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Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo

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DOI:

10.3791/64373

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4 de novembro de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMASS Chan Medical School

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para isolamento prospectivo de progenitores eritróides de unidade formadora de explosão precoce (BFU-e) e eritróides de unidade formadora de colônias (UFC-e) diretamente da medula óssea e do baço frescos de camundongos. Este protocolo, desenvolvido com base em dados transcriptômicos de célula única, é o primeiro a isolar todos os progenitores eritróides do tecido com alta pureza.

Resumo

Os primeiros progenitores eritróides foram originalmente definidos por seu potencial de formação de colônias in vitro e classificados em "unidades" formadoras de explosões e formadoras de colônias conhecidas como BFU-e e UFC-e. Até recentemente, métodos para o isolamento prospectivo direto e completo de progenitores puros de BFU-e e CFU-e da medula óssea adulta recém-isolada não estavam disponíveis. Para resolver essa lacuna, um conjunto de dados de RNA-seq de célula única (scRNAseq) da medula óssea de camundongos foi analisado para a expressão de genes que codificam marcadores de superfície celular. Esta análise foi combinada com ensaios de destino celular, permitindo o desenvolvimento de uma nova abordagem citométrica de fluxo que identifica e permite o isolamento de subconjuntos completos e puros de progenitores BFU-e e CFU-e na medula óssea ou baço de camundongos. Esta abordagem também identifica outros subconjuntos progenitores, incluindo subconjuntos enriquecidos para basófilos/mastócitos e potenciais megacariocíticos. O método consiste em marcar células frescas da medula óssea ou do baço com anticorpos direcionados a Kit e CD55. Os progenitores que expressam ambos os marcadores são então subdivididos em cinco populações principais. A população 1 (P1 ou UFC-e, Kit+ CD55+ CD49f med/baixo CD105 med/alto CD71 med/alto) contém todos os progenitores da UFC-e e pode ser subdividida em P1-low (CD71med CD150 high) e P1-hi (CD71high CD150low), correspondendo a UFC-e precoce e tardia, respectivamente; A população 2 (P2 ou BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71low CD150high) contém todos os progenitores BFU-e; A população P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150 low CD41low) é enriquecida para progenitores de basófilos/mastócitos; A população 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) é enriquecida para progenitores megacariocíticos; e a População 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150high CD41-) contém progenitores com eritróides, basófilos/mastócitos e potencial megacariocítico (EBMP) e progenitores multipotenciais (MPPs) eritróides/megacariocíticos/basófilos. Esta nova abordagem permite maior precisão na análise de progenitores eritróides e outros progenitores hematopoiéticos e também permite a referência à informação do transcriptoma para cada população de fluxo citometricamente definida.

Introdução

A eritropoiese pode ser dividida em duas fases principais: eritropoiese precoce e diferenciação terminal eritróide (Figura 1)1,2,3. Na eritropoiese precoce, as células-tronco hematopoiéticas se comprometem com a linhagem eritróide e dão origem a progenitores eritróides precoces, que foram identificados pela primeira vez na década de 1970 com base em seu potencial de formação de colônias em meio semissólido 4,5,6,7,8,9 . Em termos gerais, os progenitores eritróides são divididos em duas categorias: progenitores anteriores que dão origem a uma "explosão" (um grande agregado de aglomerados de células eritróides menores), denominada "unidade formadora de explosão eritróide" ou BFU-e 4,5,6; e sua progênie, que forma um único e pequeno aglomerado ou colônia de células eritróides, denominado "unidade formadora de colônias eritróide" ou UFC-e 7,8,9. BFU-e e UFC-e ainda não expressam genes eritróides terminais e não são morfologicamente reconhecíveis. Após uma série de divisões celulares de auto-renovação ou expansão, a UFC-e sofre uma troca transcricional na qual genes eritróides, como as globinas, são induzidos, fazendo a transição para a diferenciação terminal eritróide (ETD)1,10. Durante a ETD, os eritroblastos sofrem de três a cinco divisões celulares maturacionais antes de se enuclearem para formar reticulócitos, que amadurecem em glóbulos vermelhos.

