Geração de biblioteca de exibição de peptídeos AAV e posterior validação através do código de barras de candidatos com novas propriedades para a criação de AAVs de próxima geração.
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Artigo de método
Isolamento de vetores de terapia gênica de próxima geração por meio de engenharia, código de barras e triagem de variantes do capsídeo do vírus adenoassociado (AAV)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os vetores de liberação gênica derivados do vírus adenoassociado (AAV) são uma das ferramentas mais promissoras para o tratamento de doenças genéticas, evidenciada por dados clínicos encorajadores e pela aprovação de várias terapias gênicas com AAV. Duas razões principais para o sucesso dos vetores AAV são (i) o isolamento prévio de vários sorotipos virais naturais com propriedades distintas, e (ii) o subsequente estabelecimento de tecnologias poderosas para sua engenharia molecular e reaproveitamento em alto rendimento. Aumentando ainda mais o potencial dessas técnicas são recentemente implementadas estratégias para a codificação de barras-capsídeos AAV selecionados no nível de DNA e RNA, permitindo sua estratificação in vivo abrangente e paralela em todos os principais órgãos e tipos celulares em um único animal. Aqui, apresentamos um pipeline básico que engloba esse conjunto de vias complementares, usando a exibição de peptídeos AAV para representar o arsenal diversificado de tecnologias de engenharia de capsídeos disponíveis. Assim, primeiro descrevemos as etapas fundamentais para a geração de uma biblioteca de exibição de peptídeos AAV para a seleção in vivo de candidatos com propriedades desejadas, seguido por uma demonstração de como codificar as variantes de capsídeos mais interessantes para triagem secundária in vivo. Em seguida, exemplificamos a metodologia para a criação de bibliotecas para sequenciamento de próxima geração (NGS), incluindo amplificação de código de barras e ligadura de adaptador, antes de concluir com uma visão geral das etapas mais críticas durante a análise de dados NGS. Como os protocolos relatados aqui são versáteis e adaptáveis, os pesquisadores podem facilmente aproveitá-los para enriquecer as variantes ideais do capsídeo AAV em seu modelo de doença favorito e para aplicações de terapia gênica.
Introdução
A terapia de transferência gênica é a introdução de material genético nas células para reparar, substituir ou alterar o material genético celular para prevenir, tratar, curar ou melhorar doenças. A transferência de genes, tanto in vivo quanto ex vivo, depende de diferentes sistemas de entrega, não virais e virais. Os vírus evoluíram naturalmente para transduzir eficientemente suas células-alvo e podem ser usados como vetores de entrega. Dentre os diferentes tipos de vetores virais empregados na terapia gênica, os vírus adenoassociados têm sido cada vez mais utilizados, devido à sua falta de patogenicidade, segurança, baixa imunogenicidade e, principa....
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Protocolo
1. AAV2 aleatório 7-mer peptídeo display biblioteca preparação
NOTA: Para a preparação de uma biblioteca de exibição de peptídeos aleatórios AAV2, sintetize os oligonucleotídeos degenerados como DNA de fita simples, converta-o em DNA de fita dupla, digerir, ligar-se ao plasmídeo aceitador e eletroporato.
- Projeto de oligonucleotídeos degenerados
- Ordene os oligonucleotídeos degenerados e evite o viés do códon. No oligonucleotídeo 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3', X01 corresponde a 20 códons, cada um codificando um dos 20 aminoácidos. O W pode ser A ou T, produzindo os códons AGA....
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Resultados
Geração de uma biblioteca de exibição de peptídeos AAV2. Como um primeiro passo para a seleção de AAVs projetados, a geração de uma biblioteca de plasmídeos é descrita. A inserção peptídica é produzida usando primers degenerados. Reduzir a combinação de códons naqueles de 64 para 20 tem as vantagens de eliminar os códons de parada e facilitar a análise de NGS, reduzindo a diversidade de bibliotecas no DNA, mas não o nível de proteínas. A inserção do oligonucleotídeo é adquirida como DNA de fita simples .......
