Artigo de método

Uma abordagem de imagem intravital fluorescente para estudar a dinâmica de sinalização de cálcio induzida por carga em osteócitos de camundongos

DOI:

10.3791/64366

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24 de fevereiro de 2023

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1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Sibley School of Mechanical and Aerospace Engineering, Cornell University, 3Department of Biomedical Engineering, The City College of New York, 4Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Orthopaedic Surgery, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine

Neste artigo

Resumo

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O presente artigo descreve a realização de uma abordagem de imagem intravital para observar a sinalização de cálcio induzida mecanicamente de osteócitos embutidos in vivo em tempo real em resposta à carga mecânica em nível de tecido do terceiro metatarso do camundongo.

Resumo

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O tecido ósseo é extremamente sensível às diferenças na magnitude da carga mecânica. Os osteócitos, células dendríticas que formam um sincício em todo o osso, são responsáveis pela função mecanosensorial do tecido ósseo. Estudos que empregam histologia, modelagem matemática, cultura de células e culturas de órgãos ósseos ex vivo avançaram muito na compreensão da mecanobiologia dos osteócitos. No entanto, a questão fundamental de como os osteócitos respondem e codificam informações mecânicas no nível molecular in vivo não é bem compreendida. As flutuações da concentração intracelular de cálcio nos osteócitos oferecem um alvo útil para aprender mais sobre os mecanismos agudos de mecanotransdução óssea. Aqui, relatamos um método para estudar a mecanobiologia dos osteócitos in vivo, combinando uma cepa de camundongo com um indicador de cálcio codificado geneticamente fluorescente expresso em osteócitos com um sistema de carregamento e imagem in vivo para detectar diretamente os níveis de cálcio dos osteócitos durante o carregamento. Isso é conseguido com um dispositivo de flexão de três pontos que pode fornecer cargas mecânicas bem definidas ao terceiro metatarso de camundongos vivos enquanto monitora simultaneamente as respostas de cálcio indicadas por fluorescência dos osteócitos usando microscopia de dois fótons. Esta técnica permite a observação direta in vivo dos eventos de sinalização de cálcio dos osteócitos em resposta à carga óssea total e é útil no esforço de revelar mecanismos na mecanobiologia dos osteócitos.

Introdução

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A matriz óssea é organizada de acordo com a demanda mecânica 1,2 e pode mudar dinamicamente para levar em conta as mudanças nas necessidades mecânicas 3,4,5. Um trabalho seminal sobre o mecanismo mecanossensorial no osso foi publicado como um artigo de modelagem há cerca de 30 anos 6,7,8, onde foi proposto que os osteócitos embutidos no osso detectam a deformação mecânica do nível do tecido por meio do movimento do fluido em seu ambiente local. Esse modelo foi validado experimentalmente com experimentos in vitro e ex vivo, onde foi claramente demonstrado que os osteócitos são bastante mecanossensíveis1,2,3,4,5,6 e também expressam citocinas, que direcionam o comportamento dos osteoblastosde construção óssea7 e osteoclastos8,9,10, 11,12.

A sinalização de cálcio é um segundo mensageiro onipresente que foi estabelecido como uma figura central e um alvo experimental confiável na mecanobiologia dos osteócitos 13,14,15,16. A sinalização de cálcio tem a vantagem de ser amplamente estudada em biologia celular17, o que significa que muito se sabe sobre seus efeitos a jusante e as ferramentas fluorescentes correspondentes disponíveis para observação experimental. Análises in vitro têm utilizado a sinalização de cálcio como meio de identificar a ativação mecânica dos osteócitos e caracterizar o comportamento de sinalização dinâmica 5,18,19. É importante notar que a observação da sinalização de cálcio em uma linhagem celular de osteócitos forneceu evidências definitivas de que a ativação de fluidos nas ligações de integrina ao longo do processo celular é provavelmente a principal forma de ativação do fluxo de fluido20. Este estudo é um dos muitos que mostram a utilidade da sinalização de cálcio. É induzido de forma confiável com a ativação mecânica de osteócitos e, portanto, serve como um alvo potente para interrogar a mecanobiologia dos osteócitos.