Os eritroblastos durante a diferenciação terminal foram originalmente classificados com base em sua morfologia em proeritroblastos, basofílicos, policromáticos e ortocromáticos. O advento da citometria de fluxo permitiu sua classificação prospectiva e isolamento com base no tamanho celular (medido por espalhamento para frente, FSC) e dois marcadores de superfície celular, CD71 e Ter119 11,12,13 (Figura 1). Essa e outras abordagens citométricas de fluxo similares 14 revolucionaram a investigação dos aspectos moleculares e celulares da DTE, permitindo a análise específica do estágio de desenvolvimento de eritroblastos in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. A abordagem CD71/Ter119 é agora utilizada rotineiramente na análise de precursores eritróides.

Até recentemente, uma abordagem citométrica de fluxo semelhante e acessível para o isolamento prospectivo direto e de alta pureza da UFC-e e da BFU-e do tecido do rato tem escapado aos investigadores. Em vez disso, os pesquisadores têm utilizado estratégias citométricas de fluxo que isolam apenas uma fração desses progenitores, muitas vezes na presença de células não eritróides que copurificam dentro dos mesmos subconjuntos citométricos de fluxo21. Consequentemente, a investigação de BFU-e e CFU-e limitou-se a sistemas de diferenciação in vitro que derivam e amplificam BFU-e e CFU-e de progenitores anteriores da medula óssea. É possível, então, aplicar estratégias citométricas de fluxo que distinguem a UFC-e da UFC-e nessas culturas enriquecidas com progenitores eritróides22,23. Uma abordagem alternativa faz uso da UFC-e fetal e da UPB-e, que são altamente enriquecidas na fração Ter119-negativa do fígado fetal do rato no meio da gestação 10,24,25. Nenhuma dessas abordagens, no entanto, permite a investigação de BFU-e e UFC-e adultas em seu estado fisiológico in vivo. A magnitude do desafio pode ser apreciada quando se lembra que, com base em ensaios de formação de colônias, essas células estão presentes na medula óssea adulta em uma frequência de apenas 0,025% e 0,3%, respectivamente6.

O protocolo aqui descrito é uma nova abordagem citométrica de fluxo baseada na análise transcriptômica de células da medula óssea de camundongos Kit+ recém-colhidas (o Kit é expresso por todas as populações progenitoras iniciais da medula óssea)1. Nossa abordagem contém alguns marcadores de superfície celular que já estavam em uso por Pronk et al.21,26. Transcriptomas unicelulares foram utilizados para determinar combinações de marcadores de superfície celular que identificam eritróides e outros progenitores hematopoiéticos precoces (Figura 2). Especificamente, a fração CD55+ de células Kit+ de linhagem negativa (Lin-) pode ser subdividida em cinco populações, três das quais produzem segmentos contíguos da trajetória eritróide (Figura 2). As identidades transcriptômicas de cada uma dessas populações foram confirmadas por classificação, seguida de scRNAseq e projeção dos transcriptomas de célula única classificados de volta ao mapa transcriptômico original (a expressão gênica em cada uma das cinco populações e todo o conjunto de dados da medula óssea podem ser explorados em https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . O potencial de destino celular de cada uma das populações foi confirmado usando ensaios tradicionais de formação de colônias (Figura 2), bem como um novo ensaio de destino unicelular de alto rendimento 1,27. Essas análises mostram que a nova abordagem citométrica de fluxo resulta no isolamento de alta pureza de todos os progenitores de BFU-e e UFC-e da medula óssea adulta fresca e do baço. Especificamente, a população 1 (P1) contém apenas UFC-e e nenhum outro progenitor hematopoiético, e a população 2 (P2) contém todos os progenitores BFU-e da medula óssea e um pequeno número de UFC-e, mas nenhum outro progenitor1. O protocolo detalhado abaixo é ainda ilustrado com um experimento de exemplo em camundongos que foram injetados com solução salina ou com o hormônio eritropoiese-estimulante eritropoietina (Epo).

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Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com os protocolos animais A-1586 e 202200017 aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Massachusetts Chan Medical School.

NOTA: Dois protocolos são detalhados aqui: primeiro, análise citométrica de fluxo (seção 1), seguida por ajustes de protocolo para classificação de citometria de fluxo (seção 2). O protocolo abaixo usa um citômetro/classificador de fluxo com 10 canais. Um exemplo de configuração é fornecido na Tabela 1, referida na etapa 1.14.5. Também é possível executar este protocolo com apenas nove canais; veja a legenda na Tabela 2.

