Artigo de método

Detecção de alvos baseada em aptâmero facilitada por uma reação de amplificação exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 estágios

DOI:

10.3791/64342

⸱

6 de outubro de 2022

 ,  , 
1Aptagen LLC

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo demonstra o uso de um ensaio rápido de amplificação exponencial baseado em aptâmeros de 3 estágios para detectar alvos. A preparação da amostra, a amplificação do sinal e o desenvolvimento da cor são abordados para implementar este sistema para reconhecer a presença de teofilina sobre a cafeína.

Resumo

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Os aptâmeros são moléculas de reconhecimento de alvos que se ligam com alta afinidade e especificidade. Essas características podem ser aproveitadas para controlar outras moléculas com capacidade de geração de sinal. Para o sistema aqui descrito, o reconhecimento do alvo através de um domínio aptamérico, o Tronco II de uma ribozima de cabeça de martelo modificada, ativa a ribozima autoclivagante, estabilizando o construto inicialmente não estruturado. O RNA de clivagem cis atua na junção do Tronco III e do Tronco I, criando dois produtos de clivagem. O produto de clivagem mais longa prepara uma reação de amplificação exponencial isotérmica (EXPAR) dos dois G-quadruplexes cataliticamente ativos semelhantes. Esses produtos de amplificação resultantes catalisam a redução da peroxidase, que é acoplada à redução de um substrato colorimétrico com uma saída que o olho nu pode detectar. O sistema de 3 partes descrito no presente estudo melhora as modalidades de detecção, como ensaios imunoenzimáticos (ELISAs), produzindo um sinal visualmente detectável para indicar a presença de tão baixa quanto 0,5 μM de teofilina em apenas 15 minutos.

Introdução

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Os aptâmeros são tipicamente DNA ou RNA de fita simples selecionados através de um processo evolutivo com alta afinidade e especificidade de ligação aos alvosdesejados 1. Além da capacidade de ligação, os aptâmeros podem ser ligados e controlar motivos com funções de saída de sinal2,3, amplificando o referido sinal e melhorando a sensibilidade do sistema. O sistema G-quadruplex isothermal exponencial amplification reaction (GQ-EXPAR) é um sistema de três partes (Figura 1) que desenvolve um sinal visual à medida que componentes sucessivos são adicionados a um único vaso de reação para produzir uma saída visual4. Este sistema permite a detecção de um alvo específico, aqui teofilina, em uma determinada amostra dentro de 15 min usando um fluxo de trabalho simplificado para permitir a detecção rápida e específica de um alvo de interesse. Este método deve ser considerado para amostras em que a quantificação específica da concentração-alvo é uma preocupação menor do que a elevada especificidade da resposta num curto período de tempo.

Um riboswitch alostérico, uma molécula de RNA de mudança de estrutura (ribozima) que sofre autoclivagem, produz o sinal inicial. Este construto é baseado na ribozima martelo, com um domínio aptamérico introduzido no Tronco II como regulador da atividade de clivagem. Sua função de autoclivagem é ativada quando seu domínio aptamérico é estabilizado ao se ligar ao seualvo5. Caso contrário, o switch ficará inativo em seu estado nativo.

A reação de amplificação exponencial subsequente (EXPAR) utiliza a liberação da fita de RNA autoclivada do primeiro estágio para desencadear uma reação de amplificação isotérmica6. O produto amplificador do EXPAR possui atividade peroxidase7, atuando como base para o último estágio do sistema. Quando alguns substratos são oxidados em conjunto com a quebra de peróxido, eles produzem uma saída fluorescente que pode ser medida em vários instrumentos. Outros substratos comuns podem ser substituídos para produzir um produto colorido para detecção visual. O EXPAR e a atividade peroxidase de seus produtos de amplificação atuam como um intensificador de sinal em 2 estágios, aumentando a sensibilidade a níveis maiores em comparação com as estratégias convencionais 7,8.

