में औसतन 250 लीशमैनिया हैं, तो संस्कृति घनत्व 5 x 106 कोशिकाएं /
  6. गिनती के बाद, 5 x 106 कोशिकाओं को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें और संक्षेप में सेल पेलेट को भंवर करें। एक ही ट्यूब में 5 एमएल 1x PBS जोड़ें और धीरे से 3-6x को रोककर कोशिकाओं को धोएं। कोशिकाओं को छर्रों से छर्रों के लिए कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  8. 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और 5 एमएल माध्यम (जैसे, एम 199 या 1 एक्स टायरोड के बफर) में 5 x 106 सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, जिसका उपयोग 5 एमएल पिपेट के साथ प्रयोगों के लिए किया जाता है ताकि 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता दी जा सके।

2. साइटोटॉक्सिसिटी परख

  1. प्रयोगात्मक तैयारी
    1. पहले वर्णित24 के रूप में विष को शुद्ध करें, या एक विक्रेता से विष खरीदें। एलिकोट को एकल-उपयोग एलिकोट में डालें और 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस स्टोर करें। कई फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचें।
    2. मानव लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग करके प्रत्येक विष के लिए हेमोलिटिक गतिविधि निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)24.
      नोट: हेमोलिटिक गतिविधि का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह शुद्धिकरण, उत्परिवर्तन आदि के कारण गतिविधि में अंतर को नियंत्रित करता है। एरिथ्रोसाइट्स की प्रजातियों की पसंद हेमोलिटिक गतिविधि को बदल सकती है (उदाहरण के लिए, इंटरमेडिलिसिन को मानव लाल रक्त कोशिकाओं की आवश्यकता होती है)।
    3. प्रत्येक स्थिति के लिए दो तकनीकी प्रतिकृतियां, खुराक-प्रतिक्रिया वक्र के लिए सात कमजोर पड़ने और नो-टॉक्सिन नियंत्रण की योजना बनाएं।
      नोट: वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी), एसपीटी 2-, और एसपीटी 2-/+ एसपीटी 2 प्रोमेस्टिगोट्स के साथ, एक वी-बॉटम 96-वेल प्लेट में दो उपचारों का परीक्षण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मीडिया के प्रति संवेदनशीलता की तुलना की जा सकती है (चित्रा 1)। वी-बॉटम प्लेट के बजाय, 1.2 एमएल माइक्रोटिटर ट्यूब ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया जा सकता है। साइटोमीटर पर अधिग्रहण के समय के कारण, एक समय में एक से अधिक प्लेट चलाने की सिफारिश नहीं की जाती है।
    4. निर्धारित करें कि आवश्यक परीक्षण स्थितियों और प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर किस परख बफर का उपयोग करना है।
      नोट: इस उदाहरण में, दो परख बफर की तुलना की जाती है: एम 199 और टायरोड के बफर को व्यवहार्यता डाई प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ पूरक किया जाता है। सीरम में कोलेस्ट्रॉल सीडीसी गतिविधि24 में हस्तक्षेप करेगा।
    5. इलाज की गई स्थितियों और जीनोटाइप की संख्या के आधार पर आवश्यक विष की मात्रा की गणना करें। सुनिश्चित करें कि कमजोर पड़ने वाले वक्र के आधे हिस्से में 50% विशिष्ट लाइसिस होता है।
      नोट: सीडीसी के लिए, दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने से बाद में लॉजिस्टिक मॉडलिंग के लिए एक अच्छी रेंज मिलेगी। एसपीटी 2-प्रोमेस्टिगोट्स के लिए, 4,000 एचयू / एमएल एसएलओ को कमजोर पड़ने की सिफारिश की जाती है। जहां निष्क्रिय विषाक्त पदार्थों का उपयोग किया जाता है, इसके बजाय उच्चतम खुराक के बराबर द्रव्यमान का उपयोग किया जा सकता है।
    6. प्रति अच्छी तरह से 200 μL अंतिम मात्रा की योजना बनाएं, और पिपेट त्रुटि के लिए एक छोटी मात्रा अतिरिक्त (50-100 μL) जोड़ें।
      नोट: तीन जीनोटाइप के साथ, प्रत्येक डुप्लिकेट में किया जाता है, सीरियल कमजोर पड़ने के लिए छह नमूने होंगे।
    7. निम्न सूत्र का उपयोग करके आवश्यक विष की कुल मात्रा निर्धारित करें:
      Equation 2 (समीकरण 2)
      जहां एक्टिविटीमैक्स का उपयोग उच्चतम सांद्रता (एचयू / एमएल) है; TotalFinalVolume कुल मात्रा है (छह नमूनों के लिए, 200 x 6 + 100 = 1,300 μL); एक्टिविटीस्टॉक टॉक्सिन स्टॉक (एचयू / एमएल) की गतिविधि है; और वोल्स्टॉकटॉक्सिन आवश्यक विष स्टॉक की मात्रा है।
    8. प्रयोग के लिए आवश्यक पर्याप्त परख बफर तैयार करें। बेसल माध्यम को व्यवहार्यता डाई के साथ पूरक करें और सीए2 + स्तरों को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक किसी भी सीए2 + या ईजीटीए। मिश्रण करने के लिए भंवर।
      नोट: उदाहरण के लिए, प्रत्येक 10 एमएल टायरोड के बफर के लिए, 2 मिलीग्राम / एमएल पीआई के 50 μL और 100 mM CaCl2 के 200 μL जोड़ें, जिससे क्रमशः 10 μg / mL और 2 mM की अंतिम सांद्रता मिलती है।
    9. सुनिश्चित करें कि व्यवहार्यता डाई पीआई किसी भी अन्य जांच के साथ संघर्ष नहीं करता है, जैसे कि Cy5 या AlexaFluor647-संयुग्मित विषाक्त पदार्थों20,25 का उपयोग करके फ्लोरोसेंट बाइंडिंग परख के लिए।