A mecanotransdução de osteócitos in vivo é altamente dependente de seu microambiente imediato. As proteínas de ligação à matriz (por exemplo, proteoglicanos, integrinas) fornecem ligações funcionais entre as membranas celulares dos osteócitos em um arranjo que é crítico para a ativação fluida da célula21,22. Embora as análises in vitro bidimensionais (2D) sejam úteis, elas são limitadas porque não incorporam esses recursos tridimensionais (3D) críticos. Preparações ex vivo de sinalização de cálcio de osteócitos usando microscopia confocal lançaram alguma luz sobre como os osteócitos respondem, mantendo a matriz circundante intacta13,16. No entanto, acredita-se que a remoção do suprimento sanguíneo do osso altere os nutrientes e a dinâmica dos fluidos do sistema lacunocanalicular. A interrogação da mecanobiologia dos osteócitos requer investigação in vivo da sinalização dos osteócitos induzida por carga.

A investigação in vivo de células embutidas no osso tem sido amplamente dificultada pelas limitações das técnicas tradicionais de imagem, como campo claro e microscopia confocal. Os osteócitos estão posicionados em uma matriz mineralizada23 composta por hidroxiapatita, colágeno tipo 1 e outras proteínas não colágenas que limitam a acessibilidade óptica24 e tornam a investigação in vivo tecnicamente desafiadora. No entanto, avanços recentes em imagens fluorescentes não lineares e repórteres de cálcio geneticamente codificados apresentam a oportunidade de superar esses desafios.

Aqui, relatamos uma nova abordagem com a capacidade de imagem de osteócitos in vivo para medir a sinalização de cálcio com resolução de nível celular25. Isso é conseguido usando um marcador fluorescente dinâmico usando um indicador de cálcio geneticamente codificado pela primeira vez em osteócitos de camundongos. Camundongos com expressão direcionada a osteócitos impulsionados por DMP1-Cre de GCaMP6f exibem fluorescência visível em osteócitos em todo o córtex diafisário de metatarsos de camundongos 17,26. Usamos um sistema de flexão de três pontos para aplicar níveis fisiológicos de magnitude de deformação entre 250-2.000 με27. Esta técnica permite a visualização in vivo da dinâmica da sinalização do cálcio dos osteócitos durante a carga mecânica de todo o osso e pode ser útil para qualquer pessoa que busque entender a mecanobiologia dos osteócitos. Este método seria apropriado para pesquisadores que buscam expandir seu trabalho de análises in vitro para aplicações in vivo, especialmente mantendo análises moleculares de base funcional (ou seja, investigando a atividade celular via sinalização de cálcio) em oposição a estudos de fenotipagem de base ampla.

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Protocolo

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Todos os métodos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Cornell.