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Discussão
Neste protocolo, são descritas as etapas necessárias para a engenharia do capsídeo AAV de exibição de peptídeos e para a triagem de bibliotecas de AAV com código de barras, bem como para a análise bioinformática da composição da biblioteca e do desempenho do capsídeo. Este protocolo se concentra nas etapas que facilitam a análise bioinformática desses tipos de bibliotecas, porque a maioria dos laboratórios de virologia tem atraso em habilidades de programação para corresponder à sua proficiência em técnicas de biologia m.......
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Divulgações
D.G. é co-fundador da AaviGen GmbH. D.G. e K.R. são inventores de um pedido de patente pendente relacionado à geração de variantes do capsídeo AAV que evade a imunidade. Os demais autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
D.G. agradece muito o apoio da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) através dos Centros de Pesquisa Colaborativa DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) e TRR179 (Projektnummer 272983813), bem como do Centro Alemão de Pesquisa de Infecção (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Primer de amplificação | ELLA Biotech (Munique, Alemanha) | - | Síntese de segunda fita de inserção de oligonucleotídeos |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EUA) | 5067-1504 | Validação de fragmentos de DNA |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EUA) | DNA | G2938C |
| AllPrep DNA / RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Holanda) | 80204 | Extração de DNA/RNA |
| Reagentes Agilent DNA 1000 | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EUA) | 5067-1504 | Preparação da biblioteca NGS |
| Sistema de bioanalisador Agilent 2100 Agilent | Technologies (Santa Clara, CA, EUA) | G2938C | Preparação da biblioteca NGS |
| BC-SEQ FW: | IDT (San Joce, CA, CA, EUA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | Preparação da Biblioteca NGS |
| BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, EUA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | Preparação da Biblioteca NGS |
| β-Mercaptoetanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, EUA) | 44-420-3250ML | Extração de DNA/RNA |
| BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, EUA) | R0143 | Digestão de inserto de fita dupla |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, EUA) | 1851196 | ciclador dd-PCR |
| dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, EUA) | N0447S | Preparação da biblioteca NGS |
| ddPCR Supermix para sondas (sem dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, EUA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
| Óleo de geração de gotículas para sondas | Bio-Rad (Hercules, CA, EUA) | 1863005 | óleo de geração de gotículas dd-PCR |
| Cartuchos DG8 para gerador de gotículas QX100 / QX200 | Bio-Rad (Hercules, CA, EUA) | 1864008 | Cartucho de geração de gotículas dd-PCR |
| DG8 Suporte de cartucho | Bio-Rad (Hércules, CA, EUA) | 1863051 | suporte de cartucho dd-PCR |
| Gerador de gotículas DG8 Junta | Bio-Rad (Hércules, CA, EUA) | 1863009 | tampa dd-PCR para cartucho |
| de placas ddPCR de 96 poços, semi-contornada | Bio-Rad (Hércules, CA, EUA) | 12001925 | placa dd-PCR de 96 poços |
| E.cloni 10G SUPREME Eletrocompetente Células | Lucigen (Middleton, WI, EUA) | 60081-1 | Células eletrocompetentes |
| Cuvetes de eletroporação, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Alemanha) | 748050 | GAPDH de eletroporação |
| Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EUA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer | |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, EUA) | 1652660 | Kit |
| transcrição reversa de cDNA de alta capacidade | Applied Biosystems (Waltham, MA, EUA) | 4368814 | ITR_fw de transcrição reversa de cDNA |
| IDT (San Joce, CA, EUA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR | |
| primer ITR_rv | IDT (San Joce, CA, EUA) | Primer CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR |
| ITR_probe | IDT (San Joce, CA, EUA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR |
| sonda Illumina NextSeq 500 sistema | Illumina Inc (San Diego, CA, EUA) | SY-415-1001 | NGS Library sequenciamento |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Suíça) | KK2600 07958919001 | Preparação de amostras NGS |