    10. विष का 2x समाधान बनाने के लिए विष कमजोर पड़ने की योजना बनाएं। 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में परख बफर जोड़ें और बर्फ पर ठंडा करें। परख शुरू करने से तुरंत पहले केवल विष जोड़ें।
      नोट: इस उदाहरण में, शीर्ष तनुकरण के लिए 1.3 एमएल परख बफर जोड़ा जाएगा, और 2x विष समाधान तैयार करने के लिए सीरियल कमजोर पड़ने के लिए 650 μL जोड़ा जाएगा।
  2. प्रयोग
    1. "बिना दाग वाले नियंत्रण" के रूप में एक अलग ट्यूब में चरण 1.8 से संसाधित प्रोमेस्टिगोट्स के 0.5 एमएल आरक्षित करें।
      नोट: इस नमूने का उपयोग प्रवाह साइटोमीटर पर गेटिंग सेट करने के लिए किया जाएगा।
    2. शेष प्रोमेस्टिगोट्स में 10 μg / mL की अंतिम सांद्रता में 2 mg / mL PI जोड़ें। 3 सेकंड के लिए भंवर।
      नोट: संसाधित प्रोमेस्टिगोट्स में पीआई को जोड़ने के बाद, इन कोशिकाओं का उपयोग केवल 2.5 घंटे की समय अवधि के लिए किया जा सकता है।
    3. वी-बॉटम 96-वेल प्लेट या 1.2 एमएल माइक्रोटिटर ट्यूब (चित्रा 1) के प्रत्येक कुएं में 1 x 105 (100 μL / वेल में) संसाधित प्रोमेस्टिगोट जोड़ें। प्लेट या ट्यूब रैक को बर्फ पर देखने से लगभग 45 ° कोण पर रखें। लीशमैनिया प्रोमेस्टिगोट्स को संभालते समय एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करें।
    4. प्रत्येक नो-टॉक्सिन नियंत्रण (अंतिम पंक्ति) में पीआई के साथ परख बफर के 100 μL जोड़ें। सत्यापित करें कि नियंत्रण को 200 μL की कुल मात्रा के साथ नेत्रहीन रूप से पहचानकर जोड़ा गया था जो रंग में गहरे दिखाई देते हैं।
    5. -80 डिग्री सेल्सियस से विष एलिकोट को हटा दें, बर्फ पर पिघल जाएं, और आवश्यकतानुसार पूल करें। चरण 2.1.5 में गणना की गई विष की मात्रा को उच्चतम कमजोर पड़ने (चरण 2.1.10 में तैयार) में जोड़ें। फिर, क्रमिक रूप से विष को पतला करें (चित्रा 1)। मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए पिपेट कम से कम 8 गुना ऊपर और नीचे करें।
      नोट: बर्फ पर प्रदर्शन करें क्योंकि सीडीसी कमरे के तापमान पर तेजी से निष्क्रिय हो जाते हैं।
    6. सबसे कम विष सांद्रता से शुरू करते हुए, जल्दी से सही पंक्ति (चित्रा 1 और चित्रा 2) में 100 μL विष जोड़ें और तब तक जारी रखें जब तक कि सभी विष कोशिकाओं में नहीं जुड़ जाते।
    7. सीलिंग टेप के साथ प्लेट को सील करें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन अवधि के बाद, प्लेट को प्रवाह साइटोमीटर में पैकेज और परिवहन करें।
  3. डेटा अधिग्रहण
    1. निर्माता के निर्देशों और प्रति सुविधा नीति के अनुसार प्रवाह साइटोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर सेट करें। साइटोमीटर पर पूर्व प्रशिक्षण के बिना प्रवाह साइटोमेट्री प्रक्रिया न करें।
      नोट: इस उदाहरण में, एक 4-लेजर एट्यून NxT का उपयोग किया गया था। पीआई को वाईएल -1 चैनल पर एकत्र किया गया था (561 एनएम लेजर द्वारा उत्तेजित, 577 एलपी के माध्यम से पारित, 600 डीएलपी से प्रतिबिंबित, और 585/16 बैंडपास के माध्यम से फ़िल्टर किया गया), हालांकि पीआई का व्यापक स्पेक्ट्रम अन्य चैनलों पर संग्रह की अनुमति देता है।
    2. प्रमुख प्रोमेस्टिगोट नमूने का उपयोग करके, आगे और साइड स्कैटर के लिए गेट सेट करें और चुने गए रंगों के आधार पर प्रारंभिक फ्लोरोसेंट पैरामीटर।
    3. ऑटोफ्लोरेसेंस (जैसे, "कोई दाग नहीं") की जांच करने के लिए डॉट प्लॉट के लिए वांछित होने पर एक अतिरिक्त पैरामीटर शामिल करें (चित्रा 3)।
      नोट: इस उदाहरण में, बीएल -1 चैनल (488 एनएम लेजर द्वारा उत्तेजित, 495 डीएलपी और 503 एलपी से गुजरते हुए, 555 डीएलपी से परावर्तित, और 530/30 बैंडपास के माध्यम से फ़िल्टर किया गया) का उपयोग किया गया था।
    4. एकल दाग वाले नियंत्रणों का उपयोग करके, व्यवहार्यता डाई (इस अध्ययन में पीआई) और किसी भी फ्लोरोसेंटली लेबल विषाक्त पदार्थों के लिए द्वार सेट करें। माइक्रो-क्लोग के लिए समय बनाम फॉरवर्ड स्कैटर की निगरानी करें।
      नोट: पीआई बिना दाग वाले नियंत्रणों के ऊपर सभी कोशिकाओं को धुंधला कर देगा। मृत कोशिकाओं को आसानी से अलग किया जा सकता है, आबादी के बीच क्षणिक रूप से स्थिर कोशिकाओं के साथ।
    5. साइटोमीटर पर प्रत्येक नमूने के लिए >10,000 गेटेड इवेंट प्राप्त करें।
      नोट: यह सबसे संवेदनशील से कम संवेदनशील तक पढ़ने की सिफारिश की जाती है, लेकिन नमूना परिणामों पर पढ़ने के आदेश के किसी भी प्रभाव को निर्धारित करने के लिए अधिग्रहण के क्रम को उलट दिया जा सकता है।
    6. डेटा सहेजें और विश्लेषण के लिए आवश्यकतानुसार निर्यात करें।
  4. डेटा विश्लेषण
    नोट: इस अध्ययन में, सॉल्वर प्लग-इन के साथ एक्सेल (देखें) सामग्री की तालिका) डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था (देखें) पूरक फ़ाइल 1).