1. Análise citométrica de fluxo

  1. Eutanasie camundongos adultos (>6 semanas de idade) Balb/C ou C57BL6 usando um método apropriado aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (por exemplo, inalação de CO2 seguida de luxação cervical). Para a análise citométrica de fluxo, a medula óssea (BM) de um único camundongo será suficiente. Para a classificação, o número de mouses depende das aplicações a jusante. O rendimento celular para cada população é dado a seguir (etapa 2.3.3).
  2. Colheita de tecidos:
    1. Preparar 5 mL de tubos de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) contendo 3 mL de tampão de coloração frio (4 °C) ("SB5": solução salina tamponada com fosfato (PBS), albumina sérica bovina a 0,2% (BSA), glicose a 0,08%, EDTA a 5 mM) sobre gelo. Use isso para colocar tecidos colhidos.
    2. Prepare tubos separados para cada tecido dissecado de cada rato. Não agrupe tecidos de vários camundongos.
    3. Colha ambos os fêmures e ambas as tíbias. Remova todos os músculos dos ossos antes de colocá-los no tubo com SB5.
    4. Dissecar o baço através de uma incisão no lado esquerdo do abdômen.
  3. Extração de células da medula óssea:
    1. Coloque os fêmures e tíbias recém-dissecados diretamente no tampão de coloração a frio (SB5) e mantenha os tubos no gelo até que estejam prontos para extrair a medula óssea (BM). Coloque uma argamassa esterilizada limpa no gelo em um balde. Transfira os ossos para a argamassa juntamente com o SB5 do tubo.
    2. Recorte aproximadamente 1 mm das extremidades de cada osso com uma tesoura de dissecação para que o orifício do osso se torne apenas visível.
    3. Use uma agulha de 26 G e uma seringa de 3 mL cheia de SB5 para liberar a medula dos ossos e coletá-la na argamassa. Repita o processo 3-5 vezes usando buffer fresco de cada vez até que os ossos pareçam incolores.
    4. Filtre a medula lavada através de um filtro de malha de 100μm e colete as células em um tubo de centrífuga de 50 mL colocado no gelo.
    5. Use a argamassa e o pilão para esmagar os ossos lavados em 5-10 mL de SB5. Filtrar a mistura de ossos triturados e tampão através do filtro celular de 100 μm e agrupar com células recolhidas no passo 1.3.4.
  4. Extração de células do baço:
    1. Configure um filtro de malha de 100 μm em um tubo de centrífuga vazio de 50 mL colocado no gelo. Coloque um único baço no filtro de malha.
    2. Adicione 0,5-1 mL de SB5 ao baço para garantir que ele não seque.
    3. Usando o lado de borracha de um êmbolo de seringa de 3 mL ou 5 mL, amasse o baço através da malha. Adicione mais SB5, 5 mL de cada vez, e continue a amassar até que todas as células tenham sido coletadas no tubo.
  5. A partir deste ponto, a medula óssea e as células esplênicas são tratadas da mesma maneira.
  6. Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min. Aspirar o sobrenadante usando uma configuração de aspiração a vácuo.
  7. Para fazer uma suspensão de célula única, ressuspeite as células em 2 mL de SB5 e pipete para cima e para baixo 50 vezes usando um P1000 com uma grande ponta de orifício (ver Tabela de Materiais). Estes têm amplas aberturas de ponta para ajudar a evitar danos às células frágeis.
  8. Para contar as células, ressuspenda pipetando para cima e para baixo 20 vezes. Diluir as células na proporção de 1:100 em SB5. Misture 10 μL das células diluídas com 10 μL de azul de tripano e conte com um hemocitômetro e/ou contador celular.
  9. Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células a 33 x 106 células vivas/ml em SB5.
  10. Preparar o cocktail Lin-FITC misturando volumes iguais de cada anticorpo na Tabela 3.
  11. Prepare as células para controles de cor única e controles de "Fluorescência menos um" (FMO). Realizar as etapas 1.11-1.12 em paralelo com a preparação e coloração das células da amostra na etapa 1.14 (amostras para análise citométrica de fluxo) e/ou na etapa 2.1 (classificação citométrica de fluxo).