A detecção de teofilina versus cafeína é utilizada como exemplo da especificidade dessa plataforma de detecção, pois diferem por apenas um grupo metila (Figura 2). Esta demonstração do sistema produz uma saída colorimétrica para detecção visual de pelo menos 500 nM teofilina.

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Protocolo

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Ver quadro suplementar 1 (quadro de configuração das reacções) para a preparação dos tubos, incluindo os volumes e concentrações específicos dos componentes da reacção. O protocolo aqui demonstrado utiliza um kit de plataforma de detecção pré-montado, conforme descrito na Tabela de Materiais. Todos os componentes devem ser mantidos no gelo, salvo indicação em contrário.

1. Preparação da ribozima

NOTA: O componente primário de detecção é uma ribozima alostérica (regulada por aptâmero) que reconhece teofilina (ver Tabela Suplementar 2).

  1. Coletar 5 U de polinucleotídeo quinase T4 (0,5 μL, ver Tabela de Materiais) em um tubo de PCR, que será usado para ativar os produtos de clivagem de ribozimas.
    NOTA: Este componente é adicionado primeiro para que o usuário possa ver a distribuição correta da enzima.
  2. Adicionar 1 μL de tampão de ribozima 5x pré-preparado (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra (tubo de PCR).
  3. Para efeitos de demonstração visual da especificidade, adicionar 1,5 μL de teofilina 2 mM (alvo) ou 2 mM de cafeína (controlo) (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra como amostras de ensaio.
    NOTA: Para estabelecer uma curva padrão, recomenda-se iniciar com 3,125 mM de analito e testar diluições de cinco vezes até 0,001 mM.
  4. Misture bem cada tubo de amostra pipetando 5-10 vezes.
  5. Adicionar 2 μL de ARN de 600 nM contendo um domínio aptamérico específico para o alvo (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra para obter uma concentração final de 240 nM em 5 μL de solução de ensaio, em seguida, misturar rapidamente por pipetagem e colocar num bloco frio para minimizar o sinal de fundo.
    NOTA: é importante preparar inicialmente todas as reações sem ribozima, pois a reação de autoclivagem começará imediatamente quando a ribozima for combinada com tampão ribozima e pode produzir fundo significativo.
  6. Uma vez preparados todos os tubos de reação, incubar cada amostra (5 μL) à temperatura ambiente (23 °C) por exatamente 3 min usando um temporizador. Devolver imediatamente os tubos de amostra ao gelo (4 °C) após a incubação.

2. GQ-EXPAR

  1. Adicionar 3,5 μL de mistura enzimática nickase-polimerase (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra e misturar bem.
    NOTA: As concentrações enzimáticas necessárias dependem das sequências de reconhecimento, tipos de enzimas e temperaturas de reação, cuja combinação foi determinada empiricamente.
  2. Adicionar 31,5 μL de mistura de reacção EXPAR contendo molde, nucleótidos e tampão de reacção (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra e pipeta a misturar.
    NOTA: As concentrações dos componentes são otimizadas com base nas enzimas e sequências dos produtos da polimerase.
  3. Uma vez preparadas todas as amostras, incubar cada amostra preparada (40 μL) a 55 °C durante exactamente 5 minutos utilizando um temporizador. Se possível, incubar em um termociclador, embora uma tampa aquecida seja desnecessária.
  4. Devolver imediatamente os tubos de amostra ao gelo (4 °C) após a etapa de incubação.

3. Desenvolvimento de cores

  1. Adicionar 2 μL de solução de hemina (25 uM, ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra e misturar bem.
  2. Adicionar 58 μL da solução de TMB comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra e misturar bem.
  3. Incubar a reação de desenvolvimento de cor (100 μL) à temperatura ambiente por pelo menos 3 min e até 30 min.
    NOTA: (Opcional) O desenvolvimento da cor pode ser interrompido pela adição de 20 μL de ácido sulfúrico 2 M.
  4. Leia as amostras qualitativamente a olho nu, ou quantifique os resultados usando um leitor de placas de absorbância a 450 nm se as reações de desenvolvimento de cor forem interrompidas usando ácido sulfúrico.