1. Preparação de materiais e equipamentos

  1. Projete e construa o dispositivo de carregamento metatarsal para uso com um microscópio multifotônico suspenso.
    NOTA: Os detalhes das especificações dos componentes e da operação do dispositivo estão descritos na documentação suplementar de um estudo anterior25. Resumidamente, os principais componentes consistem em um atuador em série com uma célula de carga e suporte de carga, um banho-maria e um pino de apoio. O atuador e a célula de carga podem ser obtidos comercialmente e devem ser capazes de acomodar cargas de até 300 g. O banho-maria, o pino de apoio e o suporte de carga devem ser construídos em titânio ou aço inoxidável. Eles podem ser fabricados internamente ou comercialmente por meio de impressão 3D em metal.
  2. Calibre os valores de magnitude da deformação para o deslocamento do atuador com antecedência para grupos individuais de camundongos (ou seja, sexo, tratamento, genótipo). Isso é feito usando o mapeamento de deformação de superfície em um procedimento descrito em um estudo anterior25.
  3. Use camundongos com fundo C57BL / 6, com idade entre 16 e 18 semanas, que expressem construções indicadoras de cálcio fluorescente nos osteócitos. A expressão direcionada de osteócitos é alcançada pelo cruzamento de camundongos GCaMP6f e Dmp1-Cre ativados por flox. Os detalhes das estratégias de reprodução e fornecedores de camundongos fundadores são descritos em um estudo publicado anteriormente25.
  4. Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas, suporte de carga, banho-maria e pino de fulcro usando uma autoclave (57.2 °C, 15 psi, 3-4 min). Desinfete as objetivas do microscópio com 100% de etanol.
  5. Ligue os componentes eletrônicos, incluindo fonte de laser, microscópio, célula de carga e atuador. Aguarde de 15 a 20 minutos para que cada componente aqueça antes da imagem intravital.
    1. Certifique-se de que os componentes do atuador e da célula de carga estejam conectados e ativados no dispositivo de controle. Gere o software de controle com uma variedade de plataformas, incluindo Matlab, LabView e Python, de acordo com as preferências do usuário. O principal código Matlab usado neste estudo é chamado Actuator_Control_Software_withLoadCell.m (dentro da pasta MT3 Loading Device Control Software.zip Supplementary File 1).
      NOTA: A maioria dos sistemas de microscópio de dois fótons disponíveis comercialmente vem com um software de imagem robusto. Os principais recursos necessários para este método são a capacidade de ajustar um laser para a excitação apropriada para GCaMP6f (920 nm), a capacidade de ajustar a intensidade da potência do laser e uma coleção de séries temporais com uma frequência de pelo menos 6 Hz. Antes da experimentação, a conexão do laser ao software de imagem e o arranjo apropriado do caminho da luz para imagens de dois fótons devem ser confirmados. Isso é confirmado de maneiras diferentes, dependendo da configuração da imagem. Normalmente, há um indicador luminoso.

2. Cirurgia

  1. Prepare um estágio cirúrgico e esterilize a superfície com etanol a 70%. Certifique-se de que as técnicas assépticas sejam empregadas durante os procedimentos cirúrgicos. Mantenha o nível de limpeza necessário para este protocolo, pois é um procedimento terminal.
  2. Anestesie o camundongo com isoflurano vaporizado misturado com ar ou oxigênio de grau médico a uma vazão de 1 L/min. Realize a anestesia inicial em uma câmara de indução de roedores com isoflurano a 3% -5%. Mantenha a anestesia a 1% -2,5% de isoflurano em um cone nasal para procedimentos cirúrgicos e de imagem intravital.
  3. Coloque um dispositivo de aquecimento embaixo ou ao lado do mouse para ajudar a manter a temperatura corporal homeostática. Monitore a temperatura corporal, a frequência cardíaca e a saturação de oxigênio do camundongo durante a cirurgia. Mantenha a frequência respiratória entre 60-80 respirações por minuto e mantenha-a ajustando a dosagem de isoflurano.
  4. Coloque o mouse em decúbito dorsal. Confirme a profundidade da anestesia antes da incisão por meio de uma pitada no dedo do pé. Identifique a localização entre o segundo e o terceiro metatarsos. Faça uma incisão em bisturi através da derme entre o segundo e o terceiro metatarsos, começando na extremidade distal e progredindo proximalmente ao longo do comprimento dos ossos (~ 5 mm).
    NOTA: Os metatarsos são distais aos ossos do tornozelo na pata e seguem diretamente proximais às falanges distais. Eles consistem em metatarsos (medial a lateral) I, II, III, IV e V. O terceiro metatarso está centrado no meio do aspecto volar da pata traseira.
  5. Usando uma pinça, abra o local da cirurgia puxando a pele em direção às bordas medial/lateral. Ressecção os tendões extensores usando uma tesoura de Vannas reta para expor o terceiro metatarso.
  6. Insira o pino de fulcro central do dispositivo de carregamento metatarsal abaixo do terceiro metatarso.
    1. Inicialmente, insira o pino no pequeno espaço na extremidade distal onde o terceiro metatarso encontra a falange proximal e, em seguida, mova o pino proximalmente até que ele repouse no meio da diáfise do terceiro metatarso.
    2. Tome especial cuidado para garantir uma interface direta entre o osso e o pino, excluindo qualquer músculo e face. Isso é fundamental para imagens estáveis durante os protocolos de carregamento.
  7. Segure o tornozelo com uma pinça e coloque o pé no banho-maria cheio de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco (8-10 mL). Prenda a pata no lugar com o suporte de carga e conecte o suporte ao arranjo do atuador/célula de carga. Uma preparação cirúrgica completa e arranjo dentro do dispositivo é mostrado na Figura 1.