    1. गेट टोटल, सिंगल सेल एल. प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स को आगे और साइड में स्कैटर और आवश्यकतानुसार समय पर गेट करके (चित्रा 3)। प्रवाह साइटोमीटर के लिए अनुशंसित ऊंचाई या क्षेत्र का उपयोग करें।
      नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले प्रवाह साइटोमीटर के लिए, ऊंचाई क्षेत्र के बजाय अनुशंसित पैरामीटर है।
    2. मृत कोशिकाओं को "पीआई उच्च" के रूप में पहचानें और गेट करें। मध्यवर्ती कोशिकाओं को "पीआई कम" के रूप में गेट करें। पीआई उच्च कोशिकाएं मृत कोशिकाएं हैं, जबकि पीआई कम कोशिकाएं क्षणिक रूप से परमेबिलाइज्डहोती हैं।
      नोट: पीआई उच्च कोशिकाएं आमतौर पर नकारात्मक कोशिकाओं से 2-3 लॉग शिफ्ट दिखाती हैं।
    3. डेटा को Excel में निर्यात करें. हत्या निर्धारित करने के लिए नमूना नाम/ID और %PI उच्च प्राप्त करें.
      नोट: यदि फ्लोरोसेंट विषाक्त पदार्थों का उपयोग किया गया था, तो जीवित, क्षणिक रूप से परमेबिलाइज्ड और नकारात्मक आबादी के औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) की आवश्यकता होगी। %PI कम को क्षणिक परमेबिलाइजेशन के लिए निर्यात किया जा सकता है.
    4. दो तकनीकी प्रतिकृतियों के बीच प्रत्येक स्थिति के लिए औसत %PI उच्च निर्धारित करें.
      नोट: यदि फ्लोरोसेंट विषाक्त पदार्थों के लिए औसत एमएफआई की आवश्यकता है, तो इसकी भी गणना करें।
    5. निम्न सूत्र24,25 का उपयोग करके %PI उच्च से %विशिष्ट लाइसिस की गणना करें:
      Equation 3 (समीकरण 3)
      जहां PIhighxpt प्रयोगात्मक स्थिति के लिए %PI उच्च है; और PIhighctl नो-टॉक्सिन नियंत्रण के लिए %PI उच्च है।
    6. खुराक-प्रतिक्रिया वक्र के लिए विष एकाग्रता के खिलाफ प्लॉट %विशिष्ट लाइसिस (चित्रा 4)।
    7. लॉजिस्टिक मॉडलिंग के लिए एक्सेल में खुराक-प्रतिक्रिया वक्र व्यवस्थित करें। प्रयोगात्मक विवरण और/ या कच्चे % पीआई उच्च गणना के साथ विष एकाग्रता और औसत % विशिष्ट लाइसिस शामिल करें (तालिका 2)।
    8. सत्यापित करें कि सॉल्वर ऐड-इन सक्षम किया गया है।
      नोट: Excel के डेस्कटॉप संस्करण में सॉल्वर को सक्षम करने के लिए, फ़ाइल > विकल्प > ऐड-इन पर जाएँ, और सॉल्वर बॉक्स की जाँच करें। Excel को पुनरारंभ करें.
    9. चार और स्तंभों को "मॉडलिंग", "अवशिष्ट", "पैरामीटर" और "पैरामीटर मान" के रूप में लेबल करें। सत्यापित करें कि पहले कॉलम प्रयोगात्मक मापदंडों, विष एकाग्रता और % विशिष्ट लाइसिस (तालिका 2) के अनुरूप हैं।
    10. "पैरामीटर" कॉलम में निम्न पैरामीटर जोड़ें: L, k, c, SUM, और LC50. "पैरामीटर मान" स्तंभ में निम्न मान दर्ज करके पैरामीटर L, k, और c प्रारंभ करें: 100, 0.05, 1,000.
    11. "मॉडलिंग" कॉलम में, निम्न सूत्र का उपयोग करके लॉजिस्टिक मॉडल बनाएँ:
      Equation 4 (समीकरण 4)
      "पैरामीटर मान" कॉलम में उन मापदंडों वाले कक्षों में एल, के और सी सेट करें।
      विष सांद्रता वाले सेल में एक्स सेट करें।
      नोट: तालिका 2, सेल G4 के लिए, सूत्र निम्नानुसार है: =$J$3/(1+ EXP(-$J$4*(D4-$J$5)))
    12. नो-टॉक्सिन नियंत्रण को छोड़कर सभी %विशिष्ट लाइसिस मानों पर इस समीकरण को लागू करें.
    13. "अवशिष्ट" कॉलम में, निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके मॉडलिंग संख्या और वास्तविक विशिष्ट लाइसिस के बीच अंतर के वर्ग की गणना करें:
      Equation 5 (समीकरण 5)
      जहां y प्रयोगात्मक % विशिष्ट लाइसिस है; और चरण 2.4.10-2.4.11 में गणना किए गए "मॉडलिंग" कॉलम में एम संबंधित मान है।
    14. "SUM" के बगल में "पैरामीटर मान" स्तंभ में, अवशिष्ट स्तंभ में सभी मानों का योग करें।
    15. "LC50" के बगल में "पैरामीटर मान" स्तंभ में, निर्धारित मानों से LC50 की गणना करने के लिए समीकरण प्रारंभ करें। यह x के लिए समीकरण 4 को हल कर रहा है जब m = 50 है।
      Equation 6 (समीकरण 6)
      तालिका 2 के लिए, Excel सूत्र निम्नानुसार है: =J5-(LN(J3/(50)-1)/J4
    16. डेटा टैब से सॉल्वर खोलें। गणना किए गए अवशिष्ट के योग वाले सेल के रूप में सेट उद्देश्य का चयन करें। इसे मिन पर सेट करें।
    17. L, k, और c के पैरामीटर मानों के लिए चर कक्ष ों को परिवर्तित करें।
      नोट: सॉल्वर बेहतर व्यवहार कर सकता है यदि "असीमित चर गैर-नकारात्मक बनाएं" चेक किया जाता है।
    18. नकारात्मक k मानों के लिए, k को धनात्मक में बदलने के लिए k से −1 को हटाकर Eq 4 और Eq 6 को संशोधित करें। GRG नॉनलाइनियर समाधान विधि का उपयोग करें। हल करें पर क्लिक करें.
    19. वक्र की जाँच करें और यह कि एलसी50 स्वचालित रूप से समीकरण 6 (तालिका 2) का उपयोग करके गणना की जाती है। विष एकाग्रता के विरुद्ध %विशिष्ट लाइसिस और मॉडलिंग दोनों को ग्राफ़िक रूप से प्लॉट करके फिट की पुष्टि करें.
      नोट: इसे वक्र के लिए आर2 की गणना करके भी जांचा जा सकता है।