    1. Preparar as células para um controlo celular não corado transferindo 50 μL (1,6 x 106 células) da suspensão celular para um tubo FACS no gelo. Prepare as células para cada controle de cor única (11 tubos) transferindo 50 μL (1,6 x 106 células) da suspensão celular para um tubo FACS no gelo.
    2. Prepare os controles FMO para as seguintes cores (Kit, CD41, CD150, CD49f [quatro tubos]) transferindo 300 μL (10 x 106 células) da suspensão celular para um tubo FACS separado no gelo.
    3. Girar as células a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante.
  12. Coloração de anticorpos de FMOs e controles de cor única
    1. Coloração dos FMOs a 33 x 106 células/mL (em um volume total de 300 μL) em tubos FACS. Para cada controle, adicione todos os anticorpos, exceto o anticorpo homônimo do FMO. Por exemplo, para o Kit FMO, deixe de fora o anticorpo do Kit. Para cada anticorpo, utilizar a diluição e a concentração final como indicado no quadro 2.
    2. Coloração dos controles de cor única a 20 x 106 células/mL (em um volume total de 50 μL) em tubos FACS; para cada controlo, adicionar um único anticorpo à concentração indicada no quadro 2.
    3. Vórtice cada tubo de controle por 2-3 s a 3.000 rpm (rotações por minuto) e, em seguida, incubar a 4 °C, balançando por 2,5 h no escuro, protegido da luz. Agite os tubos com um eixo de rotação paralelo ao comprimento do tubo, entre aproximadamente um ângulo de 10° e um ângulo de 60° da horizontal, de modo que o conteúdo não toque na tampa.
    4. Lave as células com SB5: Completar o volume da suspensão celular para 4 ml com SB5. Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 minutos e aspirar o sobrenadante.
  13. Ressuspensão:
    1. Ressuspeite os controles não corados e todos os controles de cor única (exceto o controle DAPI) em 300 μL de SB5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 μm em um novo tubo FACS.
    2. Fazer uma solução de DAPI/SB5 diluindo o estoque de DAPI (1 mg/mL em etanol a 100%) a 1:10.000 em SB5.
    3. Ressuspeite os FMOs em 1,8 mL de DAPI/SB5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 μm em um novo tubo FACS
    4. Ressuscite o controle de cor única DAPI em 300 μL de DAPI/SB5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 μm em um novo tubo FACS de 4 mL.
  14. Preparação da amostra: Se as células estiverem a ser preparadas para a análise citométrica de fluxo, avance para o passo 1.14. Se preparar as células para classificação, avance para o passo 2.1.
  15. Coloração das amostras de análise citométrica de fluxo a 33 x 10 6 células/mL em um volume total de 300 μL (10 x 106 células) em tubos FACS:
    1. Prepare a mistura mestre de anticorpos. Determinar o volume da mistura principal pelo número de amostras, com 300 μL por amostra. Efectuar a mistura principal diluindo todos os anticorpos enumerados na Tabela 2 à diluição indicada em SB5. O Rabbit IgG no master mix serve como um bloco Fc.
    2. Vórtice cada tubo por 2-3 s a 3.000 rpm e, em seguida, incubar a 4 °C, balançando por 2,5 h no escuro, protegido da luz.
    3. Lave as células com SB5: Completar o volume da suspensão celular para 4 ml com SB5. Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 minutos e aspirar o sobrenadante.
    4. Ressuspender as amostras para análise citométrica de fluxo em 1,8 mL de DAPI/SB5, conforme preparado na etapa 1.12.5.2, e filtrar através de uma malha filtrante de 40 μm para um tubo FACS.
    5. Analisar as amostras em um citômetro com 10 canais para acomodar os conjugados de anticorpos na Tabela 2 e o corante de viabilidade DAPI. Um exemplo de configuração de canal é fornecido na Tabela 1. Também é possível usar apenas nove canais; veja a legenda da Tabela 2 .
    6. Durante a análise dos dados de citometria de fluxo, use abordagens de compensação espectral padrão com a ajuda dos controles de cor única e controles FMO, conforme detalhado na etapa 2.4.