3. Exames de imagem

NOTA: A configuração completa de microscopia de dois fótons usada neste protocolo tem dois pacotes de software: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 para o laser (Figura 2) e ThorImageLS4.0 para o microscópio (Figura 3). Para criar imagens nos dois fótons, pressione Live (Figura 3, botão azul de reprodução). Ao realizar um experimento para criar imagens e salvar dados, pressione Capturar (Figura 3, a guia na parte superior, ao lado de Configuração de captura). Estes são específicos para o equipamento e os fornecedores usados neste experimento, mas muitas alternativas com as especificações necessárias encontradas neste protocolo (comprimentos de onda de excitação, tamanho da janela visível, taxa de captura de imagem, etc.) também funcionariam.

  1. Pegue com muito cuidado a configuração do dispositivo de carregamento com o mouse e coloque-a na plataforma do microscópio.
  2. Comece com uma objetiva de baixa ampliação no modo de epifluorescência (Figura 3, menu suspenso na parte superior com as seleções Multifotônica ou Configuração de Fluorescência) para localizar e centralizar a diáfise média do osso.
  3. Depois que uma região de interesse for localizada, mude para uma ampliação de objetiva de imersão em água mais alta (20x-40x) e mude a óptica para dois fótons (Figura 3, menu suspenso na parte superior com as seleções Multifóton ou Configuração de fluorescência).
    NOTA: O tamanho de campo de visão recomendado é de pelo menos 250 μm x 250 μm para atividade celular e pode ser obtido com zoom óptico ou digital, dependendo do sistema de imagem.
    1. A densidade mínima de pixels adequada é de 512 pixels x 512 pixels. Para definir a densidade de pixels, use as configurações de Controle de Área de Galvo/Ressonância (Figura 3).
    2. Ao encontrar o ROI, evite o fotobranqueamento reduzindo a potência usando a opção Power Control (Figura 3) e aumentando a amplificação PMT nas configurações de Galvo/Resonance Scanner Control (Figura 3).
    3. Identifique a superfície do osso no modo de dois fótons procurando a autofluorescência do periósteo fibroso no canal verde que usa um filtro passa-banda centrado em 525 nm.
      NOTA: A autofluorescência é mais visível com o comprimento de onda de excitação a 1.000 nm, mas também está disponível a 920 nm de excitação (Figura 3, Controle de Laser Multifotônico). Este marco é importante para determinar a profundidade relativa da ROI no córtex metatarsal ao observar osteócitos. Deve-se notar que durante experimentos de séries temporais, a profundidade exata do plano fotografado não é registrada, embora tenda a variar entre 15-30 μm. Se as medições exatas de profundidade forem desejadas, uma pilha z teria que ser feita.