3. टॉक्सिन-चैलेंज्ड एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स का प्रोटीन विश्लेषण

  1. एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स तैयार करें जैसा कि खंड 1 में वर्णित है।
  2. 5 एमएल पिपेट (जैसे, सीरम-मुक्त एम 199) का उपयोग करके वांछित परख बफर के 2 एमएल में 2 x 107 डब्ल्यूटी, एसपीटी 2-, और एसपीटी 2-/+ एसपीटी 2 एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स को पुन: निलंबित करें। अंतिम उप-इलेक्ट्रोलाइटिक एकाग्रता में विष जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: उदाहरण के लिए, एसपीटी 2-प्रोमेस्टिगोट्स के लिए एसएलओ की एक उप-इलेक्ट्रोलाइटिक खुराक 500 एचयू / एमएल है।
  3. अन्य जीनोटाइप और नो-टॉक्सिन नियंत्रण शामिल करें।
  4. कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 10 मिनट के लिए 1,500 x g पर प्रोमेस्टिगोट्स को सेंट्रीफ्यूज करें। 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें। सेल गोली को तोड़ने के लिए सेल पेलेट युक्त बंद ट्यूब को एक अनियमित सतह पर तीन बार तेजी से चलाएं, जैसे कि बायोसेफ्टी कैबिनेट की ग्रिल।
    नोट: सेल गोली नग्न आंखों के लिए लगभग अदृश्य है।
  5. उपयोग से तुरंत पहले 2-मर्कैप्टोथेनॉल के साथ 1x SDS-PAGE नमूना बफर का पुनर्गठन करें और सेल गोली के अलावा 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। सेल पेलेट को गर्म 1x SDS-PAGE नमूना बफर में पुन: निलंबित करें, और ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं। 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 1x नमूना बफर में पुन: निलंबित सेल गोली गर्म करें।
    नोट: नमूना बफर में घुलनशीलता के बाद, यदि आवश्यक हो तो नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक रूप से स्टोर करें।
  6. समाधान जेल तैयार करें। अमोनियम परसल्फेट (एपीएस) और टीईएमईडी को छोड़कर सभी घटकों को 15 मिनट के लिए डीगैस करें।
  7. जेल डालने से पहले तुरंत एपीएस और टीईएमईडी जोड़ें। हल करने वाले जेल को सावधानीपूर्वक पानी से भर दें। समाधान करने वाले जेल को पॉलीमराइज़ करने की अनुमति दें, ~ 30-45 मिनट।
  8. पानी को डिकैंटिंग करें और स्टैकिंग जेल तैयार करें। बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखते हुए स्टैकिंग जेल जोड़ें। कुओं की प्रासंगिक संख्या के साथ एक कंघी डालें, और 5 मिनट के लिए बहुलक बनाने की अनुमति दें। किसी भी बचे हुए स्टैकिंग जेल का उपयोग करके पोलीमराइजेशन की निगरानी करें।
  9. एसडीएस-पेज चलाने के लिए जेल को इकट्ठा करें और कक्ष में जलाशय बफर जोड़ें।
  10. प्रत्येक नमूने का 10 μL प्रति कुएं लोड करें, या प्रोटीन सीढ़ी का 8 μL। 180 वी पर तब तक चलाएं जब तक कि नमूने समाधान जेल में प्रवेश नहीं करते, और फिर वोल्टेज को ~ 160 वी तक कम करें और प्लेट के किनारे से डाई फ्रंट ~ 0.5 सेमी तक न चलाएं।
    नोट: नमूने को नीचे तक पहुंचने में लगने वाला समय 1-1.5 घंटे के बीच भिन्न हो सकता है। वोल्टेज को कम करके समय को लंबा किया जा सकता है। वोल्टेज को कभी भी शून्य तक कम न करें। उच्च वोल्टेज जेल "मुस्कुराते हुए" को बढ़ा सकता है और प्लेटों को क्रैक कर सकता है।
  11. जेल को या तो कूमासी दाग (प्रोटीन धुंधला करने के लिए) या 1एक्स ट्रांसफर बफर (पश्चिमी सोख्ता के लिए) में स्थानांतरित करें। कूमासी धुंधला होने के लिए, रात भर दाग, और फिर धुंधला, छवि और सूखा।
  12. पश्चिमी धब्बा के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्थानांतरण प्रणाली तैयार करें।
  13. गीले स्थानांतरण के लिए, ठंडे 1x ट्रांसफर बफर और प्री-वेट पैड, फिल्टर पेपर और नाइट्रोसेल्यूलोज का उपयोग करें। यहां उपयोग किए जाने वाले बायो-रैड प्रोटियन III सिस्टम ( सामग्री की तालिका देखें) के लिए, फिल्टर पेपर को 10 सेमी x 7.5 सेमी तक काटा जा सकता है। नाइट्रोसेल्यूलोज को 9 सेमी x 6.75 सेमी तक काट लें।
    नोट: नाइट्रोसेल्यूलोज अत्यधिक ज्वलनशील है। खुली लपटों और प्रज्वलन के अन्य संभावित स्रोतों से बचें।
  14. पैड, फिल्टर पेपर और नाइट्रोसेल्यूलोज के साथ ट्रांसफर कैसेट बिछाएं। हवा के बुलबुले बाहर निकालें। जेल को सावधानी से जोड़ें।
  15. फ़िल्टर पेपर जोड़ें और हवा के बुलबुले रोल आउट करें। पैड जोड़ें, कैसेट बंद करें, और सही अभिविन्यास में धारक में डालें (सुनिश्चित करें कि नाइट्रोसेल्यूलोज लाल टर्मिनल का सामना करता है)। साइड में एक हलचल पट्टी और एक आइस पैक जोड़ें, और ठंडे 1x ट्रांसफर बफर के साथ जलाशय से ऊपर। 90 मिनट के लिए 110 वोल्ट पर स्थानांतरण।
    नोट: स्थानांतरण के दौरान उत्पन्न गर्मी हस्तांतरण पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकती है। एक अच्छा स्थानांतरण सुनिश्चित करने के लिए, हमेशा ठंडे 1x स्थानांतरण बफर का उपयोग करें।
  16. नाइट्रोसेल्यूलोज को हटा दें और ~ 5 मिनट के लिए पोन्सेउ समाधान के साथ दाग दें। अल्ट्राप्योर पानी से धो लें। पेंसिल में प्रोटीन सीढ़ी को चिह्नित करें और आवश्यकतानुसार धब्बा ट्रिम करें। बचे हुए ट्रांसफर बफर का उपयोग करके धब्बा लगाएं।
    नोट: पोन्सेउ का कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  17. नाइट्रोसेल्यूलोज को रात भर हिलाने के साथ 1x TBST में 5% बीएसए के 25 एमएल में ब्लॉक करें। फिर, ब्लॉकिंग समाधान को छोड़ दें और 1x TBST में 1% बीएसए में प्राथमिक एंटीबॉडी (1: 1,000) जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी को -20 डिग्री सेल्सियस पर बचाया जा सकता है और कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  18. नाइट्रोसेल्यूलोज 3x को 1x TBST में 10 मिनट के लिए हिलाने के साथ धो लें। धोने को छोड़ दें और 1x TBST में 1% बीएसए में 10 एमएल HRP-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (1: 10,000) जोड़ें। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हिलाएं। नाइट्रोसेल्यूलोज 3x को 1x TBST में 10 मिनट के लिए हिलाने के साथ धो लें।
  19. नाइट्रोसेल्यूलोज इमेजिंग से पहले तुरंत ईसीएल अभिकर्मक तैयार करें। इमेजिंग से तुरंत पहले, टीबीएसटी को डिकेंट करें और नाइट्रोसेल्यूलोज में ईसीएल अभिकर्मक जोड़ें। 1 मिनट के लिए हिलाएं। जेल की छवि बनाएं।