2. Ajustes de protocolo para classificação citométrica de fluxo

  1. Preparação de Lin-
    1. Agrupe todas as células extraídas do mesmo tecido (BM ou baço) de 10 camundongos em um tubo de 50 mL. Ressuspenda cada amostra agrupada por pipetagem usando um P1000 com uma grande ponta de orifício.
    2. Girar as células a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante.
    3. Preparar controles de cor única e FMO, conforme descrito na seção 1, usando células não enriquecidas.
    4. Enriqueça células Lin para classificação usando enriquecimento de grânulos magnéticos de células Lin:
    5. Ressuspeite as células em 1 x 108 células/mL com SB5 e transfira-as para um tubo de 15 mL. Adicionar soro normal de rato e os anticorpos biotinilados enumerados no quadro 4 e incubar com balanço a 4 °C durante 1 h.
    6. Girar as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 15 mL de SB5 frio.
    7. Girar as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspeite as células em 1 x 108 células/mL no SB5 frio e mantenha-as no gelo.
    8. Vórtice as nanoesferas magnéticas a 3.000 rpm por 5-10 s. Tome 1 mL de nanoesferas magnéticas para cada 10 mL de células.
    9. Lave as nanoesferas em um tubo FACS de 5 mL. Perfazer o volume até 4 mL com SB5, girar a 900 x g, 4 °C por 5 min e aspirar o sobrenadante.
    10. Ressuspender as nanoesferas em 500 μL de SB5 e misturar com as células preparadas na etapa 2.1.7. Incubar a 4 °C com balanço durante 15 min.
    11. Girar as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 x 108 células/mL com SB5.
    12. Coloque o tubo num íman a 4 °C durante 5 minutos.
    13. Despeje cuidadosamente o sobrenadante em um novo tubo de 15 mL.
    14. Colocar o tubo que contém o sobrenadante da etapa 2.1.13 num íman a 4 °C durante 5 minutos. Despeje cuidadosamente o sobrenadante em um novo tubo de 15 mL.
    15. Girar as células do sobrenadante na etapa 2.1.14 a 900 x g, 4 °C durante 10 minutos e aspirar o sobrenadante.
    16. Ressuspender as células enriquecidas com Lin em 1 mL de SB5.
    17. Diluir 10 μL das células a 1:100 em SB5. Misture 10 μL das células diluídas com 10 μL de azul de tripano e conte com um hemocitômetro e/ou contador celular.
    18. Com base na contagem de células na etapa 2.1.17, ressuspeite as células enriquecidas com Lin em 33 x 106 células/mL.
  2. Coloração de células enriquecidas:
    1. Coloração das amostras de células enriquecidas a 33 x 106 células/mL em tubos FACS adicionando todos os anticorpos listados na Tabela 2. Vórtice cada tubo por 2-3 s a 3.000 rpm e, em seguida, incubar a 4 °C, balançando por 2,5 h no escuro, protegido da luz.
    2. Lave as células com SB5: Completar o volume dos tubos FACS para 4 mL com SB5. Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C por 10 minutos e remova o sobrenadante.
    3. Ressuspender as amostras para análise citométrica de fluxo em 4-6 mL de DAPI/SB5 conforme preparado na etapa 1.12.5.2 e filtrar através de uma malha filtrante de 40 μm em um novo tubo FACS de 4 mL.
  3. Classificação de amostras:
    1. Separe as amostras com um bocal grande e baixa pressão para maximizar o rendimento de UFC-e, uma vez que as células de UFC-e são facilmente danificadas sob alta pressão. Para o citômetro de fluxo utilizado neste estudo, utilizar 14 psi e um bocal de 100 μm ou 12 psi com bico de 130 μm. Configure as portas de classificação conforme descrito na etapa 2.4 abaixo.
    2. Prepare o tampão de coleta: Adicione 20% de soro fetal bovino ao PBS.
    3. Para verificar as purezas das populações classificadas, execute novamente uma pequena alíquota de cada população classificada em um buffer que contenha DAPI, conforme descrito na etapa 1.12.5.2.
      NOTA: Normalmente, o BM de um total de 10 camundongos (aproximadamente 1 x 109 células) produz pelo menos 50.000-100.000 células para cada uma das populações P1-hi, P1-low e P2 com uma viabilidade de aproximadamente 70%.
  4. Use a estratégia de bloqueio mostrada na Figura 3 para análise ou configuração das portas de classificação.
    1. Use o parâmetro FSC (forward-scatter) para remover os detritos com base no tamanho. Use o histograma FSC-height versus FSC-area para excluir agregados de células e selecionar células únicas; repetir com o histograma de altura de dispersão lateral (SSC) versus área de SSC.
    2. Exclua as células mortas eliminando as células que são positivas para o corante de DNA DAPI, ao qual as células viáveis são impermeáveis.
    3. Selecione células Lin-Ter119-Kit+ e, a partir delas, selecione uma subpopulação que expresse CD55.
    4. Subdivida as células Lin-Ter119-Kit+CD55+ em duas populações principais, P6 e P7, com base na expressão de CD49f e CD105.
    5. Com base na expressão de CD150 e CD41, subdivida P6 ainda mais em P3 (progenitores basófilos ou mastócitos), P4 (progenitores megacariocíticos) e P5 (EBMP e MPP com viés eritróide).
    6. Com base na expressão de CD150 e CD71, subdivida P7 ainda mais em P2 (BFU-e), UFC-e precoce (P1-baixo) e UFC-e tardia (P1-hi).