  4. Execute um teste de carga para garantir que a preparação cirúrgica e o posicionamento dentro do dispositivo de carga fossem eficazes para alcançar um campo de ROI estável (ou seja, sem deslocamento do plano z). Resumidamente, execute um ciclo de carregamento para avaliar a estabilidade do preparo cirúrgico. Execute o carregamento executando a seção Switch on Servo e Move no código Matlab.
    1. Aplique uma pequena carga de tara. Certifique-se de que os protocolos de carregamento de onda haversine apropriados sejam preparados com antecedência. Insira os parâmetros de carga apropriados obtidos durante a calibração na seção 1.2. Execute o carregamento executando a seção Switch on Servo e Move no código Matlab.
    2. Se houver um movimento visível das células na tela, que vem do micromovimento do osso em resposta à carga ou respiração, selecione um ROI diferente ao longo das direções y ou z para garantir que esteja diretamente sobre o pino de fulcro central. Se o movimento persistir, ajuste a posição cirúrgica do pino manualmente sob o terceiro metatarso.
      NOTA: Uma boa região de interesse (ROI) é aquela em que as células não se movem para dentro e para fora do plano/foco. O movimento nas direções x e y pode ser ajustado para pós-processamento usando o plug-in de correspondência de modelo no ImageJ.
  5. Realize imagens de pilha z ou série t com carregamento de acordo com o projeto experimental para registrar eventos de sinalização morfométricos ou dinâmicos induzidos por carga, respectivamente.
    1. Defina o comprimento de onda de excitação para o indicador fluorescente (por exemplo, 920 nm para GCaMP6f). Para z-stack, use uma resolução baixa o suficiente para capturar características dos osteócitos, como passos de 0,25-1 μm. Para a série t, use as configurações para amostrar pelo menos 6x a taxa de carregamento. Para uma taxa de carregamento de 1 Hz, a imagem a 6 quadros por segundo (FPS) representa a taxa de captura minimamente apropriada (Figura 3, Galvo/Resonance Scanner Control).
    2. Para carregamento e imagens ao vivo, colete dados de linha de base não carregados a cada sessão. Neste estudo, 60 s de imagem sem carga seguidos por 60 s de carga e imagem são preferidos. Projete os protocolos de carregamento e imagem de acordo. Para coletar dados, pressione Capturar (Figura 3, guia na parte superior, ao lado de Configuração de captura).
      1. O período refratário para uma resposta completa de sinalização de cálcio nas células ósseas é estimado em aproximadamente 15 min28. Aguarde pelo menos esse tempo entre as sessões de carregamento sequencial ao coletar dados de sinalização dinâmica.
      2. Durante todo o experimento, não deixe o animal sozinho para garantir que ele não acorde inesperadamente da anestesia ou sinta angústia sem a oportunidade de intervenção.
        NOTA: A eutanásia no final do procedimento deve ser realizada por luxação cervical ou outras medidas apropriadas de acordo com os métodos aprovados pela IACUC. Este é um protocolo de não sobrevivência, o que significa que todos os animais são sacrificados após a imagem.