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Representative Results

M199 की तुलना में टायरोड के बफर में एसएलओ के लिए प्रोमेस्टिगोट संवेदनशीलता में वृद्धि
प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स की एसएलओ संवेदनशीलता की तुलना विभिन्न परख बफर के बीच की गई थी। वाइल्ड-टाइप, एसपीटी 2-, और एसपीटी 2-/+एसपीटी 2 प्रोमेस्टिगोट्स को सीरम-मुक्त एम 199 या टायरोड के बफर में एसएलओ के साथ फ्लो साइटोमीटर पर विश्लेषण से पहले 30 मिनट के लिए 2 एमएम सीएसीएल2 के साथ पूरक किया गया था। विश्लेषण के लिए उपयुक्त परजीवी एकल कोशिकाएं थीं जिन्हें आगे / साइड स्कैटर प्रोफाइल (चित्रा 3 ए, बी) द्वारा पहचाना गया था। डेटा को ऑटोफ्लोरेसेंस नियंत्रण के रूप में चैनल बीएल 1 (488 उत्तेजना, 530/30 उत्सर्जन फिल्टर) और पीआई के लिए वाईएल 1 (561 एनएम उत्तेजना, 585/16 उत्सर्जन फिल्टर) का उपयोग करके एकत्र किया गया था। बीएल 1 का उपयोग संभावित ऑटोफ्लोरेसेंस या मुआवजा मुद्दों (चित्रा 3 सी-ई में एक्स-अक्ष) की पहचान करने के लिए किया गया था। 561 एनएम लाइन के उपयोग ने बीएल 1 चैनल में पीआई से खून बहने को कम कर दिया। मृत कोशिकाओं का अंश प्रत्येक स्थिति के लिए निर्धारित किया गया था, और %विशिष्ट लाइसिस निर्धारित किया गया था। वाइल्डटाइप और एसपीटी 2-/+एसपीटी 2 प्रोमेस्टिगोट सीरम-मुक्त एम 199 में एसएलओ के लिए प्रतिरोधी थे, लेकिन टायरोड के बफर (चित्रा 4 ए) में मामूली (<20%) विशिष्ट लाइसिस था। स्फिंगोलिपिड की कमी वाले एसपीटी 2-प्रोमेस्टिगोट्स सीरम-मुक्त एम 199 और टायरोड के बफर (चित्रा 4) दोनों में एसएलओ के प्रति संवेदनशील थे। सीरम-मुक्त एम 199 की तुलना में टायरोड के बफर से संवेदनशीलता में वृद्धि की मात्रा निर्धारित करने के लिए, खुराक-प्रतिक्रिया वक्र एक लॉजिस्टिक मॉडल के लिए फिट था, और एलसी50 की गणना प्रत्येक स्थिति के लिए की गई थी (चित्रा 4 बी)। एसपीटी 2-प्रोमेस्टिगोट्स एम 199 (चित्रा 4 बी) की तुलना में टायरोड के बफर में एसएलओ के प्रति लगभग आठ गुना अधिक संवेदनशील थे। इन आंकड़ों से पता चलता है कि उपयोग किए गए बफर के आधार पर विष संवेदनशीलता भिन्न हो सकती है। वक्र फिटिंग पूरे खुराक-प्रतिक्रिया वक्र में परिवर्तन की तुलना को सक्षम बनाता है। इस प्रकार, फ्लो साइटोमेट्री विभिन्न परिस्थितियों में एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स की विष संवेदनशीलता की तुलना करने के लिए एक मध्यम-थ्रूपुट परख को सक्षम बनाता है।