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Resultados

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A plataforma de detecção representada na Figura 1 converte o reconhecimento do alvo aptamérico em diferenças visualmente distintas entre as preparações da amostra (alvo versus não-alvo, Figura 2) em um curto período de tempo. Uma ribozima alostérica identificada por Soukup et al.5 serviu como ponto de partida para a criação de uma sequência menos ruidosa com resposta ao alvo sobre as amostras controle e negativas. O construto otimizado fo...

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Discussão

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O método aqui apresentado aproveita a transição entre uma estrutura secundária inicialmente desordenada em uma ribozima alostérica e a estabilidade adicional conferida pela ligação do alvo ao domínio aptamérico para ativar a ribozima cis-cleave. A estabilidade da ribozima foi ajustada para minimizar a atividade catalítica na ausência do alvo, permitindo a ligação do alvo para restaurar a estrutura ativa. Além disso, deve-se tomar cuidado para equilibrar os tampões das múltiplas enzimas necessárias para facilitar o desenv...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptagen, LLC fabrica e comercializa um Kit de Demonstração GQ-EXPAR para aqueles que querem experiência direta com um sistema de detecção baseado em aptâmero.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Research and Development Funding da Aptagen LLC.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de dicloridrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) com H2O2, "Solução de substrato de micropoço MaxSignal TMB"Reagente de desenvolvimento de cor PerkinElmerFOOD-1806-1000. Minimize a exposição à luz e à atmosfera. Anteriormente BIOO Scientific número de catálogo 1806.
Fornecido no Kit de Demonstração Apta-beacon como Tubo 3-2.
5'- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotina-3'Integrated DNA Technologies (IDT)Modelo de DNA QtQ47 otimizado personalizado para EXPAR produzir G-quadruplex, preparado por G-quadruplex. Isso é usado para a parte "exponencial" do EXPAR, para aumentar rapidamente a quantidade de DNAzyme usada para o desenvolvimento de cores da Etapa 3. O modelo inclui uma 3'-biotina para evitar a extensão não intencional pela DNA polimerase Bst 2.0 durante EXPAR.
Parte do Kit de Demonstração Apta-beacon Tubo 2-2.
5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3'Tecnologias Integradas de DNA (IDT)Sequência deribozima alostérica de reconhecimento de teofilina personalizada (ribozima autoclivada regulada pelo domínio aptâmero de RNA para teofilina) modificada de Soukup et al.
Soukup, G. A., Emilsson, G. A., e Breaker, R. R. (2000) Alterando o reconhecimento molecular de aptâmeros de RNA por seleção alostérica, Journal of molecular biology 298, 623-632.
Fornecido no Kit de Demonstração Apta-beacon como Tubo 1-3.
5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotina-3'Integrated DNA Technologies (IDT)Modelo de DNA P3tQ49 otimizado personalizado para EXPAR produzir G-quadruplex, preparado por produto de clivagem P3. Isso é usado na Etapa 2 para traduzir o produto de clivagem em DNAzyme usado para o desenvolvimento da cor da Etapa 3. O modelo inclui uma 3'-biotina para evitar a extensão não intencional pela DNA polimerase Bst 2.0 durante EXPAR.
Parte do Kit de Demonstração Apta-beacon Tubo 2-2.
5x Ribozyme BufferAptagen, LLCN/A5x composição: 600 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Usado na etapa 1.
fornecido no kit de demonstração do Apta-beacon como tubo 1-4.
Kit de demonstração Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB)Aptagen, LLCGQ-EXPAR-TMBO kit de demonstração mostra a especificidade do ensaio colorimétrico detectando alvos difíceis de pequenas moléculas, teofilina versus cafeína, que diferem apenas por um único grupo metil. 