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Resultados

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Aqui relatamos uma metodologia para estudar a sinalização de cálcio em osteócitos embutidos in vivo usando preparação cirúrgica aguda e imagens fluorescentes multifotônicas. O sinal fluorescente verde pode ser observado a partir de indicadores de cálcio geneticamente codificados em osteócitos via expressão de DMP1-Cre. A Figura 4 é uma imagem de plano único de osteócitos embutidos. Observe que todas as células são marcadas e expressam fluorescência verde de linha de base, f...

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Discussão

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É difícil estudar experimentalmente os osteócitos devido à sua posição embutida na matriz do tecido duro, para a qual eles se deterioram rapidamente ou se desdiferenciam após a remoção desse nicho. A pesquisa de osteócitos exigiu imensa engenhosidade nas últimas 3 décadas, como a criação de linhagens semelhantes a osteócitos29 , 30 , 31 , o estabelecimento de protocolos para isolar osteócitos pr...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#3 Lidar com bisturiMicroscopia Eletrônica Ciências72040-03Suprimentos cirúrgicos
20x Objetiva de imersão em águaOlympusXLUMPLFLN20XWEsta é uma objetiva de 20x, mas 40x também pode ser usada para este protocolo. Recomendamos imersões em água porque ela precisa ser mergulhada no banho durante a imagem, portanto, a objetiva ao ar livre pode causar aberrações
AM Bickford Omnicon F / AIRAM Bickford80120Uma resposta sensata para problemas de gás anestésico na sala de cirurgia, o filtro de gás anestésico F / AIR foi projetado especificamente para remover gases anestésicos residuais, como isoflurano, Halotano, Enflurano, etc. do ambiente da sala de cirurgia.
Kit A.M. Bickford Omnicon F/AIR AM Bickford80000Um kit completo com tubo e adaptadores para conectar F / AIR à configuração
B6J. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm95.1 (CAG-GCaMP6f) Hze / MwarJThe Jackson Laboratory28865GCaMP6f Camundongos para cruzamento com camundongos Dmp1-Cre
B6N. FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJThe Jackson Laboratory23047Camundongos Dmp1-Cre para cruzamento com camundongos GCaMP6f 
Célula de carga de compressãoFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.905898LCM100, 1000 g, Célula de carga de compressão e tensão subminiatura (miniatura/rosca em linha), RoHS sem chumbo, Material - 17-4 PH S.S., M3x0,5-thread, 34 Awg 4 condutores cabo de poliéster trançado, 5 pés de comprimento
Corning 500 mL DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco), 1x [+] cálcio, magnésioVWR International21-030-CVBanho ionicamente equilibrado que contém cálcio submerge o metatarso durante a imagem
Ferramenta de picareta odontológicaMicroscopia EletrônicaSuprimentos cirúrgicos
Álcool etílico puro 200 prova ACS reagente >99,5%Sigma AldrichSIAL-459844-500MLFinalidades de esterilização
Pino de fulcroBraça N/AFabricado por sinterização direta a laser 3D de aço inoxidável (liga PH1) a partir de arquivos 3D SolidWorks STL. O fornecedor original foi GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, agora adquirida pela FATHOM, as especificações são fornecidas no documento publicado anteriormente Kit
de saída USB220 de alta resolução e velocidadeFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.717435Usado para conectar a célula de carga ao laptop
ImageJ 1.53t com Java 1.8.0_172 (para Windows 64 bits)NIHN / AInstale aqui https://imagej.nih.gov/ij/
IsofluranoPiramal Critical Care66794-013-25100% líquido de vapor de inalação
Suporte de carregamentoBraça N/ AFabricado por sinterização direta a laser 3D de aço inoxidável (liga PH1) a partir de arquivos 3D SolidWorks STL. O fornecedor original foi GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, agora adquirida pela FATHOM, as especificações são fornecidas no documento publicado anteriormente
MATLAB R2019aMathWorksPara executar o dispositivo de carregamento
Vaporizador Matrx VIP 3000 bem preencher isofluranoButler Schein Animal Health14309Vaporizador para anestésico
Oxímetro de pulso Nonin Modelo 2500A Vet2500A Vet
Piezo servo controladorPI-USAE-625Componente eletrônico recomendado pela empresa para ser usado com o atuador
Atuador piezo linear de alta rigidez PiezoMovePI-USAP-602.5SLAtuador para o dispositivo de carregamento
Lâminas de bisturi, nº 10 para alça nº 3, pacote de 100Microscopia Eletrônica Sciences72044-10Material cirúrgico
Pinças de aço inoxidável com pontas afiadas e finas. Comprimento: 120 mmMicroscopia Eletrônica Ciências78326-42Material cirúrgico
Thorlabs Bergamo microscópio multifotônicoThorLabsN/AEste é apenas o sistema de imagem e não tem o laser incluído, embora ThorLabs tenha opções de laser se desejado
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX com Controle Total de Potência (TPC)CoerenteN/AEste sistema tecnicamente possui dois lasers, um ajustável e um fixo. No entanto, para o protocolo, apenas o sintonizável é necessário. 
Tesoura de mola Vannas - 4 mm de pontaFerramentas de Belas Ciências15018-10Suprimentos cirúrgicos
Banho mariaFathomN/AFabricado por sinterização direta a laser 3D de aço inoxidável (liga PH1) a partir de arquivos 3D SolidWorks STL. O fornecedor original foi GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, agora adquirida pela FATHOM, as especificações são fornecidas no documento publicado anteriormente
Ciências de