एल में एमईके मार्ग सक्रियण प्रमुख विष चुनौती से स्वतंत्र है
साइटोटॉक्सिसिटी परख से सेलुलर अस्तित्व पर एकल-सेल डेटा उप-इलेक्ट्रोलाइटिक विष खुराक पर डाउनस्ट्रीम परख को सक्षम करता है। उदाहरण के लिए, एल मेजर को विष चुनौती के बाद पश्चिमी सोख्ता द्वारा जैव रासायनिक मार्गों के लिए परख किया जा सकता है। स्तनधारी कोशिकाओं में झिल्ली की मरम्मत के दौरान एमईके मार्ग सक्रियहोता है। यह अज्ञात है कि क्या यह मार्ग एल मेजर में एसएलओ चुनौती के बाद सक्रिय है या यदि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी किसी भी एल प्रमुख एमएपी होमोलॉग को पहचानते हैं। डब्ल्यूटी, एसपीटी 2-, और एसपीटी 2-/+ एसपीटी 2 प्रोमेस्टिगोट्स को एसएलओ की एक सबलाइटिक (500 एचयू / एमएल) खुराक के साथ चुनौती दी गई थी और पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया था। एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स (चित्रा 5) में फॉस्फो-एमईके के लिए एक ~ 120 केडीए बैंड देखा गया था। कुल एमईके के लिए, ~ 120 केडीए और ~ 55 केडीए पर बैंड देखे गए (चित्रा 5), जो क्रमशः एमआरके 1 और एलएमएक्सएमकेके के आकार के अनुरूप हैं। फॉस्फो-ईआरके ने इसी तरह के बैंड का पता लगाया, जबकि ईआरके एंटीबॉडी धुंधला इस परख में मजबूत नहीं था (चित्रा 5)। लिपोफॉस्फोग्लाइकन (एलपीजी) और ट्यूबुलिन को भी लोडिंग नियंत्रण के रूप में धब्बा लगाया गया था। ये डेटा एल मेजर में उपयोग के लिए एंटीबॉडी को मान्य करने के महत्व को प्रकट करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: 96-वेल प्लेटें साइटोटॉक्सिसिटी परख के लिए एक आदेशित सेटअप को सक्षम करती हैं। साइटोटॉक्सिसिटी परख को दो तकनीकी प्रतिकृतियों के छह स्तंभों में विभाजित किया गया है। नियंत्रण के साथ, यह प्रति प्लेट दो स्थितियों का परीक्षण करने की अनुमति देता है। इस उदाहरण में, सीरम-मुक्त एम 199 में पुन: निलंबित एल.मेजर प्रोमेस्टिगोट्स की तुलना टायरोड के बफर में उन लोगों से की जाती है। जीनोटाइप जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) (हरा), एसपीटी 2- (लाल), और एसपीटी 2-/ + एसपीटी 2 (नीला) के क्रम का पालन करते हैं। विष (एसएलओ) को इस तरह जोड़ा जाता है कि एकाग्रता प्लेट के शीर्ष पर उच्चतम एकाग्रता से नीचे तक चलती है, जिससे अंतिम पंक्ति को नो-टॉक्सिन नियंत्रण के रूप में छोड़ दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: लगातार सेटअप प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साइटोटॉक्सिसिटी परिणामों को सक्षम बनाता है। आवश्यक विष की मात्रा की गणना करने के बाद, 2x समाधान के लिए आवश्यक परख बफर की मात्रा तैयार की जाती है। व्यवहार्यता डाई (पीआई) और सीएसीएल2 को आवश्यकतानुसार जोड़ा जाता है और बफर को 1.5 एमएल ट्यूबों में वितरित किया जाता है। परख बफर में धोने और पुन: निलंबन के बाद, 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में समान संख्या में एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स वितरित किए जाते हैं। विष को परख बफर में जोड़ा जाता है और कोशिकाओं के अलावा उच्चतम विष खुराक (पहली ट्यूब) से सबसे कम खुराक (7 वीं ट्यूब) तक क्रमिक रूप से पतला किया जाता है। विष को 96-वेल प्लेट में कोशिकाओं में जोड़ा जाता है जो प्लेट के नीचे से सबसे कम विष खुराक (7 वीं पंक्ति) पर शुरू होता है और उच्चतम खुराक (पहली पंक्ति) तक काम करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: गेटिंग रणनीति कोशिकाओं की जीवित और मृत आबादी को अलग करती है। पीआई से सना हुआ और एसएलओ के साथ चुनौती देने वाले प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। (ए, बी) गेटिंग रणनीति आगे और साइड स्कैटर के आधार पर कुल एल मेजर से एकल कोशिकाओं की पहचान करती है। (C-E) पीआई धुंधला होने का अगला आकलन किया जाता है, और कोशिकाओं को पीआई उच्च, पीआई कम और पीआई नकारात्मक आबादी में गेट किया जाता है। (सी) कोई विष नहीं, (डी) 1,000 एचयू / एमएल, और (ई) 4,000 एचयू / एमएल एसएलओ के लिए प्रतिनिधि डेटा दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: टायरोड का बफर एम 199 की तुलना में एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स की संवेदनशीलता को बढ़ाता है। सीरम-मुक्त एम 199 या टायरोड के बफर में प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संकेतित सांद्रता पर एसएलओ के साथ चुनौतीदी गई थी, और पीआई अपटेक का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। %विशिष्ट लाइसिस की गणना की गई थी. एक लॉजिस्टिक मॉडल का निर्माण किया गया था और एसपीटी 2-म्यूटेंट के लिए एलसी50 की गणना की गई थी। ग्राफ़ प्रदर्शन (ए) का मतलब एसईएम ± या (बी) तीन स्वतंत्र प्रयोगों से व्यक्तिगत प्रयोग हैं। वेल्च के सुधार के साथ एक छात्र के अप्रकाशित टी-टेस्ट का उपयोग एलसी50 मानों के लिए किया गया था। ** पी < 0.01 कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: फॉस्फो-ईआरके और फॉस्फो-एमईके 1/2 स्फिंगोलिपिड्स या विष चुनौती से स्वतंत्र रूप से एल प्रमुख प्रोटीन का पता लगाते हैं। वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटी), एसपीटी 2-, और एसपीटी 2-/+एसपीटी 2 एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स को सीरम-मुक्त एम 199 में 500 एचयू / एमएल एसएलओ के साथ या उसके बिना 30 मिनट के लिए 30 मिनट के लिए चुनौती दी गईथी। सेल लाइसेट को एसडीएस-पेज द्वारा हल किया गया, नाइट्रोसेल्यूलोज में स्थानांतरित किया गया, और फॉस्फो-एमईके (पीएमईके), कुल एमईके, फॉस्फो-ईआरके (पीईआरके), कुल ईआरके, लिपोफॉस्फोग्लाइकन (एलपीजी), या ट्यूबुलिन के लिए जांच की गई, इसके बाद एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी और ईसीएल। प्रत्येक मामले में दो स्वतंत्र प्रयोगों से एक प्रतिनिधि धब्बा दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: बफर और मीडिया रचनाएँ। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: Excel परिकलन के लिए नमूना लेआउट. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: सूत्रों के साथ एक्सेल स्प्रेडशीट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन में, मानव रोगज़नक़ लीशमैनिया मेजर को एक मॉडल सिस्टम के रूप में उपयोग करते हुए, पीएफटी के आणविक तंत्र और कार्यों का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन किया गया था। एकल-सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए एक मध्यम-थ्रूपुट फ्लो साइटोमेट्री-आधारित साइटोटॉक्सिसिटी परख विकसित की गई थी। व्यवहार्यता जनसंख्या स्तर पर मात्रात्मक है क्योंकि एलसी50 मूल्यों की गणना लॉजिस्टिक मॉडलिंग का उपयोग करके खुराक-प्रतिक्रिया वक्र से की जा सकती है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, एक प्रवाह साइटोमेट्रिक परख का उपयोग यह बताने के लिए किया गया था कि मीडिया की पसंद एसएलओ के लिए जंगली-प्रकार और स्फिंगोलिपिड-कमी वाले एल.मेजर संवेदनशीलता को बदल सकती है और प्रत्येक माध्यम में सबलाइटिक विष खुराक निर्धारित कर सकती है। डाउनस्ट्रीम परख में सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, विष चुनौती के दौरान एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स में फॉस्फो-एमएपी और फॉस्फो-ईआरके एंटीबॉडी का परीक्षण किया गया था। कुल मिलाकर, एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स एक रोगजनक रूप से प्रासंगिक और आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य मॉडल सिस्टम हैं जिनका उपयोग कोशिकाओं को विष-मध्यस्थता क्षति के तंत्र और कार्यों को बेहतर ढंग से समझने के लिए किया जा सकता है।

फ्लो साइटोमेट्री परख उच्च लचीलापन प्रदान करता है। यदि वांछित हो तो पीआई के लिए अन्य व्यवहार्यता रंगों को प्रतिस्थापित किया जा सकता है। स्तनधारी कोशिकाओं में, व्यवहार्यता रंजक20 की एक श्रृंखला के लिए रिपोर्टिंग क्षमता में कोई अंतर नहीं देखा गया था। प्रमुख जीनोटाइप, किसी भी उपचार के अलावा, और परख बफर की पसंद आवश्यकतानुसार भिन्न हो सकती है। टॉक्सिन बाइंडिंग का मूल्यांकन साइटोटॉक्सिसिटी के समानांतर या इसके बजाय किया जा सकता है यदि उपयोग किए गए विष को साइ 5 जैसे फ्लोरोफोरे से संयुग्मित किया जाता है। एल प्रमुख जीनोटाइप के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए पूरक उपभेदों को शामिल करना महत्वपूर्ण है कि फेनोटाइप जीन के कारण है। इस प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन में, एल मेजर, एम 199 को उगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले आधार माध्यम ने टायरोड के बफर की तुलना में एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स को अधिक सुरक्षा प्रदान की। टायरोड के बफर ने सीरम-मुक्त  एम 199 के उपयोग की तुलना में एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स के एसपीटी 2-उत्परिवर्ती की संवेदनशीलता में वृद्धि की, एक बेसल मीडिया जिसका उपयोग विट्रो में एल प्रमुख प्रोमेस्टिगोट्स को फैलाने के लिए किया जाता है। इससे पता चलता है कि एम 199 में एक या अधिक साइटोप्रोटेक्टिव घटक हैं। दो संभावित साइटोप्रोटेक्टिव एजेंट ग्लाइसिन या एलानिन हैं, जो अन्य स्तनधारी प्रणालियों में साइटोप्रोटेक्टिव हैं27,28. कुल मिलाकर, फ्लो साइटोमेट्री साइटोटॉक्सिसिटी परख विभिन्न विषाक्त पदार्थों, स्थितियों और परजीवी जीनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए एक लचीला मंच प्रदान करता है।