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Resultados

O protocolo descreve uma abordagem citométrica de fluxo para identificar BFU-es e UFC-es em células recém-colhidas da medula óssea e do baço. Começa com a colheita de BM fresco e baço de ratos e imediatamente colocando o tecido no gelo. Todos os procedimentos são realizados a frio para preservar a viabilidade celular. As células são marcadas com um coquetel de anticorpos de "linhagem" que permite a exclusão de todas as células que expressam marcadores de linhagens sanguíneas diferenciadas (o coquetel FITC-Lin, Tabela

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Discussão

A capacidade de isolar prospectivamente progenitores BFU-e e CFU-e diretamente de tecido fresco com alta pureza já havia escapado aos pesquisadores. Nossa nova abordagem, validada usando scRNAseq e ensaios de destino celular 1,27, agora oferece as ferramentas para fazer isso.

Há uma série de pontos-chave para executar com sucesso os protocolos de classificação e analíticos. Primeiro, as células precisam ser giradas a 900 x g p...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pelos subsídios do NIH R01DK130498, R01DK120639 e R01HL141402

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 M EDTA, pH 8,0Life Technologies15575020
1000 µ L pontas de orifício grandeEUA sceintific1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) AnticorpoBioLegend131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) AnticorpoBioLegend105826
Biotina-CD11bBD Biosciences557395M1/70 (clone)
Biotina-CD19BD Biosciences5537841D3 (clone)
Biotina-CD4BD BiosciencesBDB553045RM4-5 (clone)
Biotina-CD8aBD BiosciencesBDB55302953-6.7 (clone)
Biotina-F4/80Biolegend123106BM8 (clone)
Biotina-Ly-6G e Ly-6CBD Biosciences553125RB6-8C5 (clone)
Biotina-TER-119BD Biosciences553672TER-119 (clone)
Albumina de soro bovinoSigma aldritchA1470
Violeta brilhante 421 anti-humano / camundongo CD49f AnticorpoBioLegend313624
Violeta brilhante 605 anti-camundongo CD41BioLegend133921
Violeta brilhante 650 anti-camundongo CD150 (SLAM) AnticorpoBioLegend115931
BUV395 Rato anti-rato TER-119 / eritróide CélulasBD Biosciences563827
ChromPure Rabbit IgG, molécula inteiraJackson ImmunoResearch Laboratories011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)Life TechnologiesD1306
Digital DIVA hardware e software para LSR IIBD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 AnticorpoBioLegend123108
FITC Rat Anti-CD11bBD Biosciences557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19BD Biosciences553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G e LY-6CBD Biosciences
software FlowJoanálise de citômetro de fluxoda versão 10FlowJo
de citômetro de fluxo digital multiparâmetroBD BiosciencesCitômetro de fluxo 
NewlineNY Aço Inoxidável Hand Masher & Conjunto de Tigela, Almofariz e PilãoAmazon
Normal soro de ratoStem Cell Technologies13551
PE anti-camundongo CD105 AnticorpoBioLegend120408
PE/Cyanine7 anti-camundongo CD71 AnticorpoBioLegend113812
Solução salina tamponada com fosfatoFisher scientificBP3994
NanoesferasBioLegend480016Contas magnéticas
553127Software de LSR II da analisador

Referências

  1. Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
  2. Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
  3. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2021).
  4. Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).
  5. Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
  6. Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
  7. Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
  8. Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
  9. Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
  10. Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484(2010).
  11. Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809(2011).
  12. Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
  13. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  14. Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
  15. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2020).
  16. Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334(2021).
  17. Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383(2012).
  18. Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
  19. Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
  20. Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192(2011).
  21. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  22. Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
  23. Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
  24. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  25. Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
  26. Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
  27. Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
  28. Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
  29. Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).

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