Referências

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  1. Lu, X. L., Huo, B., Park, M., Guo, X. E. Calcium response in osteocytic networks under steady and oscillatory fluid. Bone. 51 (3), 466-473 (2012).
  2. Wu, D., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Matrix-dependent adhesion mediates network responses to physiological stimulation of the osteocyte cell process. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12096-12101 (2013).
  3. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: A fluid-structure interaction approach. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 85-97 (2013).
  4. Genetos, D. C., Kephart, C. J., Zhang, Y., Yellowley, C. E., Donahue, H. J. Oscillating fluid flow activation of gap junction hemichannels induces atp release from MLO-Y4 osteocytes. Journal of Cellular Physiology. 212 (1), 207-214 (2007).
  5. Lu, X. L., Huo, B., Chiang, V., Guo, X. E. Osteocytic network is more responsive in calcium signaling than osteoblastic network under fluid flow. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (3), 563-574 (2012).
  6. Schaffler, M. B., Kennedy, O. D. Osteocyte signaling in bone. Current Osteoporosis Reports. 10 (2), 118-125 (2012).
  7. Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/ -Catenin signaling is required for normal bone homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
  8. Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
  9. Kennedy, O. D., et al. Activation of resorption in fatigue-loaded bone involves both apoptosis and active pro-osteoclastogenic signaling by distinct osteocyte populations. Bone. 50 (5), 1115-1122 (2012).
  10. Rawlinson, S. C. F., Wheeler-Jones, C. P. D., Lanyon, L. E. Arachidonic acid for loading induced prostacyclin and prostaglandin E2 release from osteoblasts and osteocytes is derived from the activities of different forms of phospholipase A2. Bone. 27 (2), 241-247 (2000).
  11. David, V., et al. Ex vivo bone formation in bovine trabecular bone cultured in a dynamic 3D bioreactor is enhanced by compressive mechanical strain. Tissue Engineering Part A. 14 (1), 117-126 (2008).
  12. Davies, C. M., et al. Mechanically loaded ex vivo bone culture system "Zetos": systems and culture preparation. European Cell & Materials. 11, 57-75 (2006).
  13. Adachi, T., et al. Osteocyte calcium signaling response to bone matrix deformation. Journal of Biomechanics. 42 (15), 2507-2512 (2009).
  14. Huo, B., Lu, X. L., Guo, X. E. Intercellular calcium wave propagation in linear and circuit-like bone cell networks. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 368 (1912), 617-633 (2010).
  15. Morrell, A. E., et al. Mechanically induced Ca2+ oscillations in osteocytes release extracellular vesicles and enhance bone formation. Bone Research. 6, 6(2018).
  16. Jing, D., et al. In situ intracellular calcium oscillations in osteocytes in intact mouse long bones under dynamic mechanical loading. FASEB Journal. 28 (4), 1582-1592 (2014).
  17. Chen, T. -W., Wardill, T. J., Sun, Y., Pulver, S. R., Renninger, S. L. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  18. Jacobs, C. R., Temiyasathit, S., Castillo, A. B. Osteocyte mechanobiology and pericellular mechanics. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 369-400 (2010).
  19. Jing, D., et al. Spatiotemporal properties of intracellular calcium signaling in osteocytic and osteoblastic cell networks under fluid. Bone. 53 (2), 531-540 (2013).
  20. Thi, M. M., Suadicani, S. O., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Mechanosensory responses of osteocytes to physiological forces occur along processes and not cell body and require αVβ3 integrin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21012-21017 (2013).
  21. Wang, Y., McNamara, L. M., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for the role of integrins in flow induced mechanotransduction in osteyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15941-15946 (2007).
  22. McNamara, L. M., Majeska, R. J., Weinbaum, S., Friedrich, V., Schaffler, M. B. Attachment of osteocyte cell processes to the bone matrix. The Anatomical Record. 292 (3), 355-363 (2009).
  23. Franz-Odendaal, T. A., Hall, B. K., Witten, P. E. Buried alive: How osteoblasts become osteocytes. Developmental Dynamics. 235 (1), 176-190 (2005).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  25. Lewis, K. J., et al. Osteocyte calcium signals encode strain magnitude and loading frequency in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11775-11780 (2017).
  26. Lu, Y., et al. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. Journal of Dental Research. 86 (4), 320-325 (2007).
  27. Rubin, C. T., Lanyon, L. E. Dynamic strain similarity in vertebrates; an alternative to allometric limb bone scaling. Journal of Theoretical Biology. 107 (2), 321-327 (1984).
  28. Jacobs, C. R., et al. Differential effect of steady versus oscillating flow on bone cells. Journal of Biomechanics. 31 (11), 969-976 (1998).
  29. Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
  30. Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
  31. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  32. vander Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. Journal of Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).
  33. Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
  34. Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).

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