लॉजिस्टिक मॉडलिंग के साथ फ्लो साइटोमेट्रिक परख का युग्मन पीएफटी के लिए सेल संवेदनशीलता पर बेहतर जानकारी प्रदान करता है। सबसे पहले, सक्रिय विषाक्त पदार्थों के लिए द्रव्यमान के बजाय हेमोलिटिक इकाइयों का उपयोग किया गया था। इसने विभिन्न विष तैयारी और सुसंगत परख परिणामों में डेटा के सामान्यीकरण की अनुमति दी और विषाक्त पदार्थों और लक्ष्यों के बीच हत्या की सीधी तुलना को सक्षम किया। जबकि विशिष्ट लाइसिस का उपयोग घातकता में विष के योगदान का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, प्रत्येक स्थिति के लिए आवश्यक नियंत्रण बेसलाइन हत्या पर जानकारी प्रदान करते हैं। यदि कोई एजेंट विशेष रूप से विषाक्त है, तो यह इन नियंत्रणों में दिखाई देगा। कई सांद्रता में विशिष्ट लाइसिस एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र के निर्माण को सक्षम बनाता है। विष गतिविधि की व्याख्या करने के लिए खुराक-प्रतिक्रिया वक्र आवश्यक हैं। कई मामलों में, प्रयोगशालाएं एक ही एकाग्रता पर विष संवेदनशीलता में अंतर की रिपोर्ट करेंगी। चुने गए खुराक-प्रतिक्रिया वक्र के हिस्से के आधार पर, इस अंतर को संवेदनशीलता या प्रतिरोध की कोई भी छाप देने के लिए विकृत किया जा सकता है। पूरे खुराक-प्रतिक्रिया वक्रों का विश्लेषण लॉजिस्टिक मॉडलिंग के माध्यम से किया जा सकता है। लॉजिस्टिक मॉडलिंग आसानी से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सरल है और एलसी50, वक्र (के) की कठोरता और अधिकतम लाइसिस (एल) पर अधिक जानकारी प्रदान करता है। इन सभी मापदंडों में अंतर का उपयोग वक्रों के बीच सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। अधिकतम लाइसिस में परिवर्तन आंशिक रूप से सक्रिय विषाक्त पदार्थों, निष्क्रिय विषाक्त पदार्थों या प्रतिरोधी सेल प्रकारों के लिए उपयोगी हो सकते हैं। कुल मिलाकर, साइटोटॉक्सिसिटी में परिवर्तन को मापने के लिए मात्रात्मक तरीके प्रदान किए गए थे।

मात्रात्मक, मध्यम-थ्रूपुट प्रवाह साइटोमेट्रिक साइटोटॉक्सिसिटी परख का उपयोग करने के फायदों के बावजूद, इस परख का उपयोग करते समय विचार करने के लिए चेतावनी हैं। विशेष रूप से, सीरम की कमी इनक्यूबेशन बार 1-2 घंटे तक सीमित हो जाती है। बाद के समय में, उच्च पृष्ठभूमि मृत्यु परिणामों की व्याख्या को जटिल बनाती है। सीडीसी के लिए सीरम को हटाना आवश्यक है क्योंकि सीरम में कोलेस्ट्रॉल सीडीसी24 को रोकता है। अन्य सीरम कारक विषाक्त पदार्थों के लिए सेल संवेदनशीलता को भी बदल सकते हैं। एक और चुनौती परख में उपयोग किए जाने वाले कैल्शियम की एकाग्रता है। जबकि झिल्ली की मरम्मत परख आमतौर पर बाह्य सीए 2+ की नकल करने के लिए 2 एमएम सीए2 + का उपयोग करती है, उच्च कैल्शियम बफर प्रवाह साइटोमीटर में कैल्शियम के जमाव का जोखिम उठा सकते हैं, जो सेल क्लंपिंग और / या माइक्रोफ्लुइडिक्स को बंद कर सकता है। हेलमैनेक्स III (सामग्री की तालिका देखें) और / या ब्लीच के साथ सफाई करने से पहले साइटोमीटर को 2 एमएम ईडीटीए के साथ साफ करना सीए2 + बिल्डअप को कम करता है। एक अंतिम चेतावनी लॉजिस्टिक मॉडलिंग के लिए है। सॉल्वर प्लगइन कई बार एक स्थानीय न्यूनतम मान में "अटक" जाएगा जो इष्टतम फिट प्रदान नहीं करता है। इन मामलों में, मैन्युअल रूप से पैरामीटर बदलने और सॉल्वर को फिर से चलाने से मॉडल में सुधार हो सकता है। जब पूर्ण लॉजिस्टिक वक्र प्रदान नहीं किया जाता है, तो सॉल्वर एल के लिए बड़े मूल्यों को भी विस्तारित कर सकता है। एक पूर्ण लॉजिस्टिक वक्र उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त डेटा बिंदु एकत्र करना महत्वपूर्ण है। यदि खुराक-प्रतिक्रिया वक्र को लॉजिस्टिक वक्र के साथ आसानी से मॉडलिंग नहीं किया जा सकता है, तो एलसी50 मानों को अपरिभाषित छोड़ दिया जा सकता है (उदाहरण के लिए, > 4,000 एचयू / एमएल), या एक अलग वक्र डेटा के लिए फिट हो सकता है।

एक बार एसएलओ की सबलाइटिक खुराक निर्धारित होने के बाद, एसएलओ के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का परीक्षण किया जा सकता है। एल मेजर में एमईके-ईआरके मार्ग में एंटीबॉडी का परीक्षण करके सिद्धांत का प्रमाण प्रदान किया गया था क्योंकि एमईके सक्रियण स्तनधारी कोशिकाओं में एसएलओ के खिलाफ मरम्मत के ~ 70%को नियंत्रित करता है। फॉस्फो-एमईके एंटीबॉडी ने ~ 120 केडीए बैंड का पता लगाया जो एमआरके 1 के अनुरूप है। 55 केडीए पर अपेक्षित एलएमएक्सएमकेके होमोलॉग के मजबूत फॉस्फोराइलेशन का पता नहीं लगाया गया था। हालांकि, एमईके एंटीबॉडी ने एमआरके 1 और एलएमएक्सएमकेके दोनों के अनुरूप बैंड का पता लगाया। फॉस्फो-ईआरके एंटीबॉडी ने ~ 120 केडीए और 55 केडीए पर बैंड का भी पता लगाया। 55 केडीए बैंड एमएपी5 के आकार के अनुरूप है। इस परख में ईआरके एंटीबॉडी मजबूत नहीं था। इन प्रोटीनों की पहचान की पुष्टि करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री या अन्य तरीकों की आवश्यकता होगी। एमईके 1/2 और ईआरके 1/2 के लीशमैनियल होमोलॉग के फॉस्फोराइलेशन को विष चुनौती से स्वतंत्र रूप से पाया गया था। कुल मिलाकर, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित विष की एक उप-इलेक्ट्रोलाइटिक खुराक का उपयोग पश्चिमी सोख्ता जैसे डाउनस्ट्रीम परख में किनेसेस का पता लगाने के लिए किया गया था।

पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के साथ चेतावनी भी मौजूद है। विशेष रूप से, अधिकांश वाणिज्यिक एंटीबॉडी विशेष रूप से लीशमैनियल प्रोटीन के खिलाफ नहीं उठाए जाते हैं। इसके बजाय, अन्य जीवों में होमोलॉग को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी को पहले मान्य और टाइटरेट किया जाना चाहिए। नमूना तैयार करने से अंतिम धब्बा परिणाम पर प्रभाव पड़ सकता है। नमूना बफर में कम करने वाले एजेंट, 2-मर्काप्टोएथेनॉल, को सेल पेलेट में एसडीएस नमूना बफर को जोड़ने से पहले तुरंत जोड़ा जाना चाहिए। जबकि पुन: निलंबित सेल छर्रों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, वे कई फ्रीज / पिघलना चक्रों से बच नहीं पाते हैं। लीशमैनिया में एमएपी जैसे समरूप प्रोटीन को लक्षित करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी को पश्चिमी धब्बों पर उच्च गुणवत्ता वाले बैंड के लिए रात भर धब्बों के साथ इनक्यूबेट करने की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान द्वारा पीएके और केजेड (सीओ-आई) और आर01एआई139198 को केजेड (सीओ-आई) अनुदान आर 21एआई 156225 और केजेड (सीओ-आई) द्वारा समर्थित किया गया था। सीएच इस अध्ययन के समय प्रदान किए गए शिक्षण सहायक के लिए जैविक विज्ञान विभाग को स्वीकार करना चाहता है।

अध्ययन के डिजाइन में फंडिंग एजेंसियों की कोई भूमिका नहीं थी; डेटा के संग्रह, विश्लेषण या व्याख्या में; पांडुलिपि के लेखन में; न ही परिणामों को प्रकाशित करने के निर्णय में। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि फंडिंग एजेंसियों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है। लेखक घोषित करते हैं कि उनके पास हितों का कोई प्रतिस्पर्धी टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए कील और झांग लैब्स के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक सुविधाओं के उपयोग के लिए कला और विज्ञान माइक्रोस्कोपी कॉलेज को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.2 mL microtiter (Marsh) tubes Fisher 02-681-376 Cytotoxicity assay
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher 05-408-129 Toxin dilutions
15 mL centrifuge tube  Avantor VWR (Radnor, PA) 89039-666 To hold cells and media
1x Phosphate buffered saline (PBS) Fisher BP399 For cell processing
3% H2O2  Walmart  (Fayetteville, AR) N/A For ECL
5x M199 Cell-gro 11150067 Basal growth media for L. major promastigotes
Biosafety cabinet Baker To culture cells in sterile conditions
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BP1605-100 Fraction V acceptable purity
CaCl2 Fisher BP510-100 Stock concentration 100 mM
Centrifuge Thermo Fisher  Heraeus Megafuge 40R To pellet the cells from culture
Cy5 Mono-reactive dye pack Cytiva (Marlborough, MA) PA25031 Fluorophore label for toxins
Digital dry bath Benchmark BSH1002 To denature protein samples
EGTA Amresco 0732-100G Stock concentration 0.5 M
Excel Microsoft (Redmond, VA) Data analysis software
Flow cytometer (4-laser Attune NxT) Fisher Cytometer for data acquisition
FlowJo BD (Ashland, OR) Software
Formaldehyde Fisher BP531-500 Fixative for counting cells
G418 Fisher BP673-1 Selection agent for cells
Hellmanex III Sigma Z805939 Dilute 1:4 for cleaning cytometer
Hemacytometer Fisher 0267151B For counting cells
Human red blood cells Zen-bio (Durham, NC) SER-10MLRBC To validate toxin activity
Ice bucket
Light microscope Nikon Eclipse 55i To visualize cells
Nitrocellulose Fisher 88018 For probing proteins via antibodies
Pipettors and tips Avantor VWR To dispense reagents
Power supply Bio-Rad To run SDS-PAGE and transfers
Propidium iodide Biotium 40016 Stock concentration 2 mg/mL in water
Protein ladder Bio-Rad 161-0373 To determine molecular weight of proteins
SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) Bio-Rad 165-3302 To separate proteins based on their size
Sealing tape R&D DY992 To seal plates with cells
Streptolysin O C530A plasmid insert Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7)
Streptolysin O C530A toxin Lab purified Specific activity  4.34 x 105 HU/mg
Swinging bucket rotor Thermo Fisher  75003607 To centrifuge cells
V-bottom plate Greiner Bio-one 651206 For cytotoxicity assay
Vortex Benchmark BV1000 To mix cells
Western blot imaging system (Chemi-doc) Bio-Rad To visualize proteins by western blot
Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) Bio-Rad 170-3930 Transfer proteins to nitrocellulose
Whatman Filter paper GE Healthcare Life Sciences 3030-700 Used in transfer of proteins to nitrocellulose
Antibody
Anti-ERK antibody Cell Signaling Technologies  Cat# 9102S Rabbit (1:1000 dilution)
Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody CreativeBioLabs  Cat# WIC79.3 Mouse (1: 1000)
Anti-MEK antibody Cell Signaling Technologies  Cat# 9122L Rabbit (1:1000)
Anti-mouse IgG, HRP conjugate Jackson Immunoresearch  Cat#715-035-151 Donkey (1:10000)
Anti-phosphoERK antibody Cell Signaling Technologies  Cat# 9101S Rabbit (1:1000)
Anti-pMEK antibody Cell Signaling Technologies  Cat# 9121S Rabbit (1:1000)
Anti-rabbit IgG, HRP conjugate Jackson Immunoresearch  Cat#711-035-152 Donkey (1:10000)
Anti-tubulin antibody Sigma Cat# T5168 Mouse (1: 2000)
Leishmania major Genotypes  Reference: 13
Episomal addback (spt2-/+SPT2) Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2
Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2-) Δspt2::HYG/Δspt2::PAC 
Wild type (WT) LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P)

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 188 इनोसिटोल फॉस्फोरिलसेरामाइड साइटोटॉक्सिसिटी झिल्ली की मरम्मत छिद्र बनाने वाला विष स्टेरोल स्फिंगोलिपिड
<em>लीशमैनिया प्रमुख</em> का उपयोग करके पोर-बनाने वाले विषाक्त पदार्थों के आणविक तंत्र और कार्य को समझना
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Haram, C. S., Moitra, S., Keane, R., Breslav, E., Zhang, K., Keyel, P. A. Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major. J. Vis. Exp. (188), e64341, doi:10.3791/64341 (2022).

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