Bst 2.0 DNA polimeraseNew England BiolabsM0537SPolimerase de amplificação isotérmica com atividade de deslocamento de fita. Parte da mistura de nickase-polimerase, preparada a 9.375 U/uL.
Parte do tubo do kit de demonstração Apta-beacon 2-1.
Tampão 3.1New England BiolabsB6003SVIALCombinado com 2 uL de tampão de amplificação isotérmica 10X e 27,5 uL de água livre de nuclease para produzir tampão EXPAR 1,11X em EXPAR Mix. Este produto substitui o B7203SVIAL usado anteriormente que fazia parte do desenvolvimento inicial do sistema (mesma composição, exceto BSA não recombinante).
Parte do Kit de Demonstração Apta-beacon Tube 2-2.
CafeínaSigma-AldrichC0750-100GContra-alvo do Aptamer (controle), preparado com água livre de nuclease.
Fornecido no Kit de Demonstração Apta-beacon como Tubo 1-1.
dNTPsNew England BiolabsN0447SParte da mistura de reação EXPAR.
Parte do Kit de Demonstração Apta-beacon Tubo 2-2.
Mistura de reação EXPARAptagen, LLCN/A0,44 mM dNTPs, 0,38 μ M P3tQ49, 0,38 μ M QtQ47, 44,44 mM Tris-HCl (pH 8,4), 63,5 mM NaCl, 31,5 mM KCl, 6,35 mM MgCl2, 1,27 mM MgSO4, 6,35 mM (NH4)2SO4, 63,5 μ g/ml BSA, 0,0635% Tween 20.
Parte do tubo do kit de demonstração Apta-beacon 2-2.
HeminSigma-AldrichH9039ressuspenso em DMF a uma concentração final de 25 uM.
Fornecido no kit de demonstração Apta-beacon como tubo 3-1.
Tampão de amplificação isotérmicaNew England BiolabsB0537SVIALcombinado com 2 uL de 10x Buffer 3.1 e 27.5 µ L de água livre de nuclease para produzir 1,11x EXPAR Buffer em EXPAR Mix.
Parte do Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2Amresco (VWR)E525-500MLCofator de ribozima Hammerhead, necessário para a autoclivagem.
Parte do kit de demonstração Apta-beacon Tubo 1-3.
Termociclador MJ PTC-100MJ Research, Inc.Termociclador PTC-100para controlar as temperaturas de incubação. Qualquer termociclador ou bloco quente pode ser usado.
N, N-Dimetilformamida (DMF)Sigma-Aldrich227056-100MLUsado para ressuspender a hemina e maximizar a vida útil no freezer.
Parte do Kit de Demonstração Apta-beacon Tubo 3-1.
Mistura de Nickase-polimeraseAptagen, LLCN/ANt.BstNBI (9.375 unidades/μ L) e Bst 2.0 DNA polimerase (0,5 unidades/μ L).
Fornecido no kit de demonstração Apta-beacon como tubo 2-1.
Nt.BstNBINew England BiolabsR0607SEnzima de corte para permitir amplificação isotérmica contínua. Parte da mistura de nickase-polimerase, preparada a 0,5 U/uL.
parte do tubo do kit de demonstração Apta-beacon 2-1.
Tampão de quinase T4New England BiolabsB0201SVIALTampão para enzima necessária para remover fosfato cíclico.
Parte do tubo do kit de demonstração Apta-beacon 1-4.
Polinucleotídeo quinase T4New England BiolabsM0201SRemove fosfato cíclico pós-clivagem para permitir que o produto de clivagem prepare a reação de amplificação isotérmica.
Fornecido no kit de demonstração Apta-beacon como tubos de PCR.
Tecan GENios FLTecanGenios-FL TWTLeitor de placas para medir o sinal de absorbância a partir dos resultados da Etapa 3.
Alvo de Apamero TheophyllineSigma-AldrichT1633-50G, preparado com água livre de nuclease.
Fornecido no Kit de Demonstração Apta-beacon como Tubo 1-2.
Tris-HClAmerican BioanalyticalAB14043-01000Tampão de ligação Aptâmero.
Parte do Kit de Demonstração Apta-beacon Tubo 1-4.

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
  3. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
  4. Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
  5. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
  6. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
  7. Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
  8. Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
  9. Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
  10. Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).

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