| MagnaBot 96 Dispositivo de Separação Magnética | Promega GmbH (Madison, WI, EUA) | V8151 | Preparação de amostras para biblioteca NGS |
| Espectrofotômetro NanoDrop 2000 | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EUA) | ND-2000 | Digestão de inserto de fita dupla |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, EUA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC | TC NGS primer |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, EUA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT | C NGS primer |
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 ciclos) | Illumina Inc (San Diego, CA, EUA) | FC-404-2005 | Sequenciamento de biblioteca NGS |
| Sistema de Biblioteca Ovation para Kit de Amostras de Baixa Complexidade | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, EUA) | 9092-256 | NGS Preparação da biblioteca |
| PX1 Seladora de Placas | Bio-Rad (Hercules, CA, EUA) | 1814000 | seladora de placas dd-PCR |
| Folha Perfurável Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, EUA) | 1814040 | folha de vedação dd-PCR |
| Phusion DNA-Polimerase de alta fidelidade | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EUA) | F530S | Síntese de segunda fita de inserção de oligonucleotídeos |
| PEI MAX - Cloridrato de polietilenomina linear de grau de transfecção (MW 40.000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, EUA) | 24765-1G | Preparação da biblioteca AAV |
| Sistema de Purificação Seletiva de Tamanho | ProNex Promega GmbH (Madison, WI, EUA) | NG2002 | Preparação de amostras para biblioteca NGS |
| Phusion Hot Start II Polimerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EUA) | F549L | NGS Preparação da biblioteca |
| Proteinase K | Roche AG (Basel, Suíça) | 5963117103 | extração de DNA/RNA |
| pRep2Cap2_PIS | vetor ITR-Rep2Cap2-ITR. Local de inserção do peptídeo dentro do Cap2 ORF, fabricado/preparado no laboratório | ||
| Gerador de gotículas QX200 | Bio-Rad (Hércules, CA, EUA) | 1864002 | gerador de gotículas dd-PCR |
| Leitor de gotículas QX200 | Bio-Rad (Hércules, CA, EUA) | 1864003 | análise de gotículas dd-PCR |
| Kit de remoção de nucleotídeos QIAquick | Qiagen (Venlo, Holanda) | 28306 | Síntese de segunda fita de purificação de inserção de oligonucleotídeos |
| Kit de extração de gel QIAquick | Qiagen (Venlo, Holanda) | 28704 | Purificação de vetores de plasmídeo |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Holanda) | 12162 | Preparação de DNA da biblioteca de plasmídeos |
| Qiaquick PCR Kit de purificação | Qiagen (Venlo, Holanda) | 28104 | Preparação de amostra para biblioteca NGS |
| Fluorômetro Qubit | Invitrogen (Waltham, MA, EUA) | Q32857 | Preparação da biblioteca NGS |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EUA) | Q32851 | Preparação da biblioteca NGS |
| QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Holanda | )1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (San Joce, CA, EUA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR |
| primer rep_rv | IDT (San Joce, CA, EUA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR |
| primer rep_probe | IDT (San Joce, CA, EUA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | sonda dd-PCR |
| DNase livre de RNase | Qiagen (Venlo, Holanda) | 79254 | Extração de DNA/RNA |
| SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, EUA) | R0123 | Digestão do vetor |
| 5 mm, aço Grânulos | Qiagen (Venlo, Holanda) | 69989 | Extração de DNA/RNA |
| TRIMER-oligonucleotídeos | ELLA Biotech (Munique, Alemanha) | - | Oligonucleotídeo degenerado |
| T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, EUA) | M0202L | Ligação da biblioteca de plasmídeos |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Holanda) | 85600 | Extração de DNA/RNA |
| YFP_fw | IDT (San Joce, CA, EUA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR |
| primer YFP_rv | IDT (San Joce, CA, EUA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR |
| primer YFP_probe | IDT (San Joce, CA, EUA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | sonda dd-PCR |
| Zymo DNA Clean & Concentrador-5 (Tampado) | Pesquisa Zymo (Irvine, CA, EUA) | D4013 | Purificação de vetores e ligaduras |
Referências
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene ....
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Reimpressões e